JP2003529605A

JP2003529605A - 高分子検出

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Publication number: JP2003529605A
Application number: JP2001572531A
Authority: JP
Inventors: ジェームズピーター
Original assignee: プロテオムシステムズリミテッド
Priority date: 2000-04-03
Filing date: 2001-04-03
Publication date: 2003-10-07
Also published as: WO2001074842A1; EP1268513A1; EP1268513A4; US20030175804A1; AUPQ664300A0

Abstract

(57)【要約】タンパク質を標識する方法であって、（ａ）タンパク質のリジン残基に存在するε−アミノ酸基を阻害するために該タンパク質を保護剤で処理する工程と、（ｂ）タンパク質を開裂してペプチド混合物にする工程と、（ｃ）ペプチド混合物をペプチドのＮ末端アミノ酸に結合する標識剤で処理する工程とを備えた方法を提供する。本方法はタンパク質発現の差違を判定する発現差検出方法において使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 −技術分野− 本発明は、タンパク質及びペプチド断片を定量化、同定、解析する方法に関す
る。

【０００２】 −発明の背景− ２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（2D-PAGE）により分離されたタン
パク質抽出物の濃度分析は、その限界にもかかわらず、タンパク質発現を定量的
に研究する方法としては最も確立され、かつ最も利用されている。しかし、この
方法は、染色強度のタンパク質個体差、染色手法の再生性の低さ、そしてタンパ
ク質が重複したりひと続きになったりする不具合により、常に信頼されている訳
ではない。放射性同位体を用いた安定なインビボ（in vivo）代謝標識法により
、この問題への解答が部分的には示されている（文献１,２）。

【０００３】タンパク質同定の問題は、タンパク質消化物からのペプチドの質量（文献３）
か、個々のペプチドの断片化スペクトル（文献４,５）のどちらかに基づく質量
スペクトルデータを用いて、データベースでタンパク質を同定する方法の導入に
より大変革を遂げた。新規タンパク質配列決定とその自動化は、ネイティブなペ
プチド断片化（MS/MS）が可能になって以来ずっと強く関心を持たれてきたこと
である（文献６,７）。同位体による標識化と断片化を導く帯電誘導体が、スペ
クトルの解析を簡素化する手段として研究されてきた（文献８−１０）。しかし
、普遍的な解答はまだ現れておらず、未処理の MS/MS スペクトルをデータベー
ス検索に使用することにさえ限界がある。翻訳後修飾に対処する必要性及びゲノ
ムが配列決定されていない生物への有効性が、新しい方法の開発には必要とされ
る。

【０００４】 −発明の概要− 本発明者は、１Ｄゲル分離及び２Ｄゲル分離において、その分離が部分的のみ
であってもタンパク質の相対的な定量化が可能で、MS/MS 断片化スペクトルの新
規配列決定や自動解析が容易なタンパク質標識方法を開発した。本方法には、ペ
プチド断片のＮ末端アミノ酸に結合する標識剤でタンパク質の開裂により得られ
たペプチド断片の混合物を標識することが含まれ、リジンに存在するε−アミノ
酸基を阻害するために、タンパク質を開裂の前に保護剤で処理することが含まれ
る。ε−アミノ酸基の阻害は、標識剤が内部のリジンを標識することを防止する
ために必要とされる。

【０００５】したがって、第１の態様において、本発明は、タンパク質を標識する方法を提
供するものであって、（ａ）タンパク質のリジン残基に存在するε−アミノ酸基を阻害するために該タ
ンパク質を保護剤で処理する工程と、（ｂ）タンパク質を開裂してペプチド混合物にする工程と、（ｃ）ペプチド混合物をペプチドのＮ末端アミノ酸に結合する標識剤で処理する
工程とを備えている。

【０００６】工程（ａ）は、タンパク質のスクシニル化であるのが好ましく、保護剤として
無水コハク酸を使用することが好ましい。

【０００７】工程（ｂ）における開裂は、Asp/GluC（V8）プロテアーゼを用いたインキュベ
ーションによるものであることが好ましい。

【０００８】工程（ｃ）は、1-(H4/D4 ニコチノイルオキシ)スクシンイミド（H4又はD4 Nic
-NHS）エステルで処理する工程であることが好ましい。

【０００９】第２の態様において、本発明は、タンパク質を同定及び／又は解析する方法を
提供するものであって、第１の態様に記載の方法によってタンパク質を標識する
工程と、該工程の後に続く（ｄ）上記ペプチド上の標識量の検出又は測定を行う工程とを備えている。

