JPWO2013031797A1 - Maldi質量分析法 - Google Patents
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Abstract
Description
また、スイートスポットを探し出し、そこにレーザー照射を行ったとしても、スイートスポットの位置は測定対象分子によって異なるため、従来の調製方法で調製した測定試料では、複数の測定対象分子を定量的に測定することは難しかった。例えば、複数の測定対象分子の試料中でのそれぞれの含有比率を正確に取得することは難しかった。
そこで、更に、糖タンパク質や糖ペプチドの糖鎖構造解析の際には、糖鎖を一旦ペプチドから切り離して、遊離糖鎖を精製して質量分析する方法が一般的であり、感度が低いため多量の試料が必要であること、作業に時間を要することや、試料が消費される等の問題点があった。
それによって、測定対象分子を含む試料が極めて微量であっても、信頼性の高い化学構造についての情報を得ることができる質量分析法を提供することにある。
[1]複数の測定対象分子を含む試料のMALDI質量分析法であって、
該複数の測定対象分子は、糖の混合物、又は糖ぺプチドの混合物、又は糖ぺプチドとペプチドの混合物、又は糖タンパク質の混合物、又は糖タンパク質とタンパク質の混合物であり、
測定試料全体を測定し積算平均化することなく、シグナルが出る測定試料の任意の点から、該複数の測定対象分子についての定量的なマススペクトルを得ることを特徴とするMALDI質量分析法である。
バイオロジクスにも適用することができるので、各グリコフォームの存在比が明らかになり、薬理活性や有害作用の予測や品質管理にも応用できる。
本発明のMALDI質量分析法が適用される測定対象分子は特に限定はないが、生体由来の分子又は生体試料中の分子であることが好ましく、具体的には、糖、糖ペプチド、ペプチド、糖タンパク質又はタンパク質であり、特に好ましくは、糖、糖ペプチド又は糖タンパク質である。
本発明において「糖」と記載するときは、主として糖鎖(オリゴ糖、多糖)をいうが、単糖も含めた糖類全般をいうものとする。また、糖タンパク質や糖脂質由来の「糖」も含む。
また、試料は、例えば、生体の組織、細胞、体液や分泌物(例えば、血液、血清、尿、精液、唾液、涙液、汗、糞便等)等から得られたものであってもよい。
試料をプレート上に載せ、酵素処理等を行なって、測定対象分子を調製してもよい。
(a)上記複数の測定対象分子が、糖ぺプチドの混合物であって、そのペプチド部分は同一であるか、又は、
(b)上記複数の測定対象分子が、糖ぺプチドとペプチドの混合物であって、糖ペプチドのペプチド部分は同一で、かつ糖ペプチドのペプチド部分と該ペプチドは同一である、ことが、
試料支持部材上に調製した測定試料である「試料とマトリックスとの混合結晶又は混合物」中で、複数の測定対象分子についてシグナルが出る点が共通になるため、該測定試料の任意のシグナルが出る点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることができる点で好ましい。すなわち、測定試料上のある1点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子の試料中でのそれぞれの含有比率を、正確に取得・把握できる点で好ましい。
(c)上記複数の測定対象分子が糖の混合物であり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製することが、
試料支持部材上に調製した測定試料である「試料とマトリックスとの混合結晶又は混合物」中で、複数の測定対象分子についてシグナルが出る点が共通になるため、該シグナルが出る点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることができる点で好ましい。すなわち、測定試料上のある1点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子の試料中でのそれぞれの含有比率を、正確に取得・把握できる点で好ましい。
(bc)上記複数の測定対象分子が、糖ぺプチドとペプチドの混合物であって、糖ペプチドのペプチド部分は同一で、かつ糖ペプチドのペプチド部分と該ペプチドは同一であり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する、ことが、
