WO2011081180A1 - Ｍａｌｄｉ質量分析法 - Google Patents

Ｍａｌｄｉ質量分析法 Download PDF

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WO2011081180A1
WO2011081180A1 PCT/JP2010/073709 JP2010073709W WO2011081180A1 WO 2011081180 A1 WO2011081180 A1 WO 2011081180A1 JP 2010073709 W JP2010073709 W JP 2010073709W WO 2011081180 A1 WO2011081180 A1 WO 2011081180A1
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WO
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sweet spot
mixed crystal
mass spectrometry
crystal
analysis
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PCT/JP2010/073709
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English (en)
French (fr)
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純子 天野
隆司 西風
寿子 奥村
Original Assignee
公益財団法人野口研究所
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    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/10—Ion sources; Ion guns
    • H01J49/16—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission
    • H01J49/161—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission using photoionisation, e.g. by laser
    • H01J49/164—Laser desorption/ionisation, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI]

Definitions

  • the present invention relates to a sweet spot prediction method in MALDI mass spectrometry.
  • MS Mass spectrometry
  • sample ionization is an important process that determines whether analysis is possible and the quality of the spectrum obtained, and many ionization methods have been developed so far to efficiently ionize the sample.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • ESI electrospray ionization
  • Mass spectrometers using these ionization methods are widely used in the bio field because they can be measured with a smaller amount of sample than NMR.
  • molecules to be analyzed for example, proteins, peptides, saccharides, etc.
  • a matrix substance that absorbs light
  • the target is analyzed together with the matrix by irradiating a pulse laser there. It is a technology to ionize the molecule.
  • the wavelength of the laser to be used often has a wavelength in the ultraviolet region, and the wavelength in the infrared region may be used, but it is general to use a laser that matches the light absorption characteristics of the matrix.
  • the most frequently used laser is a nitrogen laser, which has a wavelength of 337 nm.
  • the matrix is a crystalline organic molecule, and a co-crystal with an analysis sample is generated, and then ionized by irradiation with the pulse laser.
  • various liquid matrices have been developed, and there are various options depending on the sample to be analyzed.
  • DHBA is an excellent matrix suitable for ionization of low molecular weight organic compounds, peptides, saccharides, proteins and the like.
  • the matrix and the sample are well mixed and need to be a mixed crystal or mixture.
  • the quality of the mixed crystal or mixture of the sample and matrix affects the sensitivity and quality spectrum. Furthermore, even though it appears to be a homogeneous mixture, it is actually inhomogeneous.
  • ions derived from the molecule to be measured cannot be obtained from all the places where the crystal is generated. Only when a part is irradiated with a laser, ions derived from the molecule to be measured are obtained.
  • sweet spot This part is called “sweet spot”, and when measuring in MALDI, it is necessary to search for the sweet spot first in order to obtain a high-quality mass spectrum. Whether it is a part or not can only be searched by experience.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2
  • DHBA is known to have two types of crystal polymorphs, and each crystal has been reported to have a different melting point. Examples of this are Non-Patent Document 3 and Non-Patent Document 4. Two polymorphs were created under different crystallization conditions with different solvents. In addition, only one type of Raman spectrum and IR spectrum are listed in the spectrum database of organic compounds of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. However, not only has it been studied what crystal forms are produced under the conditions of standard sample preparation methods in MALDI, but also the relationship between the crystal forms and signals in MALDI, in particular the crystal forms and The relationship between sweet spots was not known at all.
  • DHBA is widely used for measuring sugar chains and glycopeptides, but it is essential to find sweet spots because sugar chains and glycopeptides have poor ionization efficiency.
  • Obtaining a high-quality mass spectrum requires time-consuming operations such as manually searching for a sweet spot and performing laser irradiation based on experience, and pre-scanning that consumes the sample, and is not particularly suitable for automated analysis. Was the current situation.
  • Patent Document 1 Several techniques have been developed for the purpose of facilitating the identification of sweet spots. Examples include Patent Document 1 and Patent Document 2, which are based on the idea of simply controlling the starting point of crystallization. Therefore, the idea of predicting a sweet spot using a method other than mass spectrometry, which is the gist of the present invention, was fundamentally different.
  • the present invention has been made in view of the above-described background art, and its problem is that, in MALDI mass spectrometry, determination of a measurement sample mixture that provides a high amount of ion production and accurate prediction of a sweet spot can be achieved in a short time. It is an object of the present invention to provide a method capable of efficiently obtaining a high-quality MS spectrum.
  • the present inventor conducted various local analyzes in order to investigate the physicochemical properties of the crystals of the matrix alone, and as a result, there are unexpectedly different types of matrix crystals that exhibit analysis results different from the known analysis results. I found it to be. From this, even in the mixed crystal of the sample containing the molecule to be measured and the matrix, the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot is a crystal that exhibits an analysis result similar to a known analysis result, and the sweet spot is created.
  • the mixed crystal part was conceived that it may be the same crystal as the other kind of matrix crystal that exhibits an analysis result different from the known analysis result, and as a result of intensive studies, the above problem can be solved. I found it.
  • the present invention [1] In MALDI mass spectrometry, after a mixed crystal of a sample containing a molecule to be measured and a matrix is precipitated, the mixed crystal is subjected to local analysis using an analysis method other than mass spectrometry, and then MALDI. Mass analysis is performed in advance to specify the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot and / or the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot, Next, after precipitating the mixed crystal of the sample containing the molecule to be measured and the matrix, the mixed crystal is subjected to local analysis using an analysis method other than the mass spectrometry, and the mixture becomes a sweet spot.
  • the present invention provides a sweet spot prediction method characterized by detecting a part and predicting that the part is not a sweet spot.
  • the present invention provides the following sweet spot prediction method.
  • the sample solution containing the molecule to be measured is placed on the sample support member and then the matrix solution is placed, or the sample solution containing the molecule to be measured and the matrix solution are simultaneously placed on the sample support member. After placing the solution and drying the solution to precipitate a mixed crystal of the sample and the matrix, the mixed crystal is locally analyzed using an analysis method other than mass spectrometry, and then MALDI mass spectrometry is performed.
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot and / or the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot are specified in advance, Next, after placing the sample containing the molecule to be measured on the sample support member, the solution of the matrix is placed, or the sample containing the molecule to be measured and the solution of the matrix are placed on the sample support member at the same time, After drying the solution and precipitating the mixed crystal of the sample and the matrix, the mixed crystal is locally analyzed by using an analysis method other than the mass spectrometry, and the mixed crystal becomes a sweet spot.
  • Detecting a portion of the mixed crystal that exhibits the analysis result of the portion of the crystal and predicting that the portion is a sweet spot and / or presenting the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become the sweet spot The method for predicting a sweet spot according to [1], wherein a part is detected and the part is predicted not to be a sweet spot. [3]
  • the local analysis is repeatedly performed or scanned over the entire region or a certain range of the mixed crystal, and the analysis result is mapped to predict a region that becomes a sweet spot.
  • the sweet spot prediction method according to any one of [1] to [3], wherein the analysis method other than the mass spectrometry is an analysis method by X-ray diffraction measurement.
  • the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA)
  • the spectroscopic measurement is a Raman spectroscopic measurement
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot is around 376 cm ⁇ 1 .
  • substantially no signal, or 1199cm substantially no signal in the vicinity of -1 or 1307cm a Raman spectrum having substantially no signal around -1
  • the sweet spot analysis portion of the mixed crystal as not to have a signal in the vicinity of 376Cm -1 or 1199cm have a signal in the vicinity of -1 or 1307cm a Raman spectrum having a signal in the vicinity of -1 [6] according How to predict sweet spots.
  • the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA)
  • the spectroscopic measurement is an infrared spectroscopic measurement
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot shows a signal around 1200 cm ⁇ 1.
  • An infrared spectroscopic spectrum which has substantially no signal or a signal in the vicinity of 1300 cm ⁇ 1 , and / or an analysis result of a portion of the mixed crystal which does not become a sweet spot has a signal in the vicinity of 1200 cm ⁇ 1 ;
  • the sweet spot prediction method according to [6] which is an infrared spectrum having substantially no signal in the vicinity of 1300 cm ⁇ 1 .
  • the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA)
  • the spectroscopic measurement is a Raman spectroscopic measurement or an infrared spectroscopic measurement
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot is The analysis result of the portion of the mixed crystal that is a Raman spectrum or infrared spectrum having a signal near 3265 cm ⁇ 1 and / or does not become a sweet spot substantially has a signal near 3265 cm ⁇ 1.
  • the sweet spot prediction method according to [6] which is not a Raman spectrum or an infrared spectrum.
  • the analysis method other than the mass spectrometry is detection of the structural color of the crystal surface by optical microscopy, and the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot does not show the structural color and / or the sweet
  • the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA), and the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot does not detect a periodic uneven state with a period of 1 ⁇ m to 10 ⁇ m on the crystal surface.
  • DHBA 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • the present invention also provides: [16] After the sample containing the molecule to be measured is placed on the sample support member, the matrix solution is placed, or the sample containing the molecule to be measured and the matrix solution are placed on the sample support member at the same time. And the mixed crystal of the sample and the matrix is precipitated, and then the mixed crystal is subjected to local analysis using an analysis method other than mass spectrometry, and then subjected to MALDI mass spectrometry to obtain a sweet spot.
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes and / or the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot is specified in advance, Next, after placing the sample containing the molecule to be measured on the sample support member, the solution of the matrix is placed, or the sample containing the molecule to be measured and the solution of the matrix are placed on the sample support member at the same time, After drying the solution and precipitating the mixed crystal of the sample and the matrix, the mixed crystal is locally analyzed by using an analysis method other than the mass spectrometry, and the mixed crystal becomes a sweet spot.
  • the portion of the mixed crystal exhibiting the analysis result of the portion of the crystal is detected, and laser desorption ionization is performed on the detected portion of the mixed crystal and / or the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot
  • the present invention provides a MALDI mass spectrometry method that detects a portion of a mixed crystal exhibiting an analysis result and does not perform laser desorption ionization on the detected mixed crystal portion. .
  • the present invention provides the following MALDI mass spectrometry.
  • the local analysis is repeatedly performed or scanned over the entire region or a certain range of the mixed crystal, and the analysis result is mapped, whereby the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot is extracted.
  • the MALDI mass spectrometry method according to [16] wherein a portion of the mixed crystal that exhibits the analysis result and / or a portion of the mixed crystal that exhibits the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot are detected.
  • the MALDI mass spectrometry method according to [16] or [17] wherein the analysis method other than the mass spectrometry is an analysis method for identifying a crystal polymorph.
  • the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA)
  • the spectrum measurement is an infrared spectrum measurement
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot is around 1200 cm ⁇ 1
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that has substantially no signal or has a signal near 1300 cm ⁇ 1 and / or does not become a sweet spot is a signal near 1200 cm ⁇ 1.
  • MALDI mass spectrometry according to [20] which is an infrared spectrum having substantially no signal in the vicinity of 1300 cm ⁇ 1 .
  • the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA)
  • the spectroscopic measurement is a Raman spectroscopic measurement or an infrared spectroscopic measurement
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot is
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that is a Raman spectrum or infrared spectrum having a signal near 3265 cm ⁇ 1 and / or does not become a sweet spot substantially has a signal near 3265 cm ⁇ 1.
  • the MALDI mass spectrometry method according to [20] which has no Raman spectrum or infrared spectrum.
  • the analysis method other than the mass spectrometry is detection of the structural color of the crystal surface by optical microscopy, and the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot does not show a structural color and / or does not become a sweet spot.
  • the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA), and the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot shows that a periodic uneven state with a period of 1 ⁇ m to 10 ⁇ m is not detected on the crystal surface, and / or Alternatively, the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot is an analysis result by a confocal laser microscope in which a periodic uneven state having a period of 1 ⁇ m or more and 10 ⁇ m or less is detected on the crystal surface.
  • Mass spectrometry [29] A derivatizing agent solution that increases ionization efficiency by reacting with the measurement target molecule after placing the sample containing the measurement target molecule on the sample support member and before placing the matrix solution.
  • the MALDI mass spectrometry method according to any one of [16] to [28], wherein a step of dropping and drying on the sample support member is inserted.
  • the above problems and problems can be solved, and it is not necessary to find out by experience whether the measurement sample is good or bad and where the sweet spot is located on the sample support member for MALDI mass spectrometry.
  • a high-quality MS spectrum can be obtained efficiently in time.
  • application to automatic analysis becomes possible, and a high-throughput MS analysis technique can be provided.
  • 1199Cm represents white crystals A having a strong signal in the vicinity of -1
  • a Raman imaging image is an analysis result representing black crystals B having no strong signal in the vicinity of 1199cm -1.
  • the matrix is not limited to any kind of liquid and solid as long as it absorbs the light energy of the laser and achieves desorption and ionization of the coexisting molecules to be analyzed, and examples thereof include the following.
  • the analysis of the measurement molecule and the matrix mixture can be performed using an analysis method other than mass spectrometry. It is also possible to detect a portion of the mixture that exhibits an analysis result different from the standard product of the matrix and to predict whether the mixture is good or bad and that portion is a sweet spot.
  • a mixed crystal of a sample containing a molecule to be measured and a matrix is precipitated, and then the mixed crystal is locally analyzed using an analysis method other than mass spectrometry.
  • matrix crystal product having the same crystal structure as the mixed crystal that gives an analysis result that does not become a sweet spot by performing MALDI mass spectrometry is abbreviated as “matrix standard product” or simply “standard product”. .
  • matrix standard product or simply “standard product”.
  • DHBA crystal product of DHBA having the same crystal structure as the mixed crystal that gives an analysis result that does not become a sweet spot by mass spectrometry
  • standard product of DHBA or simply “standard product” for convenience.
  • DHBA standard product may be simply abbreviated as “DHBA powder”.
  • a mixed crystal of a sample and a matrix containing a molecule to be measured in MALDI mass spectrometry is precipitated.
  • the method for precipitating the mixed crystal is not particularly limited, but for example, preferable methods include the following (1) to (3).
  • the matrix solution is placed on a sample support member, and then the solution is dried to precipitate crystals of the matrix, and then a matrix having the same or different chemical structure and a solution containing the molecule to be measured are overlaid. And then drying the solution to form a mixture.
  • liquid matrix for example: (1) After placing the sample containing the molecule to be measured on the sample support member, the matrix solution is placed after drying or before drying, and then the solvent of the mixed solution is volatilized to produce the mixture. How to make. (2) A method in which a sample containing a molecule to be measured and a matrix solution are simultaneously placed on a sample support member, and then the solvent of the mixed solution is volatilized to generate the mixture.
  • the method (1) or (2) is particularly preferable as the method for precipitating the mixed crystal of the sample and the matrix. That is, (1) Place a matrix solution after placing a sample containing a molecule to be measured on a sample support member, or (2) The sample containing the molecule to be measured and the matrix solution are simultaneously placed on the sample support member, Next, a method of drying the solution and precipitating the mixed crystals
  • the method (1) is a particularly preferable method in the present invention, in which a sample containing a molecule to be measured is first present on the sample support member, and then a matrix solution (preferably a substantially matrix-only solution).
  • a matrix solution preferably a substantially matrix-only solution.
  • the step of drying the matrix solution on the plate is the final step in the step of supplying the substance onto the plate.
  • the sample and the matrix In general, in order to obtain a high ion production amount, the sample and the matrix must be well mixed, but the molecule to be measured is not dissolved (contained) in the solution supplied to the plate in the final step. The present inventor has found that this is acceptable.
  • a “measurement target molecule” that exhibits an analysis result different from the standard product of the matrix. It is possible to make the mixed crystal of the sample and the matrix containing "appropriately appear on the sample support member. “Different analysis results” means that when the entire analysis pattern is subjected to multivariate analysis and the patterns do not match, or as described later, focusing on a specific wave number, the presence or absence of a signal peak at that wave number or diffraction angle, or The relative height may be different.
  • the analysis result by the analysis method other than mass spectrometry described later which is presented by the above-mentioned “mixed crystal of sample and matrix containing the molecule to be measured”, is also presented by a crystal of the matrix not containing the molecule to be measured (that is, a crystal of only the matrix).
  • a crystal of the matrix not containing the molecule to be measured that is, a crystal of only the matrix.
  • the present invention was made by finding that the portion of “mixed crystal of sample and matrix containing the molecule to be measured” that shows an analysis result different from the matrix standard product becomes a sweet spot. Since the analysis result different from the product may be exhibited even by the matrix alone, the analysis target molecule is directly analyzed by “analysis method other than mass spectrometry”, so that “different analysis result” is not necessarily obtained.
  • the solvent of the solution is preferably a solvent that can dissolve both the molecule to be measured and the matrix. This is because the molecule to be measured already existing in the lower layer can be dissolved and mixed with the matrix.
  • the method (1) preferably includes the following steps (A) and (B) as essential steps.
  • (A) a step of drying a solution of a sample containing a molecule to be measured on a plate, and thereafter
  • (B) The process of dripping the solution which melt
  • step (A) the sample solution containing the molecule to be measured is dried on the plate.
  • the solution at this time only needs to contain the molecule to be measured, and may or may not contain the matrix.
  • the good solvent of the sample containing the molecule to be measured is a poor solvent for the matrix. If the sample is unstable and cannot be stored or used as a stock solution or is difficult to handle, the preparation of the measurement sample is easy, the selection range of the solvent is widened, the decomposition of the sample and the adsorption to the container are suppressed It is preferable that the matrix is not dissolved in the solution at this time because only the sample containing the molecule to be measured is dissolved.
  • the solvent at that time is not particularly limited as long as the sample containing the molecule to be measured is dissolved.