【００１０】本方法は、更に（ｅ）標識化されたペプチドのアミノ酸配列を同定する工程を含んでいてもよい。

【００１１】工程（ｅ）は、イオントラップ型質量分析計を用いた質量スペクトル分析によ
るものであるのが好ましい。

【００１２】タンパク質は、標識化の前に他のタンパク質から分離されているのが好ましい
。対象となるタンパク質は、例えば 1D PAGE ゲル又は 2D PAGE ゲルから切り出
され、分析されてもよい。

【００１３】第３の態様において、本発明は第１の細胞と第２の細胞におけるタンパク質発
現を比較又は決定する方法を提供するものであって、（i）第１の細胞と第２の細胞からタンパク質を得る工程と、（ii）第１の態様に記載の方法により上記第１の細胞と上記第２の細胞からの
タンパク質をそれぞれ標識する工程であって、第１の標識剤が上記第１の細胞か
らのタンパク質の識別に使用され、第２の標識剤が上記第２の細胞からのタンパ
ク質の識別に使用されると共に、上記第１の標識剤と第２の標識剤が識別可能と
なっている工程と、（iii）ペプチド上の第１及び第２の標識剤の量を検出又は測定する工程とを備えている。

【００１４】第１の標識剤と第２の標識剤とは、質量を基準として識別可能であることが好
ましい。

【００１５】工程（iii）は、MALDI MS であることが好ましい。

【００１６】きわめて好適な実施形態においては、上記第１の標識剤と上記第２の標識材の
うち、何れか一方が軽い同位体を用いた標識を備え、残りの他方が重い同位体を
用いた標識を備える。上記第１の標識剤と上記第２の標識材のうち、何れか一方
が 1-(H4 ニコチノイルオキシ)スクシンイミド（H4 Nic-NHS）エステルであり、
残りの他方が 1-(D4 ニコチノイルオキシ)スクシンイミド（D4 Nic-NHS）エステ
ルであるのが望ましい。

【００１７】上述の方法は、更に（iv）標識されたペプチドのアミノ酸配列を同定する工程を備えていてもよい。

【００１８】工程（iv）は、イオントラップ型質量分析計を用いた質量スペクトル分析によ
るものであることが好ましい。

【００１９】第３の態様に特有の実施形態によれば、本発明は、異なる状況下での細胞のタ
ンパク質発現を決定する方法において成立し、（ａ）第１の発現状態及び第２の発現状態からタンパク質を得る工程と、（ｂ）リジンに存在するε−アミノ酸基を阻害するために第１の発現状態及び第
２の発現状態から得られたタンパク質を保護剤で処理する工程と、（ｃ）第１の発現状態及び第２の発現状態から得られたタンパク質を開裂してペ
プチド混合物にする工程と、（ｄ）第１の発現状態から得られたペプチド混合物を、ペプチドのＮ末端アミノ
酸に結合する軽い同位体で標識する試薬で処理する工程と、（ｅ）第２の発現状態から得られたペプチド混合物を、ペプチドのＮ末端アミノ
酸に結合する重い同位体で標識する試薬で処理する工程と、（ｆ）処理済みの第１の発現状態及び第２の発現状態から得られたペプチド混合
物を混ぜ合わせる工程と、（ｇ）ペプチド上の軽い標識と重い標識の量を検出又は測定する工程とを備えている。

【００２０】第４の態様において、本発明では、ペプチド及び／又はタンパク質に対する標
識剤として、識別用に同位体で標識した２種類以上のスクシニル化剤を使用する
。スクシニル化剤は、1-(H4又はD4 ニコチノイルオキシ)スクシンイミド（H4/D4
Nic-NHS）エステルであることが好ましい。

【００２１】 −発明の詳細− 本発明で用いる各方法において、タンパク質は、開裂剤で処理されてペプチド
混合物の状態となり、続いてペプチドのＮ末端アミノ酸を標識する標識剤で処理
される。標識剤は遊離アミノ基との反応によってＮ末端と反応するので、内部の
アミノ酸残基、特にリジンに存在するアミノ基への標識剤の結合を阻害するため
にタンパク質の前処理が必要である。リジンのε−アミノ基を阻害しないと、標
識剤はリジンの全ての遊離アミノ基とも結合してしまい、標識されたペプチドの
アミノ酸配列を解析するのが困難になってしまう。

【００２２】よって、保護剤としては、リジン残基のε−アミノ基の阻害に適する任意の保
護剤が用いられる。好適な保護剤の例としては、無水コハク酸等のスクシニル化
剤が挙げられる。