試料支持部材上に調製した測定試料である「試料とマトリックスとの混合結晶又は混合物」中で、複数の測定対象分子についてシグナルが出る点が共通になるため、該シグナルが出る点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることができる点で好ましい。すなわち、測定試料上のある1点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子の試料中でのそれぞれの含有比率を、正確に取得・把握できる点で好ましい。
(c’)上記複数の測定対象分子が糖ぺプチドの混合物であって、その糖ペプチドは糖及び/又はペプチドがそれぞれ異なってもよいものであり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する、ことが、
試料支持部材上に調製した測定試料である「試料とマトリックスとの混合結晶又は混合物」中で、複数の測定対象分子についてシグナルが出る点が共通になるため、該シグナルが出る点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることができる点で好ましい。すなわち、測定試料上のある1点にレーザーを照射すれば、複数の測定対象分子の試料中でのそれぞれの含有比率を、正確に取得・把握できる点で好ましい。
しかしながら、糖ペプチド(糖タンパク質)の糖鎖部分の化学構造を知りたい場合には、通常はペプチド部分(タンパク質部分)を外してから測定試料を調製するか、又は、外さずに測定試料全体を測定し積算平均化していた(多点測定の積算が行われていた)ため、有効な方法ではなかった。
しかしながら、特定の誘導体化剤で測定対象分子を標識した場合には、ペプチド部分(タンパク質部分)は除いても除かなくても、複数の測定対象分子について、スイートスポットを含む「シグナルが出る点」が共通になり、その結果として前記した顕著な効果が得られることを見いだして、本願発明はなされたものである。
本発明のMALDI質量分析法においては、測定試料全体を測定し積算平均化することなく、スイートスポットでなくても、測定試料のシグナルが出る任意の点から、複数の測定対象分子について定量的なマススペクトルを得ることを特徴とする。
本発明の極めて限定された「複数の測定対象分子」を含む測定試料においては、測定試料上のシグナルが出る点にレーザー照射すれば、その点が該「複数の測定対象分子」で共通するので、複数の測定対象分子を含有する試料中でのそれぞれの含有比率を正確に取得・把握できる。
「スイートスポット」とは、そこにレーザーを照射したとき、測定対象分子由来のイオンが特に感度良く得られる場所のことをいう。
シグナルが出る任意の1点に対するレーザーショット数は限定されないが、5〜20ショットが好ましい。
本発明では、まず、MALDI質量分析法における測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶を析出させる。該混合結晶を析出させる方法は特に限定はないが、例えば、好ましい方法として、以下の(1)〜(3)が挙げられる。
(1)試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に、乾燥後又は乾燥する前にマトリックスの溶液を載置し、次いで、該溶液を乾燥させて、該混合結晶を析出させる方法。
(2)試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、次いで、該溶液を乾燥させて、該混合結晶を析出させる方法。
(3)試料支持部材上に該マトリックスの溶液を載置し、次いで該溶液を乾燥させ該マトリックスの結晶を析出させた後、同一又は異なる化学構造を有するマトリックスと測定対象分子を含む溶液を重層し、次いで該溶液を乾燥させて混合物を生成させる方法。
(1)試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に、乾燥後又は乾燥する前にマトリックスの溶液を載置し、次いで、該混合溶液の溶媒を揮発させて、該混合物を生成させる方法。
(2)試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、次いで、該混合溶液の溶媒を揮発させて、該混合物を生成させる方法。
(1)試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後にマトリックスの溶液を載置し、又は、