  • the solvent may not have a property of dissolving the matrix, and has a high boiling point at normal pressure and is evaporated (dried). The speed may be slow.
  • the solvent used in the step (A) is particularly preferably water alone.
  • the solvent used in step (A) is most preferably water alone. Since the matrix is not dissolved, the solubility in the matrix may be low. Therefore, the most suitable solvent can be selected for the measurement target molecule or the sample containing the measurement target molecule.
  • the concentration of the molecule to be measured in the solution in the step (A) is not particularly limited, but is preferably 1 amol / ⁇ L to 1 ⁇ mol / ⁇ L, particularly preferably 100 amol / ⁇ L to 1 nmol / ⁇ L.
  • the thickness of the layer containing the molecule to be measured present on the plate is not particularly limited, but is preferably 5 ⁇ m or less, particularly preferably 1 ⁇ m or less. If the thickness of such a layer is too thick, when the matrix solution is dropped, it may not mix well with the matrix molecules, and the MS signal intensity may decrease.
  • sample containing the molecule to be measured since the solution of “sample containing the molecule to be measured” is first dropped on the plate, when the sample containing the molecule to be measured is very small, it is mixed with the matrix solution in a separate container and part of it. This is particularly useful because almost the entire amount of a small amount of sample can be subjected to analysis without being dropped on the plate. More useful when the sample containing the molecule to be measured is 1000 fmol or less, particularly useful when the sample is 300 fmol or less, and less than 100 fmol (for example, 100 fmol is placed on the plate by dropping 1 ⁇ L of an aqueous solution dissolved in 100 fmol / ⁇ L) In this case, it is further useful.
  • step (B) a step of dropping a solution obtained by dissolving only the matrix in a solvent onto the plate is included.
  • the meaning of “after step (A)” is not limited to “immediately after step (A)”, and another step may be inserted between step (A) and step (B).
  • Examples of the “other process” include a process (C) described later.
  • step (B) a solution in which only the matrix is dissolved in the solvent is dropped onto the plate.
  • a solvent that can dissolve both the measurement target molecule and the matrix the lower measurement target molecule is transformed into the matrix.
  • Mixed crystals appear that are miscible with the molecule and exhibit analytical results different from the matrix standard, which can be an excellent sweet spot.
  • step (C) In order to further increase the ionization efficiency, it is preferable to include a step of dropping a solution of a derivatizing agent that increases the ionization efficiency by reacting with the molecule to be measured and drying the solution on the plate.
  • a derivatizing agent that increases ionization efficiency by reacting with the molecule to be measured (hereinafter simply abbreviated as “derivatizing agent”) is reacted with the molecule to be measured in advance and then supplied to the plate, the loss of the sample to be measured May be connected. Accordingly, when mass spectrometry is applied to a small amount of “molecules derived from a living body or molecules in a biological sample” such as sugars, glycoproteins, glycopeptides, the process (C) between the process (A) and the process (B). It is particularly preferred to insert
  • the derivatizing agent is not particularly limited as long as it enhances the ionization efficiency of the derivatized molecule to be measured, that is, the molecule to be subjected to mass spectrometry.
  • the derivatizing agent is also preferably a compound having an effect as a matrix in MALDI mass spectrometry, or a compound further having a reactive functional group or a spacer portion described later.
  • a condensed polycyclic compound having a condensed polycycle such as naphthalene, anthracene, and pyrene in the molecule preferably exhibits the above effects. Therefore, it is particularly preferable.
  • the “condensed polycyclic compound” means a reactivity capable of binding a molecule to be measured with a condensed polycyclic moiety which may partially contain a heterocyclic ring containing nitrogen, sulfur or oxygen molecules.
  • a compound having an aromatic ring is preferable.
  • the derivatizing agent is capable of controlling the ionization cleavage position of the derivatized molecule, that is, the molecule subjected to mass spectrometry, by reacting with the molecule to be measured.
  • the derivatizing agent preferably has a reactive functional group such as an amino group, a hydrazide group, a diazomethyl group, a succinimidyl ester group, a sulfonyl chloride group, or an iodo group (—I).
  • a condensed polycyclic derivative compound in which the above group is bonded to a condensed polycycle such as a naphthalene ring, an anthracene ring, or a pyrene ring directly or through another group (spacer portion) Methyl iodide; diazomethane; trimethylsilyldiazomethane and the like.
  • a pyrene ring compound is particularly preferable in terms of increasing ionization efficiency of a derivatized molecule, that is, a molecule subjected to mass spectrometry, and controlling an ionization cleavage position.
  • the “pyrene ring compound” means a pyrene ring, a reactive functional group that can be bonded to the “molecule to be measured”, and, if necessary, a spacer that connects the pyrene ring and the reactive functional group. And a compound having a moiety.
  • 1-pyrenebutanoic acid, hydrazide (hereinafter abbreviated as “PBH”), 1-pyreneacetic acid, hydrazide, 1-pyrenepropionic acid hydrazide ( 1-pyrenepropionic acid, hydrazide), 1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester, 1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester, 1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester Cynimidyl ester (1-pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester), N- (1-pyrenebutanoyl) cysteic acid succinimidyl ester (N- (1-pyrenebutanoyl) cysteic acid, succinimidyl ester), N- (1-pyrene) iodoacetamide (N- (1-pyrene) iodoacetamide), N- (1-pyrene) iodomaleimide, N-
  • Preferred examples of the derivatizing agent include those obtained by replacing the pyrene ring with a naphthalene ring or an anthracene ring in the above specific compound. Also preferred are methyl iodide, diazomethane or trimethylsilyldiazomethane.
  • the molecule to be measured is a molecule having a sugar chain containing an aldehyde group, and the derivatizing agent has an amino group or a hydrazide group.
  • the molecule to be measured is a protein or glycoprotein having a carboxyl group, an amino group or a mercapto group, and the derivatizing agent has an amino group, a hydrazide group or a diazomethyl group.
  • the measurement target molecule may be a protein or glycoprotein having a carboxyl group
  • the derivatizing agent may be methyl iodide or trimethylsilyldiazomethane.
  • this method (2) when the mixed crystal is locally analyzed on the sample support member using an analysis method other than mass spectrometry, an analysis result different from the standard product of the matrix is exhibited.
  • a “mixed crystal of a sample containing a molecule to be measured and a matrix” can appear.
  • the molecule to be measured may be derivatized.
  • ⁇ Local analysis by analysis methods other than mass spectrometry> in MALDI mass spectrometry, after a mixed crystal of a sample containing a molecule to be measured and a matrix is precipitated, an analysis method other than mass spectrometry is used to determine the locality of the mixed crystal. MALDI mass spectrometry is performed, and then the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot and / or the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot are specified in advance.
  • the mixed crystal is subjected to local analysis using an analysis method other than the mass spectrometry, and the “sweet spot” is obtained. Detecting a portion of the mixed crystal that exhibits the analysis result of the portion of the mixed crystal and predicting that the portion is a sweet spot, and / or analyzing the portion of the mixed crystal that does not become the sweet spot A portion of the mixed crystal exhibiting a “result” is detected, and the portion is predicted not to be a sweet spot.
  • the “sweet spot prediction method” of the present invention includes “predicting that a certain portion is a sweet spot” and / or “predicting that a certain portion is not a sweet spot”.
  • the MALDI mass spectrometry method of the present invention is characterized in that laser desorption ionization is performed on the detected portion of the “mixed crystal of a sample containing a molecule to be measured and a matrix”. That is, in the MALDI mass spectrometry method of the present invention, the “mixed crystal portion exhibiting the analysis result of the mixed crystal portion” that becomes a sweet spot is detected, and the detected mixed crystal portion is laser-targeted. Laser desorption ionization is performed on the detected portion of the mixed crystal by detecting “the portion of the mixed crystal exhibiting the analysis result of the portion of the mixed crystal” that is desorbed and / or does not become a sweet spot. It is characterized by not.
  • a mass analysis method is used to locally analyze the mixture over the entire area of the measurement sample, which is a mixture on the sample support member.
  • the sample is once ionized for that purpose, so in the first place, the measurement sample on the sample support member is fresh and the actual MS spectrum cannot be taken. Further, particularly when dealing with a very small amount of sample, most of the sample is consumed when searching for a sweet spot, and MS n (2 for acquiring MS spectra and structure information after that is acquired. ⁇ n) In some cases, it is impossible to acquire a spectrum.
  • the “analysis method other than mass spectrometry” in the present invention is not particularly limited, but is a non-destructive analysis method in that the plate on which the analyzed sample is placed can be used for MALDI mass spectrometry. preferable.
  • non-destructive means that not only the shape but also the physical properties and the like are not substantially changed.
  • “Analysis method other than mass spectrometry” in the present invention is not particularly limited, but “analysis method for identifying crystal polymorphism”; “analysis method by spectroscopic measurement”; “analysis method by X-ray diffraction measurement”; “Analytical method by detecting structural color of crystal surface by optical microscopy”, “Analytical method by detecting periodic uneven state of crystal surface period of 1 ⁇ m to 10 ⁇ m”, etc.
  • such a method is preferable in that it is easy to present an analysis result different from the matrix standard product, and the sweet spot can be easily found.
  • the above analysis method is preferable. Specifically, the above analysis methods may overlap. ⁇ "By microscopy" has been deleted. ⁇
  • the “different analysis results” means that the entire spectrum or the entire X-ray diffraction pattern is subjected to multivariate analysis and the patterns do not match, or, as described later, to a specific (one or more) wave number. Paying attention to the presence or absence of the signal peak at the wave number or diffraction angle, or the relative height of the signal, the presence or absence of detection of structural color on the crystal surface, the detection of periodic irregularities with a period of 1 ⁇ m to 10 ⁇ m on the crystal surface There is presence or absence.
  • sample on the sample support member after analysis can be directly used for MALDI mass spectrometry. preferable.
  • analytical methods for identifying crystal polymorphs include spectral spectrum measurement (Raman spectroscopy, infrared spectroscopy, etc.), X-ray diffraction measurement, neutron diffraction measurement, electron beam diffraction measurement, microscopy, birefringence measurement, thermal There are analysis methods such as analysis and water vapor adsorption measurement.
  • spectral spectrum measurement is particularly preferably a Raman spectral spectrum measurement or an infrared spectral spectrum measurement for the reason described above.
  • Raman spectroscopy measurement The specific measurement method of Raman spectroscopic spectrum measurement is not particularly limited, and a known method is used. However, in the present invention, a plurality of crystals are not locally acquired but only one local Raman spectrum is acquired. It is preferable that scanning is performed while performing Raman measurement and Raman imaging is performed because a sweet spot can be predicted more clearly.
  • the mixed crystal is locally analyzed using Raman spectroscopic spectrum measurement, and the standard crystal of the matrix (hereinafter abbreviated as “crystal A” may be abbreviated. )
  • crystal A the standard crystal of the matrix
  • crystal B the standard crystal of the matrix
  • the mixed crystal is locally analyzed using Raman spectroscopic spectrum measurement, and a pattern of a plurality of crystals is confirmed, the analysis results different from those of other crystals are obtained. It is preferable to detect a portion of “matrix mixed crystal” (hereinafter sometimes abbreviated as “crystal B”) and predict that portion as a sweet spot.
  • a Raman spectroscopic spectrum is locally measured over the entire area of the matrix crystal on the sample support member, and exhibits a different analysis result from the crystal A, for example, having a signal peak at a different wave number.
  • a sample and matrix mixed crystal containing "portion (crystal B) (preferably mapping the portion of crystal B or mapping both portions of the crystal separately to create an image image) It is particularly preferable to crystallize the portion of the crystal B by laser desorption ionization.
  • the Raman spectrum is measured for several locations of the matrix crystal on the sample support member, and there are locations with signal peaks at wave numbers different from the “standard (crystal A)”, such “different” Focusing on the “wave number”, a Raman imaging image of a portion (crystal B portion) having a signal peak at “different wave numbers” is obtained, and the portion of the crystal B represented in the Raman imaging image is predicted to be a sweet spot It is preferable. And it is preferable to mass-analyze by irradiating a laser to the appropriate place in the inside, and laser desorption ionization.
  • FIG. 4 shows a Raman imaging image in which the crystal B having no strong signal in the vicinity of 1199 cm ⁇ 1 is black when the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA).
  • DHBA 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • the portion of the crystal B where the sweet spot exists is clearly shown in black.
  • the portion of the crystal A having a strong signal in the vicinity of 1199 cm ⁇ 1 is clearly shown in white, and since there is no sweet spot there, it can be seen that it is useless to measure that portion.
  • MALDI mass spectrometry it is first necessary to search for a sweet spot in order to obtain a high-quality mass spectrum.
  • an attempt is made based on experience to determine which part of the crystal the sweet spot is. It is possible to escape from the operation of searching for errors.
  • near means a range of ⁇ 5 to ⁇ 10 cm ⁇ 1 depending on the resolution and wave number of the measuring instrument.
  • the type of the matrix used in the present invention is not particularly limited, and any matrix used in MALDI mass spectrometry can be used, but 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA) is preferable.
  • DHBA 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA)
  • the analysis method other than the mass spectrometry is an analysis method by Raman spectroscopic spectroscopy, and the mixed crystal that becomes a sweet spot analysis of portions, 376Cm substantially no signal in the vicinity of -1 or 1199cm substantially no signal in the vicinity of -1 or 1307cm substantially no signal around -1 It is the said sweet spot prediction method which is a Raman spectrum.
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal does not become sweet spot has a signal around 376Cm -1 or 1199cm have a signal in the vicinity of -1 or 1307cm a Raman spectrum having a signal in the vicinity of -1 above This is a sweet spot prediction method.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention is a MALDI mass spectrometry method in which the matrix to be used is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA), and in the Raman spectrum obtained by Raman spectrum measurement, around 376 cm ⁇ 1.
  • laser in substantially no signal, or 1199cm substantially no signal in the vicinity of -1, or a signal to 1307cm around -1 targeting the crystalline portion on the sample support member is substantially free MALDI mass spectrometry with desorption ionization.
  • having a signal in the vicinity of 376Cm -1 or 1199cm have a signal in the vicinity of -1 or 1307cm not laser desorption ionization signal in the vicinity of -1 as a target the crystalline portion on the sample support member having a substantially MALDI mass It is an analytical method.
  • the Raman spectrum of the portion of the crystal B of DHBA either substantially no signal around 376cm -1, or 1199Cm -1 or substantially no signal in the vicinity, or 1307Cm -1 near the substantially No signal is shown. Accordingly, or to obtain a Raman imaging image portion substantially no signal around 376cm -1, or to obtain a Raman imaging image portion substantially no signal in the vicinity of 1199cm -1, substantially in the vicinity of 1307cm -1 If a Raman imaging image of a portion that does not show a signal is obtained, a sweet spot is present in the indicated portion.
  • the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA), and an analysis method other than the mass spectrometry is an analysis method by Raman spectroscopy, and the sweet spot is obtained.
  • DHBA 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • an analysis method other than the mass spectrometry is an analysis method by Raman spectroscopy, and the sweet spot is obtained.
  • This is the sweet spot prediction method described above, in which the analysis result of the mixed crystal portion is an infrared spectrum having a signal in the vicinity of 3265 cm ⁇ 1 .
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot is a Raman spectrum having substantially no signal in the vicinity of 3265 cm ⁇ 1 .
  • the matrix to be used is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA)
  • DHBA 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • Infrared spectrum measurement may be performed instead of the above-described Raman spectrum measurement.
  • infrared spectroscopic spectrum measurement is not particularly limited, and a known method is used, but FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy) is preferable.
  • micro-infrared spectroscopy is required for local analysis of mixed crystals.
  • the matrix used is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA)
  • the spectroscopic measurement is an infrared spectroscopic measurement
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot is , 1200 cm substantially no signal in the vicinity of -1 or 1300cm is above the sweet spot of the prediction method is an infrared spectrum having a signal in the vicinity of -1.
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal does not become sweet spot has a signal in the vicinity of 1200 cm -1, or 1300cm signals in the vicinity of -1 is an infrared spectrum substantially free of the sweet spot
  • “near” means a range of ⁇ 5 to ⁇ 10 cm ⁇ 1 depending on the resolution and wave number of the measuring instrument.
  • a signal is substantially transmitted in the vicinity of 1200 cm ⁇ 1 in the infrared spectrum obtained by the infrared spectrum measurement.
  • the above MALDI mass spectrometry method in which laser desorption ionization is performed on a crystal portion on a sample support member that does not have or has a signal in the vicinity of 1300 cm ⁇ 1 . Also, having a signal in the vicinity of 1200 cm -1, or 1300 cm MALDI mass spectrometry without laser desorption ionization a crystalline portion on substantially free not sample supporting member as an object to a signal in the vicinity of -1.
  • Portion of the crystal B is in the infrared spectrum, or substantially no signal in the vicinity of 1200 cm -1, or a signal to 1300cm around -1, whereas, the portion of the crystal A may infrared spectrum in either have a signal in the vicinity of 1200 cm -1, or at a signal to 1300cm around -1 because substantially no.
  • the matrix is 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA), and an analysis method other than the mass spectrometry is an analysis method by infrared spectroscopic measurement, which becomes a sweet spot.
  • DHBA 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • an analysis method other than the mass spectrometry is an analysis method by infrared spectroscopic measurement, which becomes a sweet spot.
  • the sweet spot prediction method described above, in which the analysis result of the mixed crystal portion is an infrared spectrum having a signal in the vicinity of 3265 cm ⁇ 1 .
  • the sweet spot prediction method according to the above, wherein the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot is an infrared spectrum having substantially no signal in the vicinity of 3265 cm ⁇ 1 .