【００２３】タンパク質は、ひとたび保護剤で処理されると、開裂されて断片となる。この
処理は、酵素を用いた手段、もしくは化学的な手段により行われてもよい。酵素
による処理の好例としては、トリプシンを含むプロテアーゼや他のペプチド生成
に適したプロテアーゼを使用する方法がある。タンパク質を開裂して適当な断片
とする技術は、従来技術により公知である。

【００２４】次の工程では、ペプチド混合物を、ペプチドのＮ末端アミノ酸と結合する標識
剤で処理する。標識剤は、検出可能な標識を備えている。検出可能な標識は、質
量分析法等の質量決定方法により検出できるものであることが好ましい。

【００２５】具体的には、２つ以上の形態で作成可能な標識を使用することが好ましい。ま
た、標識剤や標識が結合するペプチドの異なる形態の質量による識別が可能で、
重要なポイントとして、質量分析法を施す際に、標識が結合するペプチドのイオ
ン化効率に影響を与えない標識を使用することが好ましい。

【００２６】検出可能な標識として特に好適なのは、例えば水素とそれより重い形態である
重水素や三重水素のような数種類の同位体の形で標識剤に混合することが可能な
原子である。他の同位体の例としては、炭素１２とそれより重い炭素１４がある
。

【００２７】標識剤としては、Ｎ末端アミノ基と反応する任意の液体が用いられる。好適な
実施形態では、標識剤は、１−ニコチノイルオキシスクシンイミドエステル（1-
nicotinoyloxy succinimide ester）、より好適には、1-(H4/D4-ニコチノイルオ
キシ)スクシンイミドエステル（1-(H4/D4-nicotinoyloxy) succinimide ester）
である。

【００２８】本発明におけるタンパク質標識方法は、次に続く検出工程のためにタンパク質
を標識するのに使用してもよい。一般に、検出工程は、検出可能な標識の存在を
定量的に検出する工程を備えている。好適な検出方法としては、MALDI 質量分析
法などがある。

【００２９】検出方法はさらに、標識されたペプチドのアミノ酸配列を同定する技術を備え
ていてもよい。適する技術としては、イオントラップ型分析計を用いた質量スペ
クトル分析などがある。

【００３０】異なる標識を持つ２種類以上の標識剤を使用することにより、２つ以上の異な
るサンプル中のタンパク質の相対的な量を決定できる。特に、本発明における標
識技術を、２つの異なる細胞内のタンパク質発現の比較に使用してもよい。２つ
の異なる細胞は、例えば同じ種類で異なる条件下にある（又は状態の異なる）細
胞でもよいし、違う種類（同条件下、又は異なる条件下）の細胞でもよい。よっ
て、例として、第１の細胞をある作用物質で処理して第２の細胞を未処理とし、
細胞ごとに１つ以上のタンパク質の発現を比較することが可能である。

【００３１】２つの異なる条件とは、休止中の細胞と、ある方法で誘導され又は処理された
細胞であることも可能である。異なる条件下での細胞における発現差により、細
胞内の活動に関する有益な情報が得られることが多い。

【００３２】本発明に従って、第１の細胞から得られた１つ以上のタンパク質を、第１の標
識剤を用いて本発明に記載の方法で標識する一方、第２の細胞から得られた１つ
以上のタンパク質を、第２の標識剤を用いて本発明に記載の方法で標識すること
により、比較が行われる。第１及び第２の標識剤は、各々が識別可能なように異
なる検出可能な標識を備えている。２種類の標識剤は、質量の違いにより識別さ
れるものであるのが好ましい。上述のように、ペプチドが質量分析法により検出
される時には、標識が結合するペプチドのイオン化特性に対して、異なる標識間
の差が殆ど影響を及ぼさないことが重要である。従って、標識が結合する任意の
ペプチドのイオン化生成物が、各標識の質量差に起因する質量差が一貫してある
点を除いてほぼ同一となるような標識を選ぶのが好ましい。適当な標識及び標識
剤の具体的な例としては、上述のように、水素や炭素等の特定の原子の数種類の
同位体を備えることによって互いに相違するものが挙げられる。つまり、好適な
標識剤とは、あるものは重い原子の標識（重い標識）を備え、またあるものは軽
い原子の標識（軽い標識）を備えた標識剤である。

【００３３】第１の細胞及び第２の細胞からの１つ以上のタンパク質は、一般にはクロマト
グラフィーやゲル電気泳動などの技術により他のタンパク質から分離され、本発
明に記載の方法により標識される。例えば、細胞可溶化物を、１次元電気泳動又
は２次元電気泳動、及び対応する切り出されたバンドによって分離してもよい。