(2)試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、
次いで、該溶液を乾燥させて、該混合結晶を析出させる方法
である。
上記(1)法は、本発明において特に好適な方法であり、測定対象分子を含む試料を先に試料支持部材上に存在させ、次いで、マトリックスの溶液(好ましくは実質的にマトリックスのみの溶液)を、該試料に重層し、試料を溶解させながら、試料支持部材(以下、「プレート」と略記することがある)上で乾燥させて、結晶を析出させる測定試料の調製方法である。
(A)測定対象分子を含む試料の溶液をプレート上で乾燥する工程と、その後に、
(B)マトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を、上記プレートに滴下する工程
(1)法において測定試料の誘導体化を行う場合は、上記工程(A)と工程(B)の間に、
(C)測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤の溶液を、上記プレートに滴下して乾燥する工程
を含むことが、イオン化効率を更に高めるために好ましい。
ここで「ピレン環化合物」とは、ピレン環と、「測定対象分子」に結合することが可能である反応性官能基と、要すれば該ピレン環と該反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物をいう。
また、好ましい組み合わせとしては、測定対象分子が、カルボキシル基、アミノ基又はメルカプト基を有する糖ペプチド若しくはペプチド、又は、かかる基を有する糖タンパク質若しくはタンパク質であり、誘導体化剤が、アミノ基、ヒドラジド基又はジアゾメチル基等を有するものである場合が挙げられ、更に、測定対象分子が、カルボキシル基を有する糖ペプチド若しくはペプチド、又は、かかる基を有する糖タンパク質若しくはタンパク質であり、誘導体化剤がヨウ化メチル又はトリメチルシリルジアゾメタンである場合が挙げられる。
これらの組み合わせは、測定対象分子及び誘導体化剤を、容易にプレート上で反応させることができる点、イオン化を阻害しない点、反応が選択的である点、一般に微量での分析の必要性が高いので、前記効果を奏し易い点等から好ましい。
(2)試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて、試料支持部材上に該混合結晶を析出させる方法も好ましい。かかる(2)の測定試料の調製方法は、「Dried Droplet法」として知られているものである。(1)の調製方法で、試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に、乾燥する前にマトリックスの溶液を載置する方法も同様である。
マトリックスはレーザーの光エネルギーを吸収して、共存する分析対象分子の脱離及びイオン化を達成する物質であれば液体及び固体を問わず種類は限定されないが、例えば、以下のものが挙げられる。
acid)、ジトラノール(Dithranol)、2−(4−ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸(2-(4-Hydroxyphenylazo) benzoic acid)(HABA)、trans−2−[3−(4−tert−ブチルフェニル)−2−メチル−2−プロペニリデン]マロンニトリル(trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malononitrile)(DCTB)、trans−4−フェニル−3−ブテン−2−オン(trans-4-Phenyl-3-buten-2-one)(TPBO)、trans−3−インドールアクリル酸(trans-3-Indoleacrylic acid)(IAA)、1,10−フェナントロリン(1,10-Phenanthroline)、5−ニトロ−1,10−フェナントロリン(5-Nitro-1,10-phenanthroline)、α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)(CHCA)、シナピン酸(Sinapic acid)(SA)、2,4,6−トリヒドロキシアセトフェノン(2,4,6-Trihydroxyacetophenone)(THAP)、3−ヒドロキシピコリン酸(3-Hydroxypicolinic acid)(HPA)、アントラニル酸(Anthranilic