  • the sample support having a signal in the vicinity of 3265 cm ⁇ 1 in the infrared spectrum obtained by the infrared spectrum measurement
  • DHBA 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • the portion of the crystal B has a signal in the vicinity of 3265 cm ⁇ 1 in the infrared spectrum, whereas the portion of the crystal A has substantially no signal in the vicinity of 3265 cm ⁇ 1 in the infrared spectrum. It is.
  • an analysis method based on X-ray diffraction measurement may be used in place of the analysis based on the Raman spectral spectrum measurement or the infrared spectral spectrum measurement.
  • the specific method of the analysis method by X-ray diffraction measurement is not particularly limited, and a known method is used. However, in the present invention, not only a single local X-ray diffraction spectrum is acquired, but a plurality of methods are used. It is preferable that the crystal is scanned by X-ray diffraction measurement and X-ray imaging is performed because a sweet spot can be predicted more clearly.
  • Analytical method by detecting structural color of crystal surface by optical microscopy an analysis method for detecting the structural color of the crystal surface using optical microscopy may be used.
  • the “structural color” in the present invention is not a color due to light absorption such as a color of a pigment or the like, but of a light irradiated on a periodic structure such as a nanometer-level unevenness on a crystal surface or a multilayer structure of a nanometer level. A color that appears due to optical phenomena such as refraction, diffraction, scattering, and interference.
  • the mixed crystal in the present invention is substantially achromatic in terms of light absorption, but the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot has a fine (nm level) periodic structure on the crystal surface.
  • the above optical phenomenon is caused, and the color or the color pattern of blue, green, red, yellow, or an intermediate color thereof can be visually recognized by optical microscopy.
  • the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot does not cause the above optical phenomenon due to a fine (nm level) periodic structure of the crystal surface, and has no color or color pattern by optical microscopy. It can be visually recognized.
  • analysis method other than the mass spectrometry is detection of the structural color of the crystal surface by optical microscopy, and the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot does not show the structural color. It is also preferable to predict the sweet spot in such a manner that the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become a sweet spot shows a structural color.
  • the method of detecting the structural color of the crystal surface by optical microscopy is not particularly limited, and a known method is used.
  • the presence or absence of structural color is observed using a reflective optical microscope. Is preferred. It is also preferable to use a polarizing microscope with a built-in polarizing filter or the like to make the irradiation light and / or measurement light into polarized light so that the structural color can be easily detected by blocking the specularly reflected light. Is particularly preferable in order to make it very easy to determine the presence or absence of structural colors.
  • the type of the matrix is not particularly limited, and any matrix can be used as long as it is used for MALDI mass spectrometry, but 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA) is preferable.
  • DHBA 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • This method makes the sweet spot easy, quick and clear by using interference of reflected light caused by the regular structure of the crystal surface, that is, the change or presence of structural color based on the nano-level fine structure of the crystal surface. It is particularly preferable in that it can be predicted.
  • the part where the analysis result by the optical microscope does not show the structural color is the part of the mixed crystal that becomes the sweet spot
  • the part where the analysis result by the optical microscope shows the structural color is the part of the mixed crystal that does not become the sweet spot. It is preferable to predict that there will be. That is, the sweet spot prediction method in which the analysis result of the mixed crystal portion that becomes the sweet spot is the analysis result by the optical microscope that does not show the structural color is preferable, and the analysis result of the mixed crystal portion that does not become the sweet spot is the structural color. A method for predicting a sweet spot which is an analysis result by an optical microscope is preferable.
  • the “analysis method other than the mass spectrometry” is the “periodic unevenness state having a period of 1 ⁇ m or more and 10 ⁇ m or less” on the crystal surface (hereinafter simply referred to as “unevenness state” in parentheses). Is preferably detected).
  • “By microscopy” has been deleted. ⁇
  • the analysis result of the portion of the mixed crystal that becomes a sweet spot indicates that the uneven state is not detected on the crystal surface, and / or the analysis result of the portion of the mixed crystal that does not become the sweet spot indicates that the uneven state is detected on the crystal surface.
  • the sweet spot prediction method is preferable. That is, it is expected that the portion where the uneven state is not detected on the crystal surface will be a sweet spot, and the portion where the uneven state is detected on the crystal surface is not expected to be a sweet spot. If ionization is performed, a good MS spectrum can be obtained efficiently. This method is particularly preferable in that a sweet spot can be predicted easily, quickly and clearly by observing the regular structure of the crystal surface.
  • the “irregularity state”, that is, the “periodic unevenness state with a period of 1 ⁇ m or more and 10 ⁇ m or less” is preferably a regular structure of the crystal surface.
  • the height of the convex portion is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ m to 10 ⁇ m, and particularly preferably 2 ⁇ m to 5 ⁇ m.
  • the period of the irregularities in the “irregular state” is preferably 2 ⁇ m to 5 ⁇ m.
  • the detection of the unevenness state of the crystal surface is not particularly limited as long as periodic unevenness of 10 ⁇ m or less can be identified, but it is preferably performed using a microscope, more preferably performed using an optical microscope, It is particularly preferable to use a confocal laser microscope. Using a confocal laser microscope to perform three-dimensional observation of the crystal surface is particularly preferable because a regular uneven state can be directly observed. ⁇ I added the light blue character part. ⁇
  • the type of the matrix is not particularly limited, and any matrix can be used as long as it is used for MALDI mass spectrometry, but 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA) is preferable.
  • DHBA 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • the measurement target molecule to which the sweet spot prediction method and MALDI mass spectrometry method of the present invention are applied is not particularly limited, but is preferably a molecule derived from a living body or a molecule in a biological sample, specifically, a sugar, Proteins, peptides, glycoproteins, glycopeptides, nucleic acids, glycolipids, and the like are preferable because the effects of the present invention can be further exhibited.
  • a “molecule to be measured” those prepared from natural products, those prepared by partially modifying natural products chemically or enzymatically, and those prepared chemically or enzymatically are also preferred. .
  • numerator contained in the biological body are also preferable.
  • the sample placed on the plate used for mass spectrometry may be only the “measuring molecule” itself, or one containing the “measuring molecule”, for example, a tissue of a living body, It may be a cell, body fluid or secretion (eg, blood, serum, urine, semen, saliva, tears, sweat, stool, etc.). That is, a biological sample may be used directly.
  • the molecule to be measured may be prepared by placing a sample on a plate and performing enzyme treatment or the like.
  • the above-mentioned molecules are often obtained in a small amount of sample to be analyzed, and in particular, obtained by chemically or enzymatically liberating complex carbohydrates such as sugars, glycoproteins, glycolipids, etc. Since there are a plurality of isomers having the same molecular weight and composition, there are many cases where the sweet spot was not easily found and the measurement was abandoned, and the sweet spot prediction method of the present invention and MALDI mass spectrometry were Since the said effect is especially show
  • Examples of the laser used for ionization include a nitrogen laser (337 nm), a YAG laser triple wave (355 nm), an NdYAG laser (256 nm), a carbon dioxide gas laser (2940 nm), and a nitrogen laser is preferable.
  • the ion separation and detection method is not particularly limited. Double focusing method, quadrupole focusing method (quadrupole (Q) filter method), tandem quadrupole (QQ) method, ion trap method, time of flight (TOF) ) Method or the like to separate and detect ionized molecules according to the mass / charge ratio (m / z). QIT-TOF is preferable.
  • MS n method Since molecules such as sugars, proteins, peptides, glycoproteins, glycopeptides, nucleic acids, and glycolipids contain many isomers having the same molecular weight and composition, this method improves ion generation efficiency and repeats molecular fragmentation n times (MS n method) is preferred.
  • MS n method (2 ⁇ n) in which fragmentation is repeated n times is preferably applied to the detected “mixed crystal of sample and matrix containing the molecule to be measured”. For example, the binding position in the molecule can be determined by the MS n method.
  • the crystal can be a sweet spot where efficient ionization of molecules to be measured is performed.
  • the portion of the crystal B has a coarser crystal structure than the matrix crystal that exhibits the same analysis result as that of the matrix standard product, and more likely to contain a larger number of sample target molecules during the matrix crystallization. It can be a sweet spot.
  • Example 1 First, an aqueous solution obtained by dissolving glycopeptide 1 (chemical structure shown in FIG. 1), which is a molecule to be measured, in water on a gold substrate (sample support member) obtained by evaporating gold on a silicon substrate to 500 fmol / ⁇ L. 1 ⁇ L was dropped, and the mixture was left to dry at room temperature (23 ° C.) and atmospheric pressure.
  • PDAM (1-pyryldiazomethan; manufactured by Molecular Probes) as a labeling reagent was dissolved in DMSO (dimethylsulfoxide; manufactured by SIGMA), and 0.25 ⁇ L of a solution having a concentration of 2 nmol / ⁇ L was dropped on the heat block. It was left to dry at 80 ° C. under atmospheric pressure. In order to remove the surplus labeling reagent, it was immersed in toluene (manufactured by SIGMA) to remove the surplus PDAM and sufficiently dried.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the Raman spectrum of the “DHBA powder” and the Raman spectrum of the “measurement sample deposit” were first compared with the spectrum patterns by multivariate analysis.
  • the “measurement sample precipitate” was a plate (sample support member). Different Raman spectra could be obtained at different measurement locations. That is, a unique Raman spectrum was obtained for each DHBA crystal deposited on the plate (sample support member).
  • a crystal A that gives the same Raman spectrum as that of most “DHBA powder” and a Raman spectrum different from “DHBA powder” It was found that the resulting crystals B can be divided into at least two types.
  • FIG. 3B shows a Raman spectrum obtained from the crystal B of the measurement sample precipitate, which is different from “DHBA powder”.
  • 1199Cm represents white crystals A having a strong signal in the vicinity of -1 shows a Raman imaging image representing black crystals B having no strong signal in the vicinity of 1199Cm -1 in FIG. That is, in FIG. 4, the crystal expressed in white is the crystal A from which the same Raman spectrum (FIG. 3A) as “DHBA powder” was obtained, and the crystal expressed in black is “DHBA powder”. It is the crystal B from which a different Raman spectrum (FIG.3 (b)) was obtained.
  • the mass spectrum was acquired by the MALDI mass spectrometry.
  • the measurement was performed using a MALDI-QIT-TOF type mass spectrometer (AXIMA-QIT, manufactured by Shimadzu Biotech) as a mass spectrometer.
  • the measurement was performed in positive ion mode. As a result, it was possible to detect a strong signal only from the crystal B which was not expressed in white but black (having no strong signal in the vicinity of 1199 cm ⁇ 1 ). In addition, a particularly strong signal could be detected from the root on the circumference of the crystal B.
  • FIG. 5 shows a mass spectrum obtained from the base on the circumference of the crystal B. As shown in FIG. 5, a very good mass spectrum could be obtained.
  • Raman spectroscopic measurement which is an analysis method other than mass spectrometry, revealed a measurement point (sweet spot) where a good MS signal can be obtained. And was able to measure efficiently.
  • Comparative Example 1 After optimizing the laser power to the threshold value at which the signal of the ion of the molecule to be measured begins, the entire area of the measurement sample of Example 1 was irradiated with laser at intervals of 40 ⁇ m and measured automatically.
  • FIG. 6 shows the position where glycopeptide 1 ion was detected in the measurement sample deposit. If the matrix crystal is locally analyzed using mass spectrometry in this way, the location of the sweet spot can be predicted, but the matrix is consumed by laser irradiation, so the next measurement will There is no confirmation that a sweet spot exists at the same location, and in some cases the matrix is exhausted, so there may be no MS signal at the next measurement.
  • Example 6 it was shown that the signal could not be detected from “all where there are crystals” shown in FIG. As in Example 1, there were some measurement points where a good spectrum was obtained, but there were also measurement points on the plate (sample support member) where signal detection was not easy as shown in FIG.
  • Example 2 A measurement sample was prepared in the same manner as in Example 1, and FT-IR was measured. As a result, similar to the Raman spectrum, spectra having differences in the vicinity of 1200 to 1300 cm ⁇ 1 and 3265 cm ⁇ 1 were obtained depending on the measurement location (FIGS. 8A and 8B). That, 1200 cm substantially no signal in the vicinity of -1 or 1300cm has sweet spot crystalline portion on the sample support member having a signal in the vicinity of -1, conversely, has a signal in the vicinity of 1200 cm -1 Or, there was no sweet spot in the crystal part on the sample support member having substantially no signal in the vicinity of 1300 cm ⁇ 1 .
  • MS signal detection can also be predicted by infrared spectroscopy. That is, it was found that the sweet spot location on the plate (sample support member) can be predicted in advance.
  • Example 4 Glycopeptide 1 (chemical structure shown in FIG. 1), which is a molecule to be measured, was dissolved in water, and 1 ⁇ L of an aqueous solution adjusted to 100 fmol / ⁇ L was dropped to prepare a mixed crystal in the same manner as in Example 1.
  • Raman measurement was performed using an inVia Raman microscope (manufactured by Renishaw Co., Ltd.) under excitation laser conditions of a wavelength of 532 nm.
  • the substance on the plate (sample support member) could be divided into a region having the Raman spectrum of crystal A and a region having the Raman spectrum of crystal B.
  • FIG. 10A shows a Raman imaging image that is clearly shown in red and surrounded by a dashed ellipse. That is, in FIG. 10 (a), the crystal surrounded by the solid ellipse is the crystal A from which the same Raman spectrum (FIG. 3 (a)) as the known analysis result was obtained, and the crystal surrounded by the broken ellipse is This is a crystal B from which a Raman spectrum (FIG. 3B) different from the known analysis results was obtained.
  • Each crystal is divided into a crystal group A1 to A4 in a region surrounded by a solid line and a crystal group B1 to B7 in a region surrounded by a broken line as a crystal group estimated to be a crystal generated from the same starting point. did it.
  • a mass spectrum was obtained by MALDI mass spectrometry.
  • the measurement was performed using a MALDI-QIT-TOF type mass spectrometer (AXIMA-QIT, manufactured by Shimadzu Biotech) as a mass spectrometer.
  • the measurement was performed in positive ion mode. After optimizing the laser power to the threshold value at which the ion signal of the molecule to be measured begins to appear over the entire area of the measurement sample, laser irradiation was performed at 40 ⁇ m intervals, and measurement was performed automatically.
  • FIG. 10B shows the position where the glycopeptide 1 ion is detected in the measurement sample deposit by a dark square pixel.
  • the region B (B1 to B7), a strong signal was obtained with a high probability, and it became clear that a sweet spot was present.
  • a signal is rarely obtained from the region A, and it has been proved that it is not efficient to perform mass spectrometry by irradiating this portion with laser. That is, it was possible to determine in advance that the spot is not suitable as a sweet spot. Therefore, it was found that the present invention is effective for detecting a trace amount of measurement molecule of 100 fmol or less.
  • Reference example 1 High-purity DHBA (manufactured by Shimadzu Biotech) was placed on a slide glass as a powder, and a Raman image was obtained with an NRS-3200 micro-Raman system (JASCO). As shown in FIG. 11, the 3076 cm ⁇ 1 signal that is commonly present in crystals A and B coincided with the distribution of the optical microscope image (FIG. 11 (b)). Further, the signal of 1203 cm ⁇ 1 characteristic of the crystal A was detected from most (FIG. 11 (c)), but the signal of 3269 cm ⁇ 1 characteristic of the crystal B was hardly detected (FIG. 11 ( d)).
  • the spectrum shown by the arrow A in FIG. 11 is the same as the spectrum shown in FIG. 3 (a), which coincides with the Raman spectrum of DHBA in the spectrum database of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • the spectrum of the portion indicated by arrow B shown in FIG. 11 is the same as the spectrum of FIG. 3B, and is different from the spectrum of DHBA in the database. From this result, it was found that high-purity DHBA powder consisted of almost one crystal form.
  • the actual measurement image photograph is color-coded in the order of black ⁇ purple ⁇ dark blue ⁇ light blue ⁇ green ⁇ yellow ⁇ orange ⁇ red from the weakest part to the strongest part.
  • the strength in the black-and-white drawings attached to the application, but in the case of “yellow ⁇ orange ⁇ red”
  • the stronger there is a tendency for the stronger to be darker. Therefore, the dark portion outside the thin portion has a low signal intensity, but the dark portion inside the thin portion has a high signal intensity.
  • the spectrum of the part of arrow A shown in FIG. 12 is the same as the spectrum of FIG. 3 (a), which coincides with the spectrum of DHBA in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • the spectrum of the portion indicated by arrow B shown in FIG. 12 is the same as the spectrum of FIG. 3B, and is different from the spectrum of DHBA in the database.
  • the spectrum of the part indicated by the arrow A is similar to the spectrum of FIG. 8A, which is the same as the IR spectrum of DHBA in the spectrum of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Matched.
  • the spectrum of the portion indicated by arrow B was similar to the spectrum of FIG. 8B, but was different from the spectrum of DHBA in the database. From these facts, regardless of the presence of the molecule to be measured, two types of polymorph crystals are formed from high-purity DHBA powder under specific conditions, and one of the polymorphs is not usually present. It became clear that the shape is very effective for MALDI.
  • FIG. 11 also has the “relationship between the actual image photograph and the monochrome drawing attached to the application” in FIG. 12 described above.
  • a Raman imaging image in the NRS-3200 microscopic Raman system can be expressed by color-coding stepwise from a weak part to a strong part of a specific wave number signal.
  • the basic application for claiming priority was submitted to the Japanese Patent Office in the property submission form.
  • Example 5 A measurement sample was prepared in the same manner as in Example 1 using a commercially available stainless steel plate, and crystals were observed using a reflection type optical microscope. The optical microscope was observed using a digital microscope VHX-1000 (VH-Z100R lens, light source: halogen lamp 100W / 12V) manufactured by Keyence Corporation, with the magnification set to 150 and the polarization condition by crossed Nicols.
  • VHX-1000 VH-Z100R lens, light source: halogen lamp 100W / 12V
  • the crystal was divided into a crystal showing a structural color and an achromatic crystal. It was a fine (nm level) periodic structure on the crystal surface that developed the structural color.
  • a crystal showing a structural color does not give a good MS signal, and there is no sweet spot, and a crystal that has a good MS signal and becomes a sweet spot does not show a structural color. did. Further, it was found that a good MS signal was obtained from a crystal that did not show a structural color, and a sweet spot was present there, and a crystal that did not have a good MS signal and did not become a sweet spot showed a structural color.
  • the sweet spot location can be predicted very easily by discriminating in advance the crystal showing the structural color and the crystal not showing in the MS measurement sample.
  • Example 6 A measurement sample was prepared in the same manner as in Example 1 using a commercially available stainless steel plate, and the crystal was stereoscopically observed using a confocal laser microscope. As the confocal laser microscope, confocal observation was performed at a magnification of 5 to 50 times using a scanning confocal laser microscope LEXT OLS3100 manufactured by Olympus Corporation.
  • the crystal was divided into a crystal in which regular irregularities on the surface could be clearly detected and a crystal in which regular irregularities were not detected.
  • the period of the regular irregularities on the crystal surface was in the range of 1 ⁇ m to 5 ⁇ m, which was different from the “fine (nm level) periodic structure” described in Example 5 that expresses the structural color.
  • a good MS signal cannot be obtained from a crystal having regular irregularities on the surface (crystal having an irregular surface), and there is a sweet spot there. Further, it was found that a crystal that has a good MS signal and becomes a sweet spot does not have a regular uneven structure on the surface (the surface is not in an uneven state).
  • a good MS signal is obtained from a crystal having no regular irregularities on the surface, and there is a sweet spot, and a crystal in which the MS signal is not good and does not become a sweet spot It turned out that a typical uneven structure was shown.
  • the MALDI mass spectrometry method that predicts the location of the sweet spot using an analysis method other than the mass spectrometry method of the present invention can efficiently obtain a high-quality MS spectrum in a short time and is necessary for structure identification. Since high-sensitivity MS n (n> 1) analysis is possible and application to automatic analysis becomes possible, biological analysis in which only a very small amount of sample may be available particularly in all analysis fields using MS spectra. It is widely used in such fields.
  • Japanese Patent Application 2009-299303 which is a Japanese patent application filed on December 30, 2009
  • Japanese Patent Application 2010-038330 which is a Japanese patent application filed on February 24, 2010. The entire contents of these applications are hereby incorporated by reference and incorporated herein by reference.

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Abstract

　高いイオン生成量を提供するスイートスポットを正確に予測することで、短時間で効率良く質の高いＭＳスペクトルを得ることのできるＭＡＬＤＩ質量分析法を提供することを課題とし、測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶を析出させた後、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をしてからＭＡＬＤＩ質量分析をして、スイートスポットになる及び／又はならない該混合結晶の部分の分析結果を予め特定しておき、次に、測定対象分子を含む試料と該マトリックスの混合結晶を析出させた後、該質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をし、スイートスポットになる及び／又はならない該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットである及び／又はでないと予測するスイートスポットの予測方法、及びそれを用いたＭＡＬＤＩ質量分析法により課題を解決した。

Description

ＭＡＬＤＩ質量分析法
　本発明は、ＭＡＬＤＩ質量分析法におけるスイートスポットの予測方法に関するものである。
　「質量分析法（ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」（以下、「ＭＳ」と略記することがある）とは、測定対象分子を含む試料をイオン化し、測定対象分子由来のイオンを質量電荷比（質量／電荷（ｍ／ｚ））によって分離し検出することによって、その測定対象分子の化学構造に関する情報を得る方法である。
　ＭＳにおいて、試料のイオン化は、分析の可否や得られるスペクトルの質を左右する重要な過程であり、試料を効率よくイオンにするためにこれまで多くのイオン化法が開発されてきた。現在のところ、生体高分子のイオン化には、ソフトイオン化であるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（以下、「ＭＡＬＤＩ」と略記することがある）法やエレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（以下、「ＥＳＩ」と略記することがある）法が主に用いられている。これらのイオン化法を用いた質量分析計は、ＮＭＲ等に比べて測定試料量が少なくても測定が可能であることから、バイオ分野でも広く用いられている。
　ＭＡＬＤＩでは、マトリックスと呼ばれる光吸収を持つ物質の中に、分析対象となる分子（例えば、タンパク質、ペプチド、糖類等がある）を分散させ、そこにパルスレーザーを照射することでマトリックスと共に分析対象となる分子をイオン化する技術である。
　使用するレーザーの波長は紫外領域の波長を有する場合が多く、赤外領域の波長を使用する場合もあるが、マトリックスの光吸収特性に合わせたレーザーを用いるのが一般的である。現在、最も多用されるレーザーは窒素レーザーであり、波長３３７ｎｍを有する。
　一方、使用するマトリックスの選択が分析の成否を決めるため、これまでに多くのマトリックスが開発され、実際にＭＡＬＤＩに用いられてきた。一般的に、マトリックスは結晶性の有機分子であり、分析試料との共結晶を生成した上で、上記パルスレーザーを照射しイオン化する。近年は様々な液体マトリックスも開発されてきており、分析対象の試料に応じ様々な選択肢がある。
　実際に用いられているマトリックスの中でも汎用性があり、標準的なマトリックスは、ＣＨＣＡ（a－ｃｙａｎｏ－ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ　ａｃｉｄ）、ＳＡ（ｓｉｎａｐｉｃ　ａｃｉｄ）、ＤＨＢＡ（２，５－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）等であり、特にＤＨＢＡは、低分子量有機化合物、ペプチド、糖類、タンパク質等のイオン化に適する優れたマトリックスである。
　一般に、マトリックスと試料は良く混ざり、混合結晶又は混合物となる必要があると考えられている。この試料とマトリックスの混合結晶又は混合物の善し悪しが感度及び質の良いスペクトルに影響を与える。更に、一見同質の混合物に見えても実際には不均一で、特に固体結晶の場合には、結晶が生成した場所すべてから測定対象分子由来のイオンが得られるわけでもなく、生成した結晶のごく一部分にレーザーを照射した場合のみ測定対象分子由来のイオンが得られる。
　この部分は、「スイートスポット（ｓｗｅｅｔ　ｓｐｏｔ）」と呼ばれ、ＭＡＬＤＩにおける測定の際は、まずスイートスポットを探すことが質の高いマススペクトルを得るために必要となるが、スイートスポットが結晶のどの部分であるかは経験によって探す他ない。
　特に、ＤＨＢＡは比較的大きな針状の結晶を生成するため、スイートスポットとそうでない場所でのイオン生成量の差が著しく異なる。結晶の不均一性がこの現象の大きな原因であると考えられており、これを示した例として、非特許文献１や非特許文献２がある。
　更に、ＤＨＢＡは２種類の結晶多形を持つことが知られており、それぞれの結晶は異なる融点を持つと報告されている。これを示した例として、非特許文献３及び非特許文献４がある。２種類の多形は溶媒を変えて異なる結晶化の条件で作り出された。また、独立行政法人産業技術総合研究所の有機化合物のスペクトルデータベースには、１種類のラマンスペクトルとＩＲスペクトルのみが掲載されている。しかしながら、ＭＡＬＤＩにおける標準的な試料調製法の条件下でどのような結晶形が生成しているのかについて研究されたことはなかったばかりでなく、その結晶形とＭＡＬＤＩにおけるシグナルの関係、特に結晶形とスイートスポットの関係については全く知られていなかった。
　ＤＨＢＡは、糖鎖や糖ペプチドの測定に汎用されるが、糖鎖や糖ペプチドはイオン化効率が悪いので、スイートスポットを見つけることが必須である。質の高い良いマススペクトルを得るには、経験によって手動でスイートスポットを探し出し、レーザー照射を行うといった時間のかかる作業や、試料が消費されるプレスキャンが必要となり、特に自動分析には適さないのが現状であった。
　この問題の解決には、マトリックス溶液を迅速に乾燥させる等して、強制的に微結晶を生成させ、スイートスポットの生成を妨げる手法や、結晶化しない液体マトリックスを使用する手法があるが、イオン生成量の低下を招いたり、夾雑塩等の付加イオンの生成を促進したりする場合があり、スイートスポットの高いイオン生成量を生かしたまま用いることのできる手法ではなかった。液体マトリックスにおいても、固体マトリックスほどのばらつきはないが、夾雑塩等の影響でスペクトルの再現性が劣る場合もあり、根本的な解決にはならなかった。
　スイートスポットを特定するのを容易にする目的でいくつかの技術が開発されており、例として特許文献１や特許文献２があるが、これらは単に結晶化の起点を制御するという発想に基づいており、本発明の趣旨である質量分析以外の方法を用いてスイートスポットを予測するという発想とは根本的に異なるものであった。
特開２００３－０９８１１５号公報 特開２００３－０９８１４９号公報
Revecca W. et al., Anal. Chem.72(18), 30-36 (2000) Luxembourg S.L. et al.,Anal. Chem. 75(10), 2333-2341 (2003) Haisa M. et al., Acta. Cryst. B38,1480-1485(1982) Cohen D.E. et al., CrystalGrowth&Design 7(3), 492-495(2007)
　本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、ＭＡＬＤＩ質量分析法において、高いイオン生成量を提供する測定試料混合物の判定及びスイートスポットを正確に予測することで、短時間で効率良く質の高いＭＳスペクトルを得ることのできる方法を提供することにある。
　また、構造同定に必要な高感度ＭＳｎ（２≦ｎ）解析が可能となり、また、自動分析への応用が可能となり、高スループットのＭＡＬＤＩ質量分析法の実現が可能になる方法を提供することにある。
　本発明者は、マトリックス単独の結晶の物理化学的性質を調べるために、様々な局所的な分析を行った結果、意外にも既知の分析結果とは異なる分析結果を呈する別種のマトリックス結晶が存在することを発見した。このことから、測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶においても、スイートスポットにならない該混合結晶の部分は、既知の分析結果と同様の分析結果を呈する結晶であり、スイートスポットを創出する該混合結晶の部分は、既知の分析結果とは異なる分析結果を呈する当該別種のマトリックス結晶と同様の結晶であるかもしれないと着想して、鋭意検討を重ねた結果、上記の課題を解決できることを見出した。
　すなわち、驚くべきことに、上記のスイートスポットを創出する「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」の部分は、スイートスポットにならない混合結晶の部分とは異なる分析結果を示すことを初めて見出して本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
［１］　ＭＡＬＤＩ質量分析法において、測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶を析出させた後、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をしてからＭＡＬＤＩ質量分析をして、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果を予め特定しておき、
　次に、測定対象分子を含む試料と該マトリックスの混合結晶を析出させた後、該質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をし、スイートスポットになる該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットであると予測する、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットでないと予測することを特徴とするスイートスポットの予測方法を提供するものである。
　更に、本発明は、以下のスイートスポットの予測方法を提供するものである。
［２］　ＭＡＬＤＩ質量分析法において、試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後にマトリックスの溶液を載置し、又は試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて該試料とマトリックスの混合結晶を析出させた後、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をしてからＭＡＬＤＩ質量分析をして、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果を予め特定しておき、
　次に、試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に該マトリックスの溶液を載置し、又は試料支持部材上に測定対象分子を含む試料と該マトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて、該試料と該マトリックスの混合結晶を析出させた後、該質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をし、スイートスポットになる該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットであると予測する、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットでないと予測することを特徴とする［１］記載のスイートスポットの予測方法。
［３］　該局所的な分析を、該混合結晶の全域又は一定の範囲に対して、繰り返し行い若しくはスキャンして、その分析結果をマッピングすることにより、スイートスポットとなる領域を予測することを特徴とする［１］又は［２］記載のスイートスポットの予測方法。
［４］　該質量分析法以外の分析方法が、結晶多形を識別する分析方法である［１］ないし［３］の何れかに記載のスイートスポットの予測方法。
［５］　該質量分析法以外の分析方法が、分光スペクトル測定による分析方法である［１］ないし［３］の何れかに記載のスイートスポットの予測方法。
［６］　該分光スペクトル測定が、ラマン分光スペクトル測定又は赤外分光スペクトル測定である［５］記載のスイートスポットの予測方法。
［７］　該質量分析法以外の分析方法が、Ｘ線回折測定による分析方法である［１］ないし［３］の何れかに記載のスイートスポットの予測方法。
［８］　該質量分析法以外の分析方法が、光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出による分析方法である［１］ないし［３］の何れかに記載のスイートスポットの予測方法。
［９］
　該質量分析法以外の分析方法が結晶表面の周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態の検出である［１］ないし［３］の何れかに記載のスイートスポットの予測方法。
≪「顕微鏡法による」を削除しました。≫
［１０］　　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定がラマン分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないラマン分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを有するラマン分光スペクトルである［６］記載のスイートスポットの予測方法。
［１１］
　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定が赤外分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを有する赤外分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない赤外分光スペクトルである［６］記載のスイートスポットの予測方法。
［１２］　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定がラマン分光スペクトル測定又は赤外分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを有するラマン分光スペクトル又は赤外分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないラマン分光スペクトル又は赤外分光スペクトルである［６］記載のスイートスポットの予測方法。
［１３］　該質量分析法以外の分析方法が光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が構造色を示さない、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が構造色を示す、光学顕微鏡による分析結果である［８］記載のスイートスポットの予測方法。
［１４］　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、結晶表面に周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態が検出されない、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、結晶表面に周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態が検出される、共焦点レーザー顕微鏡による分析結果である［９］記載のスイートスポットの予測方法。
［１５］　試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後であって、マトリックスの溶液を載置する前に、測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤の溶液を該試料支持部材上に滴下して乾燥する工程を挿入する［２］ないし［１４］の何れかに記載のスイートスポットの予測方法。
　また、本発明は、
［１６］　試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後にマトリックスの溶液を載置し、又は試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて、該試料とマトリックスの混合結晶を析出させた後、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をしてからＭＡＬＤＩ質量分析をして、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果を予め特定しておき、