acid)、ニコチン酸(Nicotinic acid)、3−アミノキノリン(3-Aminoquinoline)、2−ヒドロキシ−5−メトキシ安息香酸(2-Hydroxy-5-methoxybenzoic
acid)、2,5−ジメトキシ安息香酸(2,5-Dimethoxybenzoic acid)、4,7−フェナントロリン(4,7-Phenanthroline)、p−クマル酸(p-Coumaric acid)、1−イソキノリノール(1-Isoquinolinol)、2−ピコリン酸(2-Picolinic acid)、1−ピレンブタン酸ヒドラジド(1-Pyrenebutanoic acid, hydrazide)(PBH)、1−ピレンブタン酸(1-Pyrenebutyric acid)(PBA)、1−ピレンメチルアミンハイドロクロライド(1-Pyrenemethylamine hydrochloride)(PMA)、3−AC(アミノキノリン)−CHCA(3-AC(aminoquinoline)-CHCA)。
マトリックス溶液の乾燥方法は特に限定されないが、加温する、冷却する、風を送る、減圧する等によって乾燥を促進することが効果的な場合がある。
イオン化に用いられるレーザーとしては、窒素レーザー(337nm)、YAGレーザー3倍波(355nm)、NdYAGレーザー(256nm)、炭酸ガスレーザー(2940nm)等が挙げられるが、窒素レーザーが好ましい。イオンの分離検出方法は特に限定はなく、二重収束法、四重極集束法(四重極(Q)フィルター法)、タンデム型四重極(QQ)法、イオントラップ法、飛行時間(TOF)法等を用いて、イオン化した分子を質量/電荷比(m/z)に従って分離し検出する。好ましくは、QIT−TOFである。
<A2/A2F混合物、PDAM標識(誘導体化)、測定点によってスペクトルが一定>
まず、質量分析用プレート(試料支持部材)に、測定対象分子である中性糖鎖A2及びA2F(それぞれの化学構造を図9に示す)を水に溶解して、それぞれ100fmol/μLにした水溶液を1μL滴下し、室温(23℃)、大気圧下で放置し乾燥させた。
また、測定試料の全域に対して、レーザーパワーを測定対象分子のイオンのシグナルが出始める閾値に最適化した後、50μm間隔でレーザー照射を行い、自動測定した。
自動測定は、1点あたり10ショットのレーザーを照射し、1つの測定試料につき2209点を測定し、積算平均化したスペクトルを取得した。
<A2/A2F混合物、標識(誘導体化)無し、測定点によってシグナルパターンが異なる>
まず、質量分析用プレート(試料支持部材)に、測定対象分子である糖鎖A2及びA2F(化学構造を図9に示す)を水に溶解して、それぞれ2pmol/μL及び1pmol/μLにした水溶液を1μL滴下し、室温(23℃)、大気圧下で放置し乾燥させた。
<NA2/NA2F混合物、2AB標識(誘導体化)、測定点によってシグナルパターンが異なる>
まず、質量分析用プレート(試料支持部材)に、測定対象分子である糖鎖NA2及びNA2F(化学構造を図9に示す)の2−アミノベンズアミド(以下、「2AB」と略記する)の誘導体を水に溶解して、それぞれ100fmol/μLにした水溶液を1μL滴下し、室温(23℃)、大気圧下で放置し乾燥させた。
以下、2ABで標識(誘導体化)したものを、「2AB−NA2」、「2AB−NA2F」等と表記する。
実施例1の「Point 1〜3」のマススペクトルを比較すると、2つの測定対象分子のシグナルの相対強度は、レーザーを照射した場所によらず一定で、同一の測定試料内でばらつきがなく、各点それぞれのスペクトルは、測定試料の全体を自動測定し積算平均化したスペクトルと一致していた。
従って、測定対象試料の全体を1時間以上かけて20000回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、一部分だけを10分程度の短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。
<RNaseB糖ペプチド、標識(誘導体化)無し>
<ペプチドが付加することによって、糖鎖構造が不均一でもスペクトルのシグナルパターンが同一になることの実施例>
まず、20μgのRNaseB(Sigma−Aldrich社製)に、RapiGest SF(waters社製)を最終濃度が0.1%となるように加え、100℃で5分間加熱した。冷却後、10mmol/L重炭酸アンモニウムと10mmol/Lジチオトレイトールを含む水溶液に溶解し、55℃で45分間インキュベートした。