　次に、試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に該マトリックスの溶液を載置し、又は試料支持部材上に測定対象分子を含む試料と該マトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて、該試料と該マトリックスの混合結晶を析出させた後、該質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をし、スイートスポットになる該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、該検出された混合結晶の部分を対象としてレーザー脱離イオン化する、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、該検出された混合結晶の部分を対象としてレーザー脱離イオン化しないことを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析法を提供するものである。
　更に、本発明は以下のＭＡＬＤＩ質量分析法を提供するものである。
［１７］　該局所的な分析を、該混合結晶の全域又は一定の範囲に対して、繰り返し行い若しくはスキャンして、その分析結果をマッピングすることにより、スイートスポットになる該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出することを特徴とする［１６］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
［１８］　該質量分析法以外の分析方法が、結晶多形を識別する分析方法である［１６］又は［１７］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
［１９］　該質量分析法以外の分析方法が、分光スペクトル測定による分析方法である［１６］又は［１７］記載のスイートスポットの予測方法。
［２０］　該分光スペクトル測定が、ラマン分光スペクトル測定又は赤外分光スペクトル測定である［１９］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
［２１］　該質量分析法以外の分析方法が、Ｘ線回折測定による分析方法である［１６］又は［１７］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
［２２］
　該質量分析法以外の分析方法が、光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出による分析方法である［１６］又は［１７］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
［２３］
　該質量分析法以外の分析方法が結晶表面の周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態の検出である［１６］又は［１７］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
≪「顕微鏡法による」を削除しました。≫
［２４］　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定がラマン分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないラマン分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを有するラマン分光スペクトルである［２０］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
［２５］　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定が赤外分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを有する赤外分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない赤外分光スペクトルである［２０］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
［２６］　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定がラマン分光スペクトル測定又は赤外分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを有するラマン分光スペクトル又は赤外分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないラマン分光スペクトル又は赤外分光スペクトルである［２０］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
［２７］
　該質量分析法以外の分析方法が光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が構造色を示さない、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が構造色を示す、光学顕微鏡による分析結果である［２２］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
［２８］
　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、結晶表面に周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態が検出されない、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、結晶表面に周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態が検出される、共焦点レーザー顕微鏡による分析結果である［２３］記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
［２９］　試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後であって、マトリックスの溶液を載置する前に、測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤の溶液を該試料支持部材上に滴下して乾燥する工程を挿入する［１６］ないし［２８］の何れかに記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
　本発明によれば、前記問題点と課題を解決し、測定試料の善し悪しやスイートスポットがＭＡＬＤＩ質量分析法用の試料支持部材上のどの部分にあるかを経験によって探し出す必要がなくなり、誰でも短時間で効率良く質の高いＭＳスペクトルを得ることができる。それによって、自動分析への応用が可能となり、高スループットのＭＳ分析手法を提供することができる。
　特に、構造同定に必要な高感度ＭＳｎ（２≦ｎ）解析を可能にし、測定対象分子を含む試料の量が少ない、測定対象分子のイオン化効率が低い等の理由で従来は測定できなかった試料であっても、誰でも短時間で効率良く化学構造の決定が可能になる。
実施例で用いられた測定対象分子である糖ペプチドの化学構造を示す図である。 試料支持部材上の析出物の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す図である。 ２種類のラマン分光スペクトルを示す図である。　（ａ）標準品の「ＤＨＢＡ粉末」と、プレート（試料支持部材）上の結晶Ａで測定されたラマン分光スペクトルである。　（ｂ）プレート（試料支持部材）上の結晶Ｂで測定された標準品の「ＤＨＢＡ粉末」又は結晶Ａとは異なるラマン分光スペクトルである。 １１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルをもつ結晶Ａを白く表し、１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルをもたない結晶Ｂを黒く表した分析結果であるラマンイメージング画像である。 図４で黒く表された部分（結晶Ｂ）のマススペクトルを示す図である。 試料支持部材上をＭＳシグナルでスキャンした画像であり、イオン化効率が高い部分を示す図である。 図４で白く表された部分（結晶Ａ）のマススペクトルを示す図である。 ２種類の赤外分光スペクトルを示す図である。　（ａ）標準品の「ＤＨＢＡ粉末」と、プレート（試料支持部材）上の結晶Ａで測定された赤外分光スペクトルである。　（ｂ）プレート（試料支持部材）上の結晶Ｂで測定された標準品の「ＤＨＢＡ粉末」又は結晶Ａとは異なる赤外分光スペクトルである。 ２種類のＸ線回折を示す図である。　上のチャート：標準品の「ＤＨＢＡ粉末」と、プレート（試料支持部材）上の結晶Ａで測定されたＸ線回折である。　下のチャート：プレート（試料支持部材）上の結晶Ｂで測定された標準品の「ＤＨＢＡ粉末」又は結晶Ａとは異なるＸ線回折である。 実施例４で得た試料支持部材上の析出物の分析結果であるラマンイメージング画像と試料支持部材上をＭＳシグナルでスキャンした画像を示す図である。　（ａ）ラマン分光スペクトル測定の結果、１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルをもつ結晶Ａは緑色で表されたのでその部分を実線の楕円で囲み、１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルをもたない結晶Ｂは赤色で表されたのでその部分を破線の楕円で囲んで示したラマンイメージング画像である。　（ｂ）この試料支持部材上をＭＳシグナルでスキャンした画像であり、イオン化効率が高い部分を濃い灰色から黒で示す図である。 参考例１で得た「高純度ＤＨＢＡ粉末」の光学顕微鏡像、及びラマンスペクトル取得後、３０７６ｃｍ－１、１２０３ｃｍ－１、３２６９ｃｍ－１のシグナルの強弱のラマンイメージング画像を示す図である。　（ａ）光学顕微鏡像　（ｂ）３０７６ｃｍ－１の強弱のラマンイメージング画像　（ｃ）１２０３ｃｍ－１の強弱のラマンイメージング画像　（ｄ）３２６９ｃｍ－１の強弱のラマンイメージング画像 参考例２で得た「高純度ＤＨＢＡ粉末」を水で溶解後析出した結晶の光学顕微鏡像、及びラマンスペクトル取得後、３０７６ｃｍ－１、１２０３ｃｍ－１、３２６９ｃｍ－１のシグナルの強弱のラマンイメージング画像を示す図である。　（ａ）光学顕微鏡像　（ｂ）３０７６ｃｍ－１の強弱のラマンイメージング画像　（ｃ）１２０３ｃｍ－１の強弱のラマンイメージング画像　（ｄ）３２６９ｃｍ－１の強弱のラマンイメージング画像 実施例５で得た測定試料の光学顕微鏡像である。 実施例６で得た測定試料の共焦点レーザー顕微鏡像と試料支持部材上をＭＳシグナルでスキャンした画像である。　（ａ）測定試料の共焦点レーザー顕微鏡像　（ｂ）試料支持部材上をＭＳシグナルでスキャンした画像であり、イオン化効率が高い部分を示す図
　以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の具体的態様に限定されるものではなく、任意に変形して実施することができる。
　マトリックスはレーザーの光エネルギーを吸収して、共存する分析対象分子の脱離及びイオン化を達成する物質であれば液体及び固体を問わず種類は限定されないが、例えば、以下のものが挙げられる。
　１，８－ジアミノナフタレン（1,8-Diaminonaphthalene）（１，８－ＤＡＮ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸(2,5-Dihydroxybenzoic acid)（以下、「ＤＨＢＡ」と略記する場合がある）、１，８－アントラセンジカルボン酸ジメチルエステル（1,8-Anthracenedicarboxylic Acid Dimethyl ester）、ロイコキニザリン（Leucoquinizarin）、アントラロビン（Anthrarobin）、１，５－ジアミノナフタレン(1,5-Diaminonaphthalene)（１，５－ＤＡＮ）、６－アザ－２－チオチミン（6-Aza-2-thiothymine）、１，５－ジアミノアントラキノン（1,5-Diaminoanthraquinone）、１，６－ジアミノピレン（1,6-Diaminopyrene）、３，６－ジアミノカルバゾール（3,6-Diaminocarbazole）、１，８－アントラセンジカルボン酸（1,8-Anthracenedicarboxylic Acid）、ノルハルマン（Norharmane）、１－ピレンプロピルアミンハイドロクロライド（1-Pyrenepropylamine hydrochloride)、９－アミノフルオレンハイドロクロライド（9-Aminofluorene Hydrochloride）、フェルラ酸（Ferulic
acid）、ジトラノール（Dithranol）、２－（４－ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸(2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid)（ＨＡＢＡ）、trans－２－［３－（４－tert－ブチルフェニル）－２－メチル－２－プロペニリデン］マロンニトリル(trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malononitrile)（ＤＣＴＢ）、trans－４－フェニル－３－ブテン－２－オン(trans-4-Phenyl-3-buten-2-one)（ＴＰＢＯ）、trans－３－インドールアクリル酸(trans-3-Indoleacrylic
acid)（ＩＡＡ）、１，１０－フェナントロリン（1,10-Phenanthroline）、５－ニトロー１，１０－フェナントロリン（5-Nitro-1,10-phenanthroline）、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)（ＣＨＣＡ）、シナピン酸(Sinapic
acid)（ＳＡ）、２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン(2,4,6-Trihydroxyacetophenone)（ＴＨＡＰ）、３－ヒドロキシピコリン酸(3-Hydroxypicolinic acid)（ＨＰＡ）、アントラニル酸(Anthranilic
acid)、ニコチン酸(Nicotinic acid)、３－アミノキノリン(3-Aminoquinoline)、２－ヒドロキシ－５－メトキシ安息香酸(2-Hydroxy-5-methoxybenzoic
acid)、２，５－ジメトキシ安息香酸(2,5-Dimethoxybenzoic acid)、４，７－フェナントロリン(4,7-Phenanthroline)、ｐ－クマル酸(p-Coumaric acid)、１－イソキノリノール(1-Isoquinolinol)、２－ピコリン酸(2-Picolinic acid)、１－ピレンブタン酸ヒドラジド(1-Pyrenebutanoic acid, hydrazide)（ＰＢＨ）、１－ピレンブタン酸(1-Pyrenebutyric acid)（ＰＢＡ）、１－ピレンメチルアミンハイドロクロライド(1-Pyrenemethylamine hydrochloride)（ＰＭＡ）、３－ＡＣ（アミノキノリン）－ＣＨＣＡ(3-AC(aminoquinoline)-CHCA)。
　３－ＡＣ－ＣＨＣＡ等の液体マトリックスを用いた場合は、溶媒を揮発させても混合結晶ではなく混合物になるが、質量分析法以外の分析方法を用いて、該測定分子とマトリックス混合物の分析をし、該マトリックスの標準品とは異なる分析結果を呈する混合物の部分を検出して、混合物の善し悪しやその部分がスイートスポットであると予測することもできる。
　本発明においては、「ＭＡＬＤＩ質量分析法において、測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶を析出させた後、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をしてからＭＡＬＤＩ質量分析をして、スイートスポットにならない分析結果を与える該混合結晶と同じ結晶構造を有するマトリックスの結晶品」を、便宜上、「マトリックスの標準品」又は単に「標準品」と略記する。例えば、ＤＨＢＡをマトリックスとして用いて、測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶を析出させた後、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をしてからＭＡＬＤＩ質量分析をして、スイートスポットにならない分析結果を与える該混合結晶と同じ結晶構造を有するＤＨＢＡの結晶品を、便宜上、「ＤＨＢＡの標準品」又は単に「標準品」と略記する。また、「ＤＨＢＡの標準品」を、単に「ＤＨＢＡ粉末」と略記する場合がある。
＜試料とマトリックス混合結晶の析出又は混合物の生成＞
　本発明のスイートスポットの予測方法は、まず、ＭＡＬＤＩ質量分析法における測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶を析出させる。該混合結晶を析出させる方法は特に限定はないが、例えば、好ましい方法として、以下の（１）～（３）が挙げられる。
（１）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に、乾燥後又は乾燥する前にマトリックスの溶液を載置し、次いで、該溶液を乾燥させて、該混合結晶を析出させる方法。
（２）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、次いで、該溶液を乾燥させて、該混合結晶を析出させる方法。
（３）試料支持部材上に該マトリックスの溶液を載置し、次いで該溶液を乾燥させ該マトリックスの結晶を析出させた後、同一又は異なる化学構造を有するマトリックスと測定対象分子を含む溶液を重層し、次いで該溶液を乾燥させて混合物を生成させる方法。
　液体マトリックスの場合は例えば以下のようになる。
（１）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に、乾燥後又は乾燥する前にマトリックスの溶液を載置し、次いで、該混合溶液の溶媒を揮発させて、該混合物を生成させる方法。
（２）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、次いで、該混合溶液の溶媒を揮発させて、該混合物を生成させる方法。
　試料とマトリックスの混合結晶を析出させる方法として、特に好ましくは上記（１）又は（２）である。すなわち、
（１）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後にマトリックスの溶液を載置し、又は、
（２）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、
　次いで、該溶液を乾燥させて、該混合結晶を析出させる方法
＜＜（１）法＞＞
　上記（１）法は、本発明において特に好適な方法であり、測定対象分子を含む試料を先に試料支持部材上に存在させ、次いで、マトリックスの溶液（好ましくは実質的にマトリックスのみの溶液）を、該試料に重層し、試料を溶解させながら、試料支持部材（以下、「プレート」と略記することがある）上で乾燥させて、結晶を析出させる測定試料の調製方法である。
　上記（１）においては、マトリックス溶液をプレート上で乾燥する工程を、プレート上に物質を供給する工程の中では最終の工程とする。一般に、高いイオン生成量を得るためには試料とマトリックスがよく混合されなければならないにもかかわらず、最終の工程でプレートに供給する溶液の中に測定対象分子が溶解（含有）されていなくてもよいことを本発明者は見出した。
　そして、かかる（１）法によれば、質量分析法以外の分析方法を用いて該混合結晶の局所的な分析をした際に、該マトリックスの標準品とは異なる分析結果を呈する「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」を試料支持部材上に好適に現出させることが可能である。「異なる分析結果」とは、分析パターン全体を多変量解析してパターンが一致しない場合や、後述のように、特定の波数に着目して、その波数若しくは回折角でのシグナルピークの有無又はその相対的高低が異なる場合等がある。
　上記「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」が呈する、後記する質量分析法以外の分析方法による分析結果は、測定対象分子を含まないマトリックスの結晶（すなわち、マトリックスのみの結晶）でも呈する場合がある。従って、「測定対象分子を含む試料とマトリックス」と「マトリックス単独」では、物が異なるので、異なる分析結果が得られて当然という訳ではない。本発明は、マトリックスの標準品とは異なる分析結果を呈する「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」の部分が、スイートスポットになることを見出してなされたものであるが、マトリックスの標準品とは異なる分析結果は、マトリックス単独でも呈する場合があるので、測定対象分子を、直接「質量分析法以外の分析方法」によって分析することによって、「異なる分析結果」としている訳ではない。
　物質をプレート上に載置するための実質的な最終工程に、マトリックスのみの溶液を用いる場合、該溶液の溶媒は、測定対象分子と該マトリックスの何れをも溶解できる溶媒であることが好ましい。下層に既にある測定対象分子を溶解して、マトリックスと混合させることができるからである。
　上記（１）法は、以下の、工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を必須の工程として含むことが好ましい。
（Ａ）測定対象分子を含む試料の溶液をプレート上で乾燥する工程と、その後に、
（Ｂ）マトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を、上記プレートに滴下する工程
　工程（Ａ）では、測定対象分子を含む試料の溶液をプレート上で乾燥する。このときの溶液は、測定対象分子を含有してさえいればよく、マトリックスは含有されていてもいなくてもよい。ただし、測定対象分子を含む試料が極微量の場合、測定対象分子を含む試料の良溶媒がマトリックスの貧溶媒であり、そのマトリックスや溶媒を用いたい場合、マトリックスが溶解した溶媒に対して試料が不安定でありストック溶液として保管若しくは使用ができない又は取り扱いが難しくなる場合等には、測定試料の調製が容易である点、溶媒の選択幅が広がる点、試料の分解や容器への吸着を抑制できる点等のため、このときの溶液中にはマトリクスが溶解されておらず、測定対象分子を含む試料のみが溶解されている方が好ましい。
　その際の溶媒としては、測定対象分子を含む試料を溶解しさえすれば特に限定はなく、マトリックスを溶解させる性質は有していなくてもよいし、常圧における沸点が高く、蒸発（乾燥）速度は遅くてもよい。測定対象分子又は測定対象分子を含む試料が水溶性であるならば、工程（Ａ）で用いる溶媒は水単独が特に好ましい。測定対象分子を含む試料が糖であるならば、工程（Ａ）で用いる溶媒は水単独が最も好ましい。マトリックスを溶解させないので、マトリックスに対する溶解度は低くてもよく、そのため測定対象分子又は測定対象分子を含む試料に最も好適な溶媒が選択できる。
　工程（Ａ）における上記溶液中における測定対象分子の濃度は特に限定はないが、１ａｍｏｌ／μＬ～１μｍｏｌ／μＬが好ましく、１００ａｍｏｌ／μＬ～１ｎｍｏｌ／μＬが特に好ましい。工程（Ａ）終了後に（乾燥後に）、プレート上に存在する測定対象分子を含有する層の厚さは特に限定はないが、５μｍ以下が好ましく、１μｍ以下が特に好ましい。かかる層の厚さが厚すぎると、マトリックス溶液を滴下した場合にマトリックス分子とうまく混和しない可能性があり、ＭＳシグナル強度が低下する場合がある。
　（１）法は、「測定対象分子を含む試料」の溶液をまずプレートに滴下するので、測定対象分子を含む試料が極めて微量である場合に、別の容器でマトリックス溶液と混合しその一部をプレートに滴下することなく、微量試料のほとんど全量を分析に供することができるため特に有用である。測定対象分子を含む試料が１０００ｆｍｏｌ以下の場合により有用であり、３００ｆｍｏｌ以下の場合に特に有用であり、１００ｆｍｏｌ（例えば、１００ｆｍｏｌ／μＬに溶解した水溶液を１μＬ滴下する等によりプレート上に１００ｆｍｏｌ載せる）以下の場合に更に有用である。