反応後、135mmol/Lのヨードアセトアミドを5μL加え、暗所で45分間静置した。次に、1μgのLys−Cを加え、37℃で一晩反応させた。
「SRNSTK」は、1文字アミノ酸の配列で表わしたペプチドを示す。
実施例2の図4(a)〜(c)のマススペクトルを比較すると、3つのスペクトルのシグナル強度比が場所によらず一定であることが分かる。更に、Man5〜7−SRNSTKのシグナル分布は一致していた。
従って、測定対象試料の全体を1時間以上かけて20000回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、より強いシグナルが出る点を時間をかけて探さなくても、シグナルが出る一部分だけを10分程度の短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。
<IRNKS/GlcNAc−IRNKS/NA2−IRNKS、標識(誘導体化)無し>
まず、質量分析用プレート(試料支持部材)に、測定対象分子である、ペプチドIRNKSを1pmol/μL、糖ペプチドGlcNAc−IRNKSを500fmol/μL、及び、NA2−IRNKS(化学構造を図9に示す)500fmol/μLを水に溶解した水溶液を1μL滴下し、室温(23℃)、大気圧下で放置し乾燥させた。
「IRNKS」は、1文字アミノ酸の配列で表わしたペプチドを示す。
実施例3の図5を比較すると、3つの測定対象分子のシグナル分布は一致していた。
このことは、糖ペプチドのペプチド部分が共通であれば、糖鎖部分の有無や化学構造が異なっていても、それぞれのシグナル分布は共通であることを示している。
従って、測定対象試料の全体を1時間以上かけて20000回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、一部分だけを10分程度の短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。
<IRNKS/GlcNAc−IRNKS/NA2−IRNKS、PDAM標識(誘導体化)有り>
<ペプチドが同一で、更にピレン標識されると、測定点によってシグナルパターンがより均一になる>
まず、質量分析用プレート(試料支持部材)に、測定対象分子であるペプチドIRNKSを1pmol/μLと、糖ペプチドGlcNAc−IRNKS及びNA2−IRNKS(化学構造を図9に示す)をそれぞれ500fmol/μLを水に溶解した水溶液を1μL滴下し、室温(23℃)、大気圧下で放置し乾燥させた。
「GlcNAc」は、N−アセチルグルコサミンを示す。
余剰の誘導体化剤を除くため、キシレン(SIGMA社製)に浸し余剰のPDAMを除去し十分に乾燥させた。
実施例4の図6を比較すると、3つの測定対象分子のシグナルが出る点の分布は一致しており、実施例3の分布状態よりも更に均一になっていた。
従って、測定対象試料の全体を1時間以上かけて20000回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、一部分だけを10分程度の短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。
<IgG1+IgG2混合物、標識(誘導体化)無し>
<IgG1又はIgG2のグリコフォームを調べることが可能>
まず、20μgの免疫グロブリンG(IgG、主にサブクラスIgG1及びIgG2が含まれる)(和光純薬工業製)に、RapiGest SF(waters社製)を最終濃度が0.1%となるように加え、100℃で5分間加熱した。
冷却後、10mmol/L重炭酸アンモニウムと10mmol/Lジチオトレイトールを含む水溶液に溶解し、55℃で45分間インキュベートした。
反応後、135mmol/Lのヨードアセトアミドを5μL加え、暗所で45分間静置した。反応後の溶液に1μgのトリプシンを加え、37℃で一晩反応させた。
「IgG1」、「IgG2」は、それぞれ、免疫グロブリンGのサブクラスであり、上記の操作により、IgG試薬から得られた測定対象分子の糖ペプチドを示す。
得られた試料を水に溶解し、質量分析用プレート(試料支持部材)に1μL滴下し、室温(23℃)、大気圧下で放置し乾燥させた。
<実施例5と同じ「IgG1+IgG2混合物」、誘導体化無し>