　（１）法においては、工程（Ａ）の後に、（Ｂ）マトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を上記プレートに滴下する工程を有する。「工程（Ａ）の後に」の意味は、「工程（Ａ）の直後に」には限定されず、工程（Ａ）と工程（Ｂ）の間に、他の工程が挿入されていてもよい。「他の工程」としては、例えば、後述する工程（Ｃ）が挙げられる。
　工程（Ｂ）では、実質的にマトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を上記プレートに滴下するが、測定対象分子と該マトリックスの何れをも溶解できる溶媒を用いることによって、下層の測定対象分子がマトリックス分子と混和し、マトリックスの標準品とは異なる分析結果を呈する混合結晶が現出し、そこが優れたスイートスポットになり得る。
＜＜＜誘導体化＞＞＞
　（１）法においては、上記工程（Ａ）と工程（Ｂ）の間に、
（Ｃ）測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤の溶液を、上記プレートに滴下して乾燥する工程
を含むことが、イオン化効率を更に高めるために好ましい。
　すなわち、（Ａ）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後であって、（Ｂ）マトリックスの溶液を載置する前に、（Ｃ）測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤の溶液を該試料支持部材上に滴下して乾燥する工程を挿入するＭＡＬＤＩ質量分析法は、イオン化効率が更に高くなるために好ましい。
　測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤（以下、単に「誘導体化剤」と略記する）を、予め測定対象分子と反応させてから、プレートに供給すると、測定試料のロスに繋がる場合がある。従って、糖、糖タンパク質、糖ペプチド等の微量な「生体由来の分子又は生体試料中の分子」に質量分析法を適用する場合、工程（Ａ）と工程（Ｂ）の間に工程（Ｃ）を挿入することが特に好ましい。
　誘導体化剤は、誘導体化された測定対象分子すなわち質量分析に供される分子のイオン化効率を高めるものであれば特に限定はない。誘導体化剤は、ＭＡＬＤＩ質量分析法におけるマトリックスとしての効果を有する化合物、又はそれらに後記する反応性官能基やスペーサ部分を更に有する化合物も好ましい。
　かかる誘導体化剤の化学構造は上記効果を奏するものであれば特に限定はないが、その分子内にナフタレン、アントラセン、ピレン等の縮合多環を有する縮合多環化合物等が上記効果を好適に奏するので特に好ましい。ここで「縮合多環化合物」とは、窒素、硫黄又は酸素分子を含む複素環を一部に含んでいてもよい縮合多環部分と、測定対象分子とを結合することが可能である反応性官能基と、要すれば、該縮合多環部分と該反応性官能基とを連結するスぺーサー部分とを有する化合物をいう。特に、芳香族環を有する化合物であることが好ましい。
　誘導体化剤は、測定対象分子に反応することによって、誘導体化された分子すなわち質量分析に供される分子の、イオン化切断位置を制御できるようにするものであることが特に好ましい。
　誘導体化剤は、アミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基、スクシニミジルエステル基、塩化スルホニル基、ヨード基（－Ｉ）等の反応性官能基を有することが好ましい。特に好ましい誘導体化剤としては、具体的には、ナフタレン環、アントラセン環、ピレン環等の縮合多環に、上記基が直接若しくは他の基（スペーサ部分）を介して結合した縮合多環誘導体化合物；ヨウ化メチル；ジアゾメタン；トリメチルシリルジアゾメタン等が挙げられる。
　このうち、誘導体化された分子すなわち質量分析に供される分子のイオン化効率を高めたり、イオン化切断位置を制御できるようにしたりする点等で、ピレン環化合物が特に好ましい。ここで「ピレン環化合物」とは、ピレン環と、「測定対象分子」に結合することが可能である反応性官能基と、要すれば該ピレン環と該反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物をいう。
　具体的には、１－ピレンブタン酸ヒドラジド（1-pyrenebutanoic acid, hydrazide）（以下、「ＰＢＨ」と略記する）、１－ピレン酢酸ヒドラジド（1-pyreneacetic acid, hydrazide）、１－ピレンプロピオン酸ヒドラジド（1-pyrenepropionic acid, hydrazide）、１－ピレン酢酸スクシニミジルエステル（1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester）、１－ピレンプロピオン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester）、１－ピレンブタン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester）、Ｎ－（１－ピレンブタノイル）システイン酸スクシニミジルエステル（N-(1-pyrenebutanoyl)cysteic acid, succinimidyl ester）、Ｎ－（１－ピレン）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrene) iodoacetamide）、Ｎ－（１－ピレン）ヨードマレイミド（N-(1-pyrene) maleimide）、Ｎ－（１－ピレンメチル）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrenemethyl) iodoacetamide）、１－ピレンメチルヨードアセテート（1-pyrenemethyl iodoacetate）、アミノピレン（aminopyrene）、１－ピレンメチルアミン（1-pyrenemethyl amine）、１－ピレンプロピルアミン（3-(1-pyrenyl)propylamine）、１－ピレンブチルアミン（4-(1-pyrenyl)butylamine）、１－ピレンスルホン酸クロリド（1-pyrenesμＬfonyl chloride）、１－ピレニルジアゾメタン（1-pyrenyldiazomethane）（以下、「ＰＤＡＭ」と略記する）、１－ピレンカルバルデヒド　ヒドラゾン（1-pyrenecarbaldehyde hydrazone）、１－ピレニルチオシアネート（1-pyrenylthiocyanate）、１－ピレニルイソチオシアネート（1-pyrenylisothiocyanate）等が好ましいものとして挙げられる。このうち最も好ましくはＰＢＨ又はＰＤＡＭである。
　誘導体化剤としては、上記具体的化合物において、ピレン環を、ナフタレン環又はアントラセン環に代えたものも好ましいものとして挙げられる。また、ヨウ化メチル、ジアゾメタン又はトリメチルシリルジアゾメタンも好ましい。
　好ましい「測定対象分子と誘導体化剤との組み合わせ」としては、測定対象分子がアルデヒド基を含有する糖鎖を有する分子であり、誘導体化剤がアミノ基又はヒドラジド基等を有するものである場合が挙げられる。また、好ましい組み合わせとしては、測定対象分子が、カルボキシル基、アミノ基又はメルカプト基を有するタンパク質若しくは糖タンパク質であり、誘導体化剤が、アミノ基、ヒドラジド基又はジアゾメチル基等を有するものである場合が挙げられ、更に、測定対象分子が、カルボキシル基を有するタンパク質若しくは糖タンパク質であり、誘導体化剤がヨウ化メチル又はトリメチルシリルジアゾメタンである場合が挙げられる。これらの組み合わせは、測定対象分子及び誘導体化剤を、容易にプレート上で反応させることができる点、イオン化を阻害しない点、反応が選択的である点、一般に微量での分析の必要性が高いので、前記効果を奏し易い点等から好ましい。
＜＜（２）法＞＞
　（２）試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて、試料支持部材上に該混合結晶を析出させる方法も好ましい。かかる（２）の測定試料の調製方法は、「Ｄｒｉｅｄ　Ｄｒｏｐｌｅｔ法」として知られているものである。（１）の調製方法で、試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に、乾燥する前にマトリックスの溶液を載置する方法も同様である。
　この（２）法によっても、試料支持部材上に、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をした際に、該マトリックスの標準品とは異なる分析結果を呈する「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」を現出させ得る。また、（２）法においても測定対象分子の誘導体化を行ってもよい。
＜質量分析法以外の分析方法による局所的な分析＞
　本発明のスイートスポットの予測方法においては、ＭＡＬＤＩ質量分析法において、測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶を析出させた後、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をしてからＭＡＬＤＩ質量分析をして、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果を予め特定しておき、
　次に、測定対象分子を含む試料と該マトリックスの混合結晶を析出させた後、該質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をし、該「スイートスポットになる該混合結晶の部分の該分析結果」を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットであると予測する、及び／又は、該「スイートスポットにならない該混合結晶の部分の該分析結果」を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットでないと予測することを特徴とする。
　本発明の「スイートスポットの予測方法」には、「ある部分がスイートスポットであると予測すること」及び／又は「ある部分がスイートスポットでないと予測すること」を含む。
　また、本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、該検出された「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」の部分を対象としてレーザー脱離イオン化することを特徴とする。すなわち、本発明のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、スイートスポットになる「該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分」を検出して、該検出された混合結晶の部分を対象としてレーザー脱離イオン化する、及び／又は、スイートスポットにならない「該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分」を検出して、該検出された混合結晶の部分を対象としてレーザー脱離イオン化しないことを特徴とする。
　従来、図６に示したように、試料支持部材上の混合物である測定試料の全域に対して、質量分析法を用いて、該混合物の局所的な分析をして、イオン化効率の高い場所を探索する手法はあった。例えば、イオン化のためのレーザーパワーを測定対象分子のイオンのシグナルがではじめる閾値に最適化した後、試料支持部材上の測定試料の全域に対して、レーザーのスキャニング照射を行い、スイートスポットをマッピングする方法はあった。
　しかしながら、質量分析法を用いてスイートスポットを見付け出す方法は、そのために一旦試料をイオン化させてしまうので、そもそも、その試料支持部材上の測定試料をフレッシュの状態で、本番のＭＳスペクトルがとれない場合があり、更には、特に極微量の試料を扱う場合は、スイートスポットの探索時に試料のほとんどが消費されてしまい、それ以降のＭＳスペクトルの取得や、構造情報取得のためのＭＳｎ（２≦ｎ）スペクトルの取得が不可能な場合もある。
　本発明における「質量分析法以外の分析方法」は、特に限定はないが非破壊の分析方法であることが、分析された試料が載っているプレートそのままをＭＡＬＤＩ質量分析に供することができる点で好ましい。上記「非破壊」とは、形状のみならず、物性等も実質的に変質させないことを意味する。
　「質量分析法以外の分析方法」によって、「スイートスポットにはなり得ない又はスイートスポットである可能性が極めて低い」と判断されたマトリックスの結晶部分については、ＭＳスペクトルを取得する場所として除外し、「スイートスポットにはなり得る又はスイートスポットである可能性が高い」と判断されたマトリックスの結晶部分についてのみレーザーを照射してレーザー脱離イオン化すれば、効率よく良好なＭＳスペクトルを得ることが可能となる。
　本発明における「質量分析法以外の分析方法」は特に限定はないが、「結晶多形を識別する分析方法」；「分光スペクトル測定による分析方法」；「Ｘ線回折測定による分析方法」；「光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出による分析方法」、「結晶表面の周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態の検出による分析方法」等の「顕微鏡法による結晶表面の規則的構造を検出する分析方法」；等が、ＭＡＬＤＩ質量分析法におけるスイートスポットがあった場合、その部分で、マトリックスの標準品とは異なる分析結果を呈し易く、スイートスポットを見つけ易い点で好ましい。すなわち、上記の分析方法を用いて、試料支持部材上をスキャンさせた場合に、マトリックスの標準品とは異なる分析結果を呈する場所を特定することができ、その場所がＭＡＬＤＩ質量分析法におけるスイートスポットになっている場合が多いために上記の分析方法が好ましい。上記の分析方法は、具体的には重複している場合がある。
≪「顕微鏡法による」を削除しました。≫
　ここで、「異なる分析結果」とは、分光スペクトル全体やＸ線回折パターン全体を多変量解析してパターンが一致しない場合や、後述のように、ある特定の（１つ又は複数の)波数に着目して、その波数若しくは回折角でのシグナルピーク有無又はその相対的高低が異なる場合、結晶表面における構造色の検出の有無、結晶表面の周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態の検出の有無等がある。
　また、これらの「質量分析法以外の分析方法」は、形状、物性等を実質的に変化させないので、分析後の「試料支持部材上の試料」を、そのままＭＡＬＤＩ質量分析に供することができるので好ましい。
　上記の「結晶多形を識別する分析方法」には、分光スペクトル測定（ラマン分光、赤外分光等）、Ｘ線回折測定、中性子回折測定、電子線回折測定、顕微鏡法、複屈折測定、熱分析、水蒸気吸着測定等による分析方法がある。
　上記の「分光スペクトル測定」としては、ラマン分光スペクトル測定又は赤外分光スペクトル測定であることが、上記した理由で特に好ましい。
＜＜ラマン分光スペクトル測定＞＞
　ラマン分光スペクトル測定の具体的測定方法は特に限定はなく、公知の方法が用いられるが、本発明においては、一箇所の局所的なラマンスペクトルのみを取得するのではなく、複数の結晶を局所的にラマン測定しつつ走査し、ラマンイメージングを行うことがより明確にスイートスポットを予測できる点で好ましい。
　本発明のスイートスポットの予測方法においては、ラマン分光スペクトル測定を用いて、該混合結晶の局所的な分析をし、該マトリックスの標準品の結晶（以下、「結晶Ａ」と略記する場合がある）とは異なる分析結果を呈する「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」（以下、「結晶Ｂ」と略記する場合がある）の部分を検出して、その部分をスイートスポットであると予測することが好ましい。
　又は、ラマン分光スペクトル測定を用いて、該混合結晶の局所的な分析をし、複数の結晶のパターンが確認された場合、他の結晶とは異なる分析結果を呈する「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」（以下、「結晶Ｂ」と略記する場合がある）の部分を検出して、その部分をスイートスポットであると予測することが好ましい。
　その後、その部分をレーザー脱離イオン化してＭＡＬＤＩ質量分析をすることが好ましい。具体的には、試料支持部材上のマトリックス結晶の全域にわたり、局所的にラマン分光スペクトルを測定し、例えば、異なる波数にシグナルピークを有する等、結晶Ａとは異なる分析結果を呈する「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」の部分（結晶Ｂ）を検出して、（好ましくは、結晶Ｂの部分をマッピングして又は両方の結晶の部分を分けてマッピングして、イメージ画像を作成して）、結晶Ｂの部分をレーザー脱離イオン化することが特に好ましい。
　試料支持部材上のマトリックス結晶のいくつかの場所についてラマン分光スペクトルを測定し、その中に、「標準品（結晶Ａ）」とは異なる波数にシグナルピークを有する場所があった場合、かかる「異なる波数」に着目し、「異なる波数」にシグナルピークを有する部分（結晶Ｂの部分）のラマンイメージング画像を得て、該ラマンイメージング画像に表された結晶Ｂの部分をスイートスポットであると予測することが好ましい。そして、その中の適当な場所にレーザーを照射してレーザー脱離イオン化して質量分析することが好ましい。
　また、それとは逆に、「標準品（結晶Ａ）」の示すシグナルピークの波数にシグナルピークを有さない場所があった場合、かかる「異なる波数」に着目し、「異なる波数」にシグナルピークを有さない部分（結晶Ｂの部分）のラマンイメージング画像を得て、該ラマンイメージング画像に表された結晶Ｂの部分をスイートスポットであると予測することが好ましい。そして、その中の適当な場所にレーザーを照射してレーザー脱離イオン化して質量分析することが好ましい。
　ラマンイメージング画像の例として、マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）の場合について、１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルをもたない結晶Ｂを黒く表したラマンイメージング画像を図４に示す。図４では、スイートスポットが存在する結晶Ｂの部分が、黒く明確に示されている。一方、１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルをもつ結晶Ａの部分は白く明確に示されており、そこにはスイートスポットが存在しないので、その部分を測定することは無駄であることが分かる。ＭＡＬＤＩ質量分析法においては、まずスイートスポットを探すことが質の高いマススペクトルを得るために必要となるが、本発明によれば、スイートスポットが結晶のどの部分であるかを経験に頼って試行錯誤的に探すという操作から脱却することができる。
　ここで、「付近」とは、測定機器の分解能や波数にもよるが、±５～±１０ｃｍ－１の範囲を示す。
　本発明で用いられるマトリックスの種類は特に限定はなく、ＭＡＬＤＩ質量分析法に用いられるマトリックスならば何れも用いられるが、好ましくは２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）である。
　本発明の特に好ましい態様は、該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該質量分析法以外の分析方法がラマン分光スペクトル測定による分析方法であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないラマン分光スペクトルである上記のスイートスポットの予測方法である。
　また、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを有するラマン分光スペクトルである上記のスイートスポットの予測方法である。
　また、本発明の特に好ましい態様は、用いるマトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であるＭＡＬＤＩ質量分析法であって、ラマン分光スペクトル測定で得られたラマン分光スペクトルにおいて、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない試料支持部材上の結晶部分を対象としてレーザー脱離イオン化するＭＡＬＤＩ質量分析法である。
　また、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有する試料支持部材上の結晶部分を対象としてレーザー脱離イオン化しないＭＡＬＤＩ質量分析法である。
　ＤＨＢＡの結晶Ｂの部分のラマン分光スペクトルでは、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に示さないか、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に示さないか、又は１３０７ｃｍ－１付近に実質的にシグナルを示さない。従って、３７６ｃｍ－１付近に実質的にシグナルを示さない部分のラマンイメージング画像を得たり、１１９９ｃｍ－１付近に実質的にシグナルを示さない部分のラマンイメージング画像を得たり、１３０７ｃｍ－１付近に実質的にシグナルを示さない部分のラマンイメージング画像を得たりすれば、示された部分にスイートスポットがある。
　逆に、ＤＨＢＡの結晶Ａの部分のラマン分光スペクトルでは、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを有するか、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを有するか、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを有する。従って、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを示す部分のラマンイメージング画像を得たり、１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを示す部分のラマンイメージング画像を得たり、１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを示す部分のラマンイメージング画像を得たりすれば、示された部分にはスイートスポットがない。
　更に、本発明の特に好ましい態様は、該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該質量分析法以外の分析方法がラマン分光スペクトル測定による分析方法であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを有する赤外分光スペクトルである上記のスイートスポットの予測方法である。
　また、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないラマン分光スペクトルである上記のスイートスポットの予測方法である。
　また、用いるマトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であるＭＡＬＤＩ質量分析法であって、ラマン分光スペクトル測定で得られたラマン分光スペクトルにおいて、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを有する試料支持部材上の結晶部分を対象としてレーザー脱離イオン化するＭＡＬＤＩ質量分析法である。
　また、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない試料支持部材上の結晶部分を対象としてレーザー脱離イオン化しないＭＡＬＤＩ質量分析法である。
　ＤＨＢＡの結晶Ｂの部分のラマン分光スペクトルでは、３２６５ｃｍ－１付近に強いシグナルを示す。従って、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを示す部分のラマンイメージング画像を得れば、その示された部分にスイートスポットがある。また、逆に、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に示さない部分のラマンイメージング画像を得れば、その示された部分にはスイートスポットがない。
＜＜赤外分光スペクトル測定＞＞
　「分光スペクトル測定」としては、上記したラマン分光スペクトル測定に代えて、赤外分光スペクトル測定を行ってもよい。
　赤外分光スペクトル測定の具体的方法は特に限定はなく、公知の方法が用いられるが、ＦＴ－ＩＲ（Fourier transform infrared spectroscopy）が好ましい。また、顕微赤外分光スペクトル測定が、混合結晶の局所的な分析のために必要である。また、一箇所の局所的なＦＴ－ＩＲスペクトルのみを取得するのではなく、複数の結晶をＦＴ－ＩＲ測定で走査し、ＩＲイメージングを行うことが、より明確にスイートスポットを予測できる点で好ましい。
　本発明の特に好ましい態様は、用いるマトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定が赤外分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを有する赤外分光スペクトルである上記のスイートスポットの予測方法である。
　また、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない赤外分光スペクトルである上記のスイートスポットの予測方法である。
　ここで、「付近」とは、測定機器の分解能や波数にもよるが、±５～±１０ｃｍ－１の範囲を示す。
　また、用いるマトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であるＭＡＬＤＩ質量分析法であって、赤外分光スペクトル測定で得られた赤外分光スペクトルにおいて、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを有する試料支持部材上の結晶部分を対象としてレーザー脱離イオン化する上記のＭＡＬＤＩ質量分析法である。
　また、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない試料支持部材上の結晶部分を対象としてレーザー脱離イオン化しないＭＡＬＤＩ質量分析法である。
　結晶Ｂの部分は、赤外分光スペクトルにおいて、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないか、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを有し、一方、結晶Ａの部分は、赤外分光スペクトルにおいて、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを有するか、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないからである。
　更に、本発明の特に好ましい態様は、該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該質量分析法以外の分析方法が赤外分光スペクトル測定による分析方法であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを有する赤外分光スペクトルである上記のスイートスポットの予測方法である。
　また、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない赤外分光スペクトルである上記のスイートスポットの予測方法である。
　また、用いるマトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であるＭＡＬＤＩ質量分析法であって、赤外分光スペクトル測定で得られた赤外分光スペクトルにおいて、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを有する試料支持部材上の結晶部分を対象としてレーザー脱離イオン化するＭＡＬＤＩ質量分析法である。
　また、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない試料支持部材上の結晶部分を対象としてレーザー脱離イオン化しないＭＡＬＤＩ質量分析法である。
　結晶Ｂの部分は、赤外分光スペクトルにおいて、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを有し、一方、結晶Ａの部分は、赤外分光スペクトルにおいて、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないからである。
＜＜Ｘ線回折測定＞＞
　本発明においては、上記したラマン分光スペクトル測定による分析や、赤外分光スペクトル測定による分析に代えて、Ｘ線回折測定による分析方法を用いてもよい。
　Ｘ線回折測定による分析方法の具体的方法は特に限定はなく、公知の方法が用いられるが、本発明においては、一箇所の局所的なＸ線回折スペクトルのみを取得するのではなく、複数の結晶をＸ線回折測定で走査し、Ｘ線イメージングを行うことがより明確にスイートスポットを予測できる点で好ましい。
　ＣｕＫα線を照射してＸ線回折を測定したとき、例えば、用いるマトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）の場合、ＭＳシグナルが良好な結晶部分には、ＭＳシグナルが乏しい結晶部分にはない、２θ＝２５．５°、１９．７°、１７．５°、１６．３°、１５．８°付近に回折ピークが見られた。従って、２θ＝２５．５°、１９．７°、１７．５°、１６．３°又は１５．８°付近に回折ピークを有する結晶部分に、ＭＳのスイートスポットがあることが、ＭＳ測定の前に予め予想できる。その結晶部分を対象としてレーザー脱離イオン化すれば、良好なＭＳスペクトルが容易にとれる。ここで、「付近」とは、２θで、測定機器の分解能にもよるが、±３°の範囲を示す。
＜＜光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出による分析方法＞＞
　本発明においては、光学顕微鏡法を使用して、結晶表面の構造色の検出する分析方法を用いてもよい。本発明における「構造色」とは、色素等の色のような光の吸収による色ではなく、結晶表面のｎｍレベルの凹凸、ｎｍレベルの多層構造等、周期的な構造に照射された光の屈折、回折、散乱、干渉等の光学現象が原因となって発現される色のことをいう。
　本発明における該混合結晶は、光の吸収という点からは実質的には無彩色であるが、スイートスポットにならない該混合結晶の部分は、結晶表面の微細な（ｎｍレベルの）周期的な構造により、上記の光学現象を引き起こし、光学顕微鏡法により、青色、緑色、赤色、黄色又はそれらの中間色の色彩若しくは色彩模様を、視覚的に認識することが可能である。一方、スイートスポットになる該混合結晶の部分は、結晶表面の微細な（ｎｍレベルの）周期的な構造による上記の光学現象が起こらず、光学顕微鏡法により、色彩若しくは色彩模様がないことを、視覚的に認識することが可能である。
　すなわち、本発明において、「該質量分析法以外の分析方法」が光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が構造色を示さない、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が構造色を示す、というようにして、スイートスポットを予測することが好ましい。
　光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出の手法には特に限定はなく、公知の方法が用いられるが、本発明においては、反射型の光学顕微鏡を使用して構造色の有無を観測することが好ましい。また、偏光フィルター等を内蔵する偏光顕微鏡を用い、照射光及び／又は測定光を偏光とすることも、正反射光を遮断して構造色を検出し易くするために好ましく、クロスニコル偏光条件での観察が、極めて構造色の有無を判定し易くするために特に好ましい。
　マトリックスの種類は特に限定はなく、ＭＡＬＤＩ質量分析法に用いられるマトリックスならば何れも用いられるが、好ましくは２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）である。
　この方法は、結晶表面の規則的な構造によって生じる反射光の干渉、すなわち結晶表面のｎｍレベルの微細構造に基づく構造色の変化若しくは有無を利用して、スイートスポットを、簡便、迅速、明確に予測できる点で特に好ましい。
　光学顕微鏡による分析結果が構造色を示さない部分を、スイートスポットになる混合結晶の部分であると予測し、光学顕微鏡による分析結果が構造色を示す部分を、スイートスポットにならない混合結晶の部分であると予測することが好ましい。
　すなわち、スイートスポットになる混合結晶の部分の分析結果が、構造色を示さない光学顕微鏡による分析結果であるスイートスポットの予測方法が好ましく、スイートスポットにならない混合結晶の部分の分析結果が、構造色を示す光学顕微鏡による分析結果であるスイートスポットの予測方法が好ましい。
＜＜結晶表面における、「周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態」の検出による分析方法＞＞
　また、本発明では、「該質量分析法以外の分析方法」が、結晶表面の「周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態」（以下、括弧内を単に、「凹凸状態」と略記する場合がある）の検出であることが好ましい。
≪「顕微鏡法による」を削除しました。≫
　スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、結晶表面に凹凸状態が検出されない、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、結晶表面に凹凸状態が検出される、スイートスポットの予測方法が好ましい。すなわち、結晶表面に凹凸状態が検出されない部分をスイートスポットになると予想し、結晶表面に凹凸状態が検出される部分をスイートスポットにならないと予想して、スイートスポットにのみレーザーを照射してレーザー脱離イオン化すれば、効率よく良好なＭＳスペクトルを得ることが可能となる。この方法は、結晶表面の規則的な構造を観測して、スイートスポットを、簡便、迅速、明確に予測できる点で特に好ましい。
　「凹凸状態」、すなわち「周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態」は、結晶表面の規則的な構造であることが好ましい。また、凸部の高さは特に限定はないが、１μｍ～１０μｍが好ましく、２μｍ～５μｍが特に好ましい。また、「凹凸状態」の凹凸の周期は、２μｍ～５μｍが好ましい。
　結晶表面の凹凸状態の検出は、１０μｍ以下の周期的な凹凸が識別できればその検出方法には特に限定はないが、顕微鏡を用いて行うことが好ましく、光学顕微鏡を用いて行うことがより好ましく、共焦点レーザー顕微鏡を用いて行うことが特に好ましい。共焦点レーザー顕微鏡を使用して、結晶表面の立体的な観察を行なえば、規則的な凹凸状態を直接観測することができるために特に好ましい。
≪水色字部、追記しました。≫
　マトリックスの種類は特に限定はなく、ＭＡＬＤＩ質量分析法に用いられるマトリックスならば何れも用いられるが、好ましくは２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）である。
＜測定対象分子＞
　本発明のスイートスポットの予測方法及びＭＡＬＤＩ質量分析法が適用される測定対象分子は特に限定はないが、生体由来の分子又は生体試料中の分子であることが好ましく、具体的には、糖、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、糖脂質等であることが、本発明の効果をより発揮できるので好ましい。「測定対象分子」としては、天然物から調製されるもの、天然物を化学的又は酵素学的に一部改変して調製されるものの他、化学的又は酵素学的に調製されるものも好ましい。また、生体に含まれる分子の部分構造を有するものや生体に含まれる分子を模倣して作製されたものも好ましい。
　また、質量分析法に用いるプレート上に載せる試料、すなわち、測定対象分子を含む試料としては、「測定対象分子」そのものだけでもよいし、「測定対象分子」を含むもの、例えば、生体の組織、細胞、体液や分泌物（例えば、血液、血清、尿、精液、唾液、涙液、汗、糞便等）等でもよい。すなわち、直接生体試料を用いてもよい。また、試料をプレート上に載せ、酵素処理等を行なって、測定対象分子を調製してもよい。
　上記した分子は、分析に供される試料が少量である場合が多く、また特に、糖、糖タンパク質、糖脂質等の複合糖質等又はそれらから化学的若しくは酵素学的に遊離させて得たものは、分子量や組成が同一の異性体が複数存在するので、スイートスポットが容易に見つからずに測定を断念していた場合も多く、本発明のスイートスポットの予測方法及びＭＡＬＤＩ質量分析法は、それら分子の化学構造解析に対して特に上記効果を奏するので好ましい。
＜質量分析装置＞
　イオン化に用いられるレーザーとしては、窒素レーザー（３３７ｎｍ）、ＹＡＧレーザー３倍波（３５５ｎｍ）、ＮｄＹＡＧレーザー（２５６ｎｍ）、炭酸ガスレーザー（２９４０ｎｍ）等が挙げられるが、窒素レーザーが好ましい。イオンの分離検出方法は特に限定はなく、二重収束法、四重極集束法（四重極（Ｑ）フィルター法）、タンデム型四重極（ＱＱ）法、イオントラップ法、飛行時間（ＴＯＦ）法等を用いて、イオン化した分子を質量／電荷比（ｍ／ｚ）に従って分離し検出する。好ましくは、ＱＩＴ－ＴＯＦである。
　糖、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、糖脂質等の分子は、分子量や組成が同じ異性体を多く含むので、イオンの生成効率を向上させ、分子のフラグメント化をｎ回繰り返す方法（ＭＳｎ法）が好ましい。本発明は、検出された「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」の部分に対し、フラグメント化をｎ回繰り返すＭＳｎ法（２≦ｎ）を適用することが好ましい。ＭＳｎ法により、例えば分子中の結合位置等を決定できる。
＜作用・原理＞
　本発明における結晶Ｂの部分に優れたスイートスポットが存在する作用・原理は明確ではないが、以下のようにも考えられる。ただし、本発明は、以下の作用・原理の及ぶ範囲に限定されるものではない。すなわち、マトリックスの再結晶精製された、測定対象分子が含まれない粉末（マトリックスの標準品）とは異なる分析結果を呈する「測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶」（結晶Ｂ）の部分は、マトリックス結晶の中で測定対象分子の存在に影響を与えているということであり、その結晶内にはマトリックスの標準品と同様の分析結果を呈するマトリックス結晶よりもより多くの試料対象分子を含んでいると考えられる。そのために、その結晶は測定対象分子の効率的なイオン化がなされるスイートスポットになり得ると考えられる。又は、結晶Ｂの部分は、マトリックスの標準品と同様の分析結果を呈するマトリックス結晶と比べ、結晶の構造が粗雑であり、マトリックス結晶化の際により多くの試料対象分子を含有し易く、結果としてスイートスポットになり得ると考えられる。
　以下に、実施例および比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
　まず、シリコン基板に金を蒸着させた金基板（試料支持部材）に、測定対象分子である糖ペプチド１（化学構造を図１に示す）を水に溶解して、５００ｆｍｏｌ／μＬにした水溶液を１μＬ滴下し、室温（２３℃）、大気圧下で放置し乾燥させた。
　次に、標識試薬であるＰＤＡＭ（１－ｐｙｒｅｎｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）をＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＳＩＧＭＡ社製）に溶解させ、２ｎｍｏｌ／μＬにした溶液を０．２５μＬ滴下し、ヒートブロック上で、８０℃、大気圧下に放置し乾燥させた。余剰標識試薬を除くため、トルエン（ＳＩＧＭＡ社製）に浸し余剰のＰＤＡＭを除去し十分に乾燥させた。
　次に、マトリックスの再結晶精製された粉末であるＤＨＢＡの標準品（ＤＨＢＡ粉末）である、高純度ＤＨＢＡ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を水に溶解して１０ｍｇ／ｍＬにした水溶液を０．７５μＬ滴下し、室温（２３℃）大気圧下で放置し乾燥させた。この測定試料析出物の共焦点レーザー顕微鏡写真を図２に示す。
　このプレート（試料支持部材）上の物質のラマンイメージング画像を取得するため、ｉｎＶｉａラマンマイクロスコープ（株式会社レニショー社製）を用い、波長５３２ｎｍの励起レーザー条件下でラマン測定を行った。比較として、「ＤＨＢＡ粉末」も同様にラマン測定を行った。「ＤＨＢＡ粉末」のラマンスペクトルを図３（ａ）に示す。
　上記「ＤＨＢＡ粉末」のラマンスペクトルと、上記「測定試料析出物」のラマンスペクトルを、まず、多変量解析によってスペクトルのパターンを比較したところ、「測定試料析出物」では、プレート（試料支持部材）上での測定場所が異なると異なるラマンスペクトルが得られる場合があった。すなわち、プレート（試料支持部材）上で析出したＤＨＢＡの結晶ごとに特有のラマンスペクトルが得られた。そして、「測定試料析出物」においては、参考例に示したように大部分の「ＤＨＢＡ粉末」のラマンスペクトルと同一のラマンスペクトルが得られる結晶Ａと、「ＤＨＢＡ粉末」とは異なるラマンスペクトルが得られる結晶Ｂの少なくとも２種類に分けられることが判明した。測定試料析出物の結晶Ｂから得られた、「ＤＨＢＡ粉末」とは異なるラマンスペクトルを図３（ｂ）に示す。
　両スペクトル中に観測されたラマンスペクトルのシグナルの波長のリストを表１に示した。結晶Ｂのラマンスペクトルは、「ＤＨＢＡ粉末」のラマンスペクトルで観測されていた１１９９ｃｍ－１付近、１３０７ｃｍ－１付近、３７６ｃｍ－１付近等の強いシグナルが消滅していた。逆に、３２６５ｃｍ－１付近にブロードなシグナルが観察された。
　１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルをもつ結晶Ａを白く表し、１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルをもたない結晶Ｂを黒く表したラマンイメージング画像を図４に示す。すなわち、図４において、白く表された結晶は、「ＤＨＢＡ粉末」と同じラマンスペクトル（図３（ａ））が得られた結晶Ａであり、黒く表された結晶は、「ＤＨＢＡ粉末」とは異なるラマンスペクトル（図３（ｂ））が得られた結晶Ｂである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　この測定試料析出物について、ＭＡＬＤＩ質量分析法によってマススペクトルを取得した。測定は、質量分析計としてＭＡＬＤＩ－ＱＩＴ－ＴＯＦ型質量分析計（ＡＸＩＭＡ－ＱＩＴ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて行った。測定は正イオンモードで行った。その結果、白く表されず黒く表された（１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルを有しない）結晶Ｂからのみ強いシグナルを検出することができた。また、結晶Ｂの円周上の根元から特に強いシグナルを検出することができた。
　一方、白く表された（１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルを有する）結晶Ａ内のどこからも強いシグナルを検出することができなかった。すなわち、「ＤＨＢＡ粉末」と同一のラマンスペクトルを示す結晶Ａの部分にはスイートスポットがなかった。
　結晶Ｂの円周上の根元から得られたマススペクトルを図５に示す。図５に示すように、極めて良好なマススペクトルを得ることができた。ＭＳ測定に先立って、質量分析法以外の分析方法であるラマン分光スペクトル測定を用いて、混合結晶の局所的な分析をすることにより、良好なＭＳシグナルが得られる測定点（スイートスポット）が判明し、効率よく測定できた。
比較例１
　実施例１の測定試料の全域に対して、レーザーパワーを測定対象分子のイオンのシグナルがではじめる閾値に最適化した後、４０μｍ間隔でレーザー照射を行い、自動で測定した。図６に、測定試料析出物において糖ペプチド１イオンが検出された位置を示す。なお、このように質量分析法を用いて該マトリックス結晶の局所的な分析をしてしまった場合、スイートスポットの場所の予測はできるが、マトリックスはレーザー照射によって消耗されるため、次回測定時も同じ場所にスイートスポットが存在する確証はなく、場合によってはマトリックスが消耗され尽くしてしまうため、次回測定時はＭＳシグナルが全く得られない場合もある。
　図６に示したように、図２に示した「結晶があるところ全て」からシグナルが検出できたわけでないことが示された。実施例１と同様に、よいスペクトルが得られた測定点もあったが、図７に示したようにシグナルの検出が容易ではない、プレート（試料支持部材）上の測定点も存在した。
＜実施例１と比較例１の結果＞
　更に、図４と図６を比較すると、ラマンイメージング画像とスイートスポットの位置の相関がより明白になった。すなわち、図４で黒く表示されている、「ＤＨＢＡ粉末」とは異なるラマンスペクトルを生ずる結晶Ｂの根元（結晶化の起点部位）では、「ＤＨＢＡ粉末」と同じラマンスペクトルを生じる結晶Ａ（白く表示されている）と比べて格段にイオン生成量が高く、優れたスイートスポットとなっていることが示された。これは、質量分析の前にラマンイメージング画像を取得することで、質の高いマススペクトルが得られる優れたスイートスポットを予測できることを示している。
実施例２
　実施例１と同様に測定試料を作製し、ＦＴ－ＩＲを測定した。その結果、測定箇所によって、ラマンスペクトルと同様に、１２００～１３００ｃｍ－１付近や３２６５ｃｍ－１付近に相違が見られるスペクトルが得られた（図８（ａ）、（ｂ））。すなわち、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを有する試料支持部材上の結晶部分にスイートスポットがあり、逆に、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを有し、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない試料支持部材上の結晶部分にスイートスポットがなかった。また、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを有する試料支持部材上の結晶部分にスイートスポットがあり、逆に、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない試料支持部材上の結晶部分にスイートスポットがなかった。
　このことから、赤外分光スペクトルによっても、ＭＳシグナル検出の予測が可能であることが分かった。すなわち、予めプレート（試料支持部材）上のスイートスポットの場所の予測が可能であることが分かった。
実施例３
　実施例１と同様に測定試料を作製し、ＣｕＫα線を照射して、微小部Ｘ線回折（μＸＲＤ）を測定した。４５ｋＶ、１１０ｍＡ、測定時間２分であった。その結果、測定箇所によって異なる回折データが得られた（図９）。この場合、ＭＳシグナルが良好な結晶部分には、ＭＳシグナルが乏しい結晶部分にはない、２θ＝２５．５°，１９．７°，１７．５°，１６．３°，１５．８°付近の回折ピークが見られた。従って、２θ＝２５．５°，１９．７°，１７．５°，１６．３°，１５．８°付近に回折ピークを有する結晶部分に、ＭＳのスイートスポットがあることが、ＭＳ測定の前に予め予想できることが分かった。
実施例４
　測定対象分子である糖ペプチド１（化学構造を図１に示す）を水に溶解して、１００ｆｍｏｌ／μＬにした水溶液を１μＬ滴下し、実施例１と同様に混合結晶を作成した。このプレート（試料支持部材）上の物質のラマンイメージング画像を取得するため、ｉｎＶｉａラマンマイクロスコープ（株式会社レニショー社製）を用い、波長５３２ｎｍの励起レーザー条件下でラマン測定を行った。実施例１と同様に、プレート（試料支持部材）上の物質は、結晶Ａのラマンスペクトルを有する領域と結晶Ｂのラマンスペクトルを有する領域に分けることができた。