<ペプチドの異なるIgG1とIgG2はMALDIイメージ偏在分離・不均一>
実施例5において、ペプチド部分が異なり、糖鎖部分が共通の測定対象分子とする以外は、実施例5と同様の実験を行った。
実施例5の図7(b)のマススペクトルには、6種類の糖ペプチド(IgG1及びIgG2のそれぞれG0F、G1F、G2F))が検出されている。そのうちのIgG2の糖ペプチドG0F、G1F、G2Fは、糖鎖の化学構造が異なるがペプチド部分はEEQFNSTFRで共通である。また、IgG1の糖ペプチドG0F、G1F、G2Fは、糖鎖の化学構造が異なるがペプチド部分はEEQYNSTYRで共通である。
従って、測定対象試料の全体を1時間以上かけて20000回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、一部分だけを10分程度の短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。
従って、糖鎖が同一であっても、ペプチドが異なれば検出される位置も異なり、測定対象試料の一部分だけを測定して、ペプチド部分の異なる糖ペプチド同士のシグナル強度を比較することはできないことが分かった。
<IgG1+IgG2混合物、誘導体化有り>
<感度向上、スペクトルパターン同一、ペプチドが異なってもMALDIイメージ類似、ペプチドの異なるIgG1とIgG2を比較することが可能>
まず、20μgの免疫グロブリンG(IgG)(和光純薬工業製)にRapiGest SF(waters社製)を最終濃度が0.1%となるように加え、100℃で5分間加熱した。冷却後、10mmol/L重炭酸アンモニウムと10mmol/Lジチオトレイトールを含む水溶液に溶解し、55℃で45分間インキュベートした。
反応後、135mmol/Lのヨードアセトアミドを5μL加え、暗所で45分間静置した。次に、2μgのキモトリプシンを加え、25℃で一晩反応させた。
反応後、溶液はセルロースを用いて濃縮精製し、0.8%のトリフルオロ酢酸を加えて80℃で45分間加熱し、溶媒を乾燥させた。
余剰の誘導体化剤を除くため、キシレン(SIGMA社製)に浸し余剰のPDAMを除去し十分に乾燥させた。
このことは、糖ペプチドのペプチド部分が異なっていても、PDAMを用いて誘導体化することにより、それぞれの検出感度が増加するだけでなく、測定試料の一部分からでも、異なる糖ペプチドを同時に測定できることを示している。
従って、測定対象試料の全体を1時間以上かけて20000回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、一部分だけを短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。
<2種類の糖ペプチド混合物、誘導体化有り>
<感度向上、スペクトルパターン同一、ペプチドが異なってもMALDIイメージ類似、ペプチドの異なるNA2−LNDTRとNA2−AQNNGSNを比較することが可能>
まず、2μgのα2−HS−glycoprotein(Sigma社製)を50mmol/Lの重炭酸アンモニウムに溶解し、Thermolysinを最終濃度が200U/mLとなるように加え、56℃で一晩インキュベートした。反応後、0.8%のトリフルオロ酢酸を加えて80℃で45分間加熱し、溶媒を乾燥させた。次に、試料に水を加えて再溶解し、カーボングラファイトカートリッジ(GLサイエンス製)を用いて精製した。更に、セルロースを用いて濃縮精製した後、溶媒を乾燥させた。
<多種類の糖ペプチド混合物、誘導体化有り>
<感度向上、スペクトルパターン同一、ペプチドが異なってもMALDIイメージ類似、site−specificな糖鎖構造を比較することが可能>
10μgのα1−acid−glycoprotein(Sigma社製)を実施例6と同様に、RapiGestで変性後、還元アルキル化を行い、50mmol/Lの重炭酸アンモニウムに溶解し、Glu−Cを500ng(タンパク質量の1/20)となるように加え、37℃で一晩インキュベートした。
反応後、0.8%のトリフルオロ酢酸を加えて80℃で45分間加熱し、溶媒を乾燥させた。次に、試料に水を加えて再溶解し、セルロースを用いて濃縮精製した後、溶媒を乾燥させた。
N38、N54、N75及びN85の4カ所の糖鎖結合アスパラギンをそれぞれ含む糖ペプチドが検出された。N38には、糖鎖NA2及びNA3が結合し、N54には、糖鎖NA2、NA3及びNA4が結合し、N75には、糖鎖NA3及びNA4が結合し、N85には、糖鎖NA2、NA3及びNA4が結合することが分かった。