　１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルをもつ結晶Ａの部分は実際には緑色で明確に表されたので、その部分を実線の楕円で囲み、１１９９ｃｍ－１付近に強いシグナルをもたない結晶Ｂは実際には赤色で明確に表されたのでその部分を破線の楕円で囲んで示したラマンイメージング画像を図１０（ａ）に示す。すなわち、図１０（ａ）において、実線の楕円で囲んだ結晶は、既知の分析結果と同じラマンスペクトル（図３（ａ））が得られた結晶Ａであり、破線の楕円で囲んだ結晶は、既知の分析結果とは異なるラマンスペクトル（図３（ｂ））が得られた結晶Ｂである。
　それぞれの結晶は、同一起点から発生した結晶と推定される結晶群として、実線で囲まれた領域の結晶群Ａ１～Ａ４、及び、破線で囲まれた領域の結晶群Ｂ１～Ｂ７に分けることができた。
　この測定試料析出物について、ＭＡＬＤＩ質量分析法によってマススペクトルを取得した。測定は、質量分析計としてＭＡＬＤＩ－ＱＩＴ－ＴＯＦ型質量分析計（ＡＸＩＭＡ－ＱＩＴ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて行った。測定は正イオンモードで行った。測定試料の全域に対して、レーザーパワーを測定対象分子のイオンのシグナルが出始める閾値に最適化した後、４０μｍ間隔でレーザー照射を行い、自動で測定した。
　図１０（ｂ）に、測定試料析出物において糖ペプチド１イオンが検出された位置を色の濃い正方形のピクセルで示す。図１０の下部に示したように、領域Ｂ（Ｂ１～Ｂ７）においては、高い確率で強いシグナルが得られ、スイートスポットが存在していることが明らかとなった。一方で領域Ａからは、まれにシグナルが得られる程度であり、この部分にレーザー照射して質量分析することは効率が良くないことが証明された。すなわち、スイートスポットとして不適であることが予め判断できた。従って、本発明は、１００ｆｍｏｌ以下というより微量な測定分子を検出するのに有効であることが分かった。
参考例１
　高純度ＤＨＢＡ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を粉末のままスライドグラス上に置き、ＮＲＳ－３２００顕微ラマンシステム（日本分光）によりラマンイメージを取得した。図１１に示したように、結晶ＡおよびＢに共通に存在する３０７６ｃｍ－１のシグナルは光学顕微鏡像の分布と一致した（図１１（ｂ））。更に、結晶Ａに特徴的な１２０３ｃｍ－１のシグナルは大部分から検出されたが（図１１（ｃ））、結晶Ｂに特徴的な３２６９ｃｍ－１のシグナルはほとんど検出されなかった（図１１（ｄ））。
　図１１に示した矢印Ａの部分のスペクトルは、図３（ａ）のスペクトルと同じで、これは独立行政法人産業技術総合研究所スペクトルデータベースにあるＤＨＢＡのラマンスペクトルと一致した。図１１に示した矢印Ｂの部分のスペクトルは、図３（ｂ）のスペクトルと同じで、データベースのＤＨＢＡのスペクトルとは異なった。この結果から、高純度ＤＨＢＡ粉末はほぼ１種類の結晶形からなることが分かった。
　なお、図１１においては、実際の測定画像写真では、強度が弱い部分から強い部分に向けて、黒→紫→濃い青→明るい青→緑→黄色→橙色→赤、というように色分けされており、「黒→紫→濃い青→明るい青→緑」あたりまでは、願書に添付した白黒の図面では、強度が強い方が薄くなる傾向にほぼあるが、「黄色→橙色→赤」では、強度が強い方が濃くなる傾向にほぼある。従って、薄い部分の外側にある濃い部分はシグナル強度が弱いが、薄い部分の内側にある濃い部分はシグナル強度が強い。
参考例２
　参考例１で用いたスライドグラス上の高純度ＤＨＢＡ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）の粉末に水を１滴滴下し静置して乾かしたところ、図１２に示したように、針状結晶が生じた。参考例１と同様にラマンイメージを取得した。結晶Ａに特徴的な１２０３ｃｍ－１のシグナルを持つ結晶と、結晶Ｂに特徴的な３２６９ｃｍ－１のシグナルを持つ結晶のそれぞれが新たに生じることが判明した（図１２（ｃ）、（ｄ））。
　更に、図１２に示した矢印Ａの部分のスペクトルは、図３（ａ）のスペクトルと同じで、これは独立行政法人産業技術総合研究所スペクトルデータベースにあるＤＨＢＡのスペクトルと一致した。図１２に示した矢印Ｂの部分のスペクトルは、図３（ｂ）のスペクトルと同じで、データベースのＤＨＢＡのスペクトルとは異なった。
　同一の箇所のＩＲスペクトルを取得すると、矢印Ａの部分のスペクトルは、図８（ａ）のスペクトルと類似しており、これは独立行政法人産業技術総合研究所スペクトルデータベースにあるＤＨＢＡのＩＲスペクトルと一致した。矢印Ｂの部分のスペクトルは、図８（ｂ）のスペクトルと類似していたが、データベースのＤＨＢＡのスペクトルとは異なった。これらのことから、測定対象分子の存在に関わらず、特定の条件で高純度ＤＨＢＡ粉末から２種の多形結晶が生じること、そのうちの１種の多形は通常ではあまり存在しないが、その多形がＭＡＬＤＩに極めて効果を発揮することが明確になった。
　なお、図１１においても、上記した図１２における「実際の画像写真と願書に添付した白黒の図面との関係」がある。
　ＮＲＳ－３２００顕微ラマンシステム（日本分光）でのラマンイメージング画像は、ある特定の波数のシグナルの強度が弱い部分から強い部分までを段階的に色分けして表現することができる。実際の図１１（ｂ）、図１１（ｃ）、図１１（ｄ）、図１２（ｂ）、図１２（ｃ）及び図１２（ｄ）に対応する測定画像写真は、強度が弱い部分から強い部分に向けて、黒→紫→濃い青→明るい青→緑→黄色→橙色→赤、というようにくっきり色分けされている。実際に測定されたカラー画像については、優先権主張の基礎出願では、物件提出書で日本国の特許庁に提出されている。
実施例５
　市販のステンレスプレートを用いて実施例１と同様に測定試料を作製し、反射型光学顕微鏡を使用して結晶を観察した。光学顕微鏡は、株式会社キーエンス社製デジタルマイクロスコープＶＨＸ－１０００（ＶＨ－Ｚ１００Ｒレンズ、光源：ハロゲンランプ１００Ｗ／１２Ｖ）を用いて、倍率１５０倍、クロスニコルによる偏光条件に設定した状態で観察した。
　結果を図１３に示す。図１３に示したように、構造色を示す結晶と、無彩色の結晶に分けられた。構造色を発現させるのは、結晶表面の微細な（ｎｍレベルの）周期的な構造であった。
　このうち、構造色を示す結晶からは良好なＭＳシグナルが得られず、そこにはスイートスポットが存在しておらず、ＭＳシグナルが良好でスイートスポットになる結晶は構造色を示さないことが判明した。
　また、構造色を示さない結晶からは良好なＭＳシグナルが得られ、そこにはスイートスポットが存在しており、ＭＳシグナルが良好ではなくスイートスポットにならない結晶は構造色を示すことが判明した。
　従って、ＭＳ測定試料中の構造色を示す結晶と示さない結晶を予め識別することによって、極めて簡便にスイートスポットの場所を予測することが可能であることが分かった。
実施例６
　市販のステンレスプレートを用いて実施例１と同様に測定試料を作製し、共焦点レーザー顕微鏡を使用して結晶を立体的に観察した。共焦点レーザー顕微鏡は、オリンパス株式会社製、走査型共焦点レーザー顕微鏡ＬＥＸＴ　ＯＬＳ３１００を用いて、倍率５倍～５０倍の範囲で共焦点観察を行った。
　結果を図１４に示す。図１４（ａ）に示したように、表面の規則的な凹凸が明確に検出できる結晶と、規則的な凹凸は検出されない結晶に分けられた。該結晶表面の規則的な凹凸の周期は１μｍ～５μｍの範囲であり、実施例５に記載の、構造色を発現させる「微細な（ｎｍレベルの）周期的な構造」とは異なっていた。
　このうち、図１４（ｂ）に示したように、表面の規則的な凹凸を有する結晶（表面が凹凸状態の結晶）からは良好なＭＳシグナルが得られず、そこにはスイートスポットが存在しておらず、ＭＳシグナルが良好でスイートスポットになる結晶は、表面に規則的な凹凸構造を有さない（表面が凹凸状態でない）ことが判明した。
　また、表面の規則的な凹凸を有さない結晶からは良好なＭＳシグナルが得られ、そこにはスイートスポットが存在しており、ＭＳシグナルが良好ではなくスイートスポットにならない結晶は、表面の規則的な凹凸構造を示すことが判明した。
　従って、ＭＳ測定試料中のマトリックス結晶の規則的な凹凸構造、すなわち、結晶表面の「周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態」が検出されるか検出されないかを予め識別することによって、極めて簡便にスイートスポットの場所を予測することが可能であることが分かった。
　本発明の質量分析法以外の分析方法を用いて、スイートスポットの場所を予測するＭＡＬＤＩ質量分析法は、短時間で効率良く質の高いＭＳスペクトルを得ることが可能であり、構造同定で必要な高感度ＭＳｎ（ｎ＞１）解析を可能にし、更には自動分析への応用が可能となるので、ＭＳスペクトルを使用する全ての分析分野に、特に、微量試料しか入手できない場合がある生体分析の分野等に広く利用されるものである。
　本願は、２００９年１２月３０日に出願した日本の特許出願である「特願２００９－２９９３０３」、及び、２０１０年２月２４日に出願した日本の特許出願である「特願２０１０－０３８２３０」に基づくものであり、これらの出願の全ての内容はここに引用し、本発明の明細書の開示として取り込まれるものである。

Claims (29)

  1. 　ＭＡＬＤＩ質量分析法において、測定対象分子を含む試料とマトリックスの混合結晶を析出させた後、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をしてからＭＡＬＤＩ質量分析をして、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果を予め特定しておき、
    　次に、測定対象分子を含む試料と該マトリックスの混合結晶を析出させた後、該質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をし、スイートスポットになる該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットであると予測する、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットでないと予測することを特徴とするスイートスポットの予測方法。
  2. 　ＭＡＬＤＩ質量分析法において、試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後にマトリックスの溶液を載置し、又は試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて該試料とマトリックスの混合結晶を析出させた後、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をしてからＭＡＬＤＩ質量分析をして、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果を予め特定しておき、
    　次に、試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に該マトリックスの溶液を載置し、又は試料支持部材上に測定対象分子を含む試料と該マトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて、該試料と該マトリックスの混合結晶を析出させた後、該質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をし、スイートスポットになる該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットであると予測する、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、その部分がスイートスポットでないと予測することを特徴とする請求項１記載のスイートスポットの予測方法。
  3. 　該局所的な分析を、該混合結晶の全域又は一定の範囲に対して、繰り返し行い若しくはスキャンして、その分析結果をマッピングすることにより、スイートスポットとなる領域を予測することを特徴とする請求項１又は請求項２記載のスイートスポットの予測方法。
  4. 　該質量分析法以外の分析方法が、結晶多形を識別する分析方法である請求項１ないし請求項３の何れかの請求項記載のスイートスポットの予測方法。
  5. 　該質量分析法以外の分析方法が、分光スペクトル測定による分析方法である請求項１ないし請求項３の何れかの請求項記載のスイートスポットの予測方法。
  6. 　該分光スペクトル測定が、ラマン分光スペクトル測定又は赤外分光スペクトル測定である請求項５記載のスイートスポットの予測方法。
  7. 　該質量分析法以外の分析方法が、Ｘ線回折測定による分析方法である請求項１ないし請求項３の何れかの請求項記載のスイートスポットの予測方法。
  8. 　該質量分析法以外の分析方法が、光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出による分析方法である請求項１ないし請求項３の何れかの請求項記載のスイートスポットの予測方法。
  9. 　該質量分析法以外の分析方法が結晶表面の周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態の検出である請求項１ないし請求項３の何れかの請求項記載のスイートスポットの予測方法。
    ≪「顕微鏡法による」を削除しました。≫
  10. 　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定がラマン分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないラマン分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを有するラマン分光スペクトルである請求項６記載のスイートスポットの予測方法。
  11. 　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定が赤外分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを有する赤外分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない赤外分光スペクトルである請求項６記載のスイートスポットの予測方法。
  12. 　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定がラマン分光スペクトル測定又は赤外分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを有するラマン分光スペクトル又は赤外分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないラマン分光スペクトル又は赤外分光スペクトルである請求項６記載のスイートスポットの予測方法。
  13. 　該質量分析法以外の分析方法が光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が構造色を示さない、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が構造色を示す、光学顕微鏡による分析結果である請求項８記載のスイートスポットの予測方法。
  14. 　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、結晶表面に周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態が検出されない、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、結晶表面に周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態が検出される、共焦点レーザー顕微鏡による分析結果である請求項９記載のスイートスポットの予測方法。
  15. 　試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後であって、マトリックスの溶液を載置する前に、測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤の溶液を該試料支持部材上に滴下して乾燥する工程を挿入する請求項２ないし請求項１４の何れかの請求項記載のスイートスポットの予測方法。
  16. 　試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後にマトリックスの溶液を載置し、又は試料支持部材上に測定対象分子を含む試料とマトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて、該試料とマトリックスの混合結晶を析出させた後、質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をしてからＭＡＬＤＩ質量分析をして、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果を予め特定しておき、
    　次に、試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後に該マトリックスの溶液を載置し、又は試料支持部材上に測定対象分子を含む試料と該マトリックスの溶液を同時に載置し、該溶液を乾燥させて、該試料と該マトリックスの混合結晶を析出させた後、該質量分析法以外の分析方法を用いて、該混合結晶の局所的な分析をし、スイートスポットになる該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、該検出された混合結晶の部分を対象としてレーザー脱離イオン化する、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出して、該検出された混合結晶の部分を対象としてレーザー脱離イオン化しないことを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析法。
  17. 　該局所的な分析を、該混合結晶の全域又は一定の範囲に対して、繰り返し行い若しくはスキャンして、その分析結果をマッピングすることにより、スイートスポットになる該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分、及び／又はスイートスポットにならない該混合結晶の部分の該分析結果を呈する混合結晶の部分を検出することを特徴とする請求項１６記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  18. 　該質量分析法以外の分析方法が、結晶多形を識別する分析方法である請求項１６又は請求項１７記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  19. 　該質量分析法以外の分析方法が、分光スペクトル測定による分析方法である請求項１６又は請求項１７記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  20. 　該分光スペクトル測定が、ラマン分光スペクトル測定又は赤外分光スペクトル測定である請求項１９記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  21. 　該質量分析法以外の分析方法が、Ｘ線回折測定による分析方法である請求項１６又は請求項１７記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  22. 　該質量分析法以外の分析方法が、光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出による分析方法である請求項１６又は請求項１７の何れかの請求項記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  23. 　該質量分析法以外の分析方法が結晶表面の周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態の検出である請求項１６又は請求項１７の何れかの請求項記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
    ≪「顕微鏡法による」を削除しました。≫
  24. 　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定がラマン分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないラマン分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３７６ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１１９９ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３０７ｃｍ－１付近にシグナルを有するラマン分光スペクトルである請求項２０記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  25. 　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定が赤外分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを有する赤外分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、１２００ｃｍ－１付近にシグナルを有する、又は１３００ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さない赤外分光スペクトルである請求項２０記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  26. 　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、該分光スペクトル測定がラマン分光スペクトル測定又は赤外分光スペクトル測定であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを有するラマン分光スペクトル又は赤外分光スペクトルである、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、３２６５ｃｍ－１付近にシグナルを実質的に有さないラマン分光スペクトル又は赤外分光スペクトルである請求項２０記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  27. 　該質量分析法以外の分析方法が光学顕微鏡法による結晶表面の構造色の検出であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が構造色を示さない、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が構造色を示す、光学顕微鏡による分析結果である請求項２２記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  28. 　該マトリックスが２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）であり、スイートスポットになる該混合結晶の部分の分析結果が、結晶表面に周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態が検出されない、及び／又は、スイートスポットにならない該混合結晶の部分の分析結果が、結晶表面に周期１μｍ以上１０μｍ以下の周期的な凹凸状態が検出される、共焦点レーザー顕微鏡による分析結果である請求項２３記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
  29. 　試料支持部材上に測定対象分子を含む試料を載せた後であって、マトリックスの溶液を載置する前に、測定対象分子と反応することによってイオン化効率を高める誘導体化剤の溶液を該試料支持部材上に滴下して乾燥する工程を挿入する請求項１６ないし請求項２８の何れかの請求項記載のＭＡＬＤＩ質量分析法。
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