正イオン測定でも同様の結果が得られた。
<多種類の糖ペプチド混合物、誘導体化無し>
実施例8と同様に、α1−acid−glycoproteinをGlu−C消化を行った後、PDAM誘導体化を実施しなかった測定試料のMALDI質量分析を行った。その結果、実施例8で検出された4カ所の糖鎖結合アスパラギンをそれぞれ含む糖ペプチドを検出することはできず、定量的なMSスペクトルを得ることはできなかった。
このことは、一種類のペプチドではなく、異なったペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドの混合物では、それぞれのペプチドをもつ糖ペプチドがマトリックス分子と異なった相互作用をしたり、互いにイオン化を阻害したりすることで、定量的な測定をすることが困難であることを示している。
<多種類の糖ペプチド混合物、誘導体化有り>
α1−acid−glycoproteinを実施例6と同様な操作により得たサーモリシン消化糖ペプチド混合物でも同様の結果が得られた。すなわち、N15を含むITN、N54を含むFTPNKTEDT、N75を含むIYN、N85を含むVQRENGTの4種類のペプチド(「ITN」、「FTPNKTEDT」、「IYN」、「QRENGT」はそれぞれ、1文字アミノ酸の配列で表わしたペプチドを示す。)に複数の糖鎖が結合した糖ペプチドを検出し、それぞれのシグナル分布は同一であった。
更に、糖ペプチド調製にサーモリシンを用いると、比較的低分子量のペプチドを生じるので、縮合多環化合物で標識した測定対象分子中の共通の誘導体化構造の占有率が大きくなり好ましい。
あるいは、Glu−C、Lys−C又はArg−Cによる消化を実施すると、C末端アミノ酸が共通になるので、共通の誘導体化構造の効果を更に向上させるので好ましい。
従って、測定対象試料の全体を1時間以上かけて20000回以上のレーザーショットの測定を積算平均化しなくても、それぞれのより強いシグナルが出る点を探さなくても、最初に測定したシグナルが出る一部分だけを短時間で測定したとしても、効率よく定量的に測定できることが分かった。
Claims (8)
- 複数の測定対象分子を含む試料のMALDI質量分析法であって、該複数の測定対象分子は、糖の混合物、又は糖ぺプチドの混合物、又は糖ぺプチドとペプチドの混合物、又は糖タンパク質の混合物、又は糖タンパク質とタンパク質の混合物であり、測定試料全体を測定し積算平均化することなく、シグナルが出る測定試料の任意の点から、該複数の測定対象分子についての定量的なマススペクトルを得ることを特徴とするMALDI質量分析法。
- 上記複数の測定対象分子が、糖ぺプチドの混合物であって、そのペプチド部分は同一であるか、又は、糖ぺプチドとペプチドの混合物であって、糖ペプチドのペプチド部分は同一で、かつ糖ペプチドのペプチド部分と該ペプチドは同一である請求項1に記載のMALDI質量分析法。
- 上記複数の測定対象分子が糖の混合物であり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する請求項1に記載のMALDI質量分析法。
- 上記複数の測定対象分子が糖ぺプチドとペプチドの混合物であって、糖ペプチドのペプチド部分は同一で、かつ糖ペプチドのペプチド部分と該ペプチドは同一であり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する請求項1に記載のMALDI質量分析法。
- 上記複数の測定対象分子が糖ぺプチドの混合物であって、その糖ペプチドは糖及び/又はペプチドがそれぞれ異なってもよいものであり、試料を縮合多環化合物と反応させ、得られた縮合多環化合物で標識した測定対象分子とマトリックスとを結晶化させて測定試料を調製する請求項1に記載のMALDI質量分析法。
- 上記縮合多環化合物がピレン環化合物である請求項3ないし請求項5の何れかの請求項に記載のMALDI質量分析法。
- 上記ピレン環化合物が1−ピレニルジアゾメタン(PDAM)である請求項6に記載のMALDI質量分析法。
- 測定試料に存在する上記複数の測定対象分子がそれぞれ10pmol以下である請求項1ないし請求項7の何れかの請求項に記載のMALDI質量分析法。
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