【００３４】次に、タンパク質処理後の第１の細胞及び第２の細胞から得られた標識された
ペプチドの混合物を、分離して測定してもよいし、混合して一緒に測定してもよ
い。分離して測定する場合、結果の標定のために定量的な比較が可能な工程を加
えなければならない。

【００３５】第１の細胞と第２の細胞の両方から得られたタンパク質総量に等しい量を標識
して測定する場合、本発明を用いることにより、異なる条件下でのタンパク質発
現の量や種類に関する有益な情報が得られる。例えば、軽い溶剤と重い標識を使
用する場合、ペプチドへの重い標識に対する軽い標識の割合が等しければ、後者
の状態におけるタンパク質発現に変化はなかったことが推測できる。軽い標識に
対し重い標識の割合が増加した場合には、タンパク質発現が増加していたことに
なる。重い標識が検出されない場合には、タンパク質の発現が後者の状態では停
止したか、タンパク質に何か変化が起きてゲル上の別の位置に移動したかのどち
らかとなる。

【００３６】本発明における定量化と新規配列決定を行う方法はどんな場合にも適用可能で
、システインやリジン等のある種のアミノ酸を含むタンパク質を必要としない。
さらに、本方法はインビボ（in vivo）代謝標識法を必要としない。本方法は、
これらのタンパク質を 1D SDS-PAGE により部分的に分離することができ、単一
のバンドに存在する複数のタンパク質を標識化によって定量化することが可能な
ので、膜タンパク質発現の変化の分析に理想的に適する。本方法は自動化にも対
応し、データベース内において、相同性や翻訳後修飾による差違を考慮した柔軟
なシーケンスサーチを可能にする。

【００３７】本明細書全体を通じて、文脈が別の意味を必要としない限り、“備える”やそ
の変形である“備えている”や“備えた”等の表現は、示された要素、整数、工
程、要素の集合、複数の整数、複数の工程を含むことを意味し、他のどんな要素
、整数、工程、要素の集合、複数の整数、複数の工程も含まないことを意味して
はいないことを理解すべきである。

【００３８】本発明がより明確に理解され得るために、好適な形態を以下の例と図面を参考
に説明する。

【００３９】 −発明を実施するための形態− 《実験手順》 ◆ 1-(H4/D4 ニコチノイルオキシ)スクシンイミド（H4/D4 Nic-NHS）エステルの
合成ニコチン酸を無水テトラヒドロフランに溶解し、等量のジシクロヘキシルカル
ボジイミドを反応フラスコ内で２時間、室温で撹拌し続けて混合した。等量のＮ
−ヒドロキシスクシンイミドを溶液に加え、室温で一晩撹拌した。沈殿物を濾過
して取り出し、酢酸エチルで再結晶化して精製した。

【００４０】 ◆タンパク質の化学的修飾大腸菌 MC4100 を研究室所蔵物（文献１６）より入手し、５ｍＭグルコースも
しくは１００ｍＭグルコースを唯一の炭素源として加えた人工培地でバクテリア
を培養した。サンプルの準備と２Ｄゲル分析は、既に記述されているようにして
行った（文献１７）。パーソナルレーザーデンシトメーター（Personal Laser D
ensitometer；Molecular Dynamics社製アメリカカリフォルニア州サニーベ
ール）でゲルを走査し、２Ｄ^TMソフトウェア（PDQuest；ファルマシア社製ス
ウェーデンウプサラ）を用いてパワーマック（PowerMac）上で画像分析、スポ
ット照合、定量化を行った。分析用に選択したスポットの中心からスポット全体
、もしくは直径１ｍｍ²の円状ゲル片を切り取り、０.５％(v/v) トリメチルアミ
ンを含むエタノールで完全に汚れを除去した。スポットを水洗し、アセトニトリ
ルで脱水した。２Ｍ尿素と２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に１００ｍＭ無水
コハク酸を新たに調合し、すぐに水酸化ナトリウムでｐＨを８.５に調整した。
試薬溶液１００μｌでスポットを再水和し、試薬の作りたての溶液を加える前の
２時間、スクシニル化が進行した。純水とアセトニトリルを交互に４回加え、ゲ
ルスポットを脱塩した。最後のアセトニトリル洗浄後、２Ｍ尿素の Asp/GluC（V
8）プロテアーゼ１μｇ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.８）溶液
１０μｌでスポットを再水和し、３７℃で６時間消化を行った。その後、新たに
調合された H4 Nic-NHSエステルもしくは D4 Nic-NHSエステルの５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８.５）溶液を加えてペプチド混合物のＮ末端を修飾し
た。さらなる一定分量を１０分から２０分後に加えた。２時間後、０.５Ｍヒド
ロキシアミンのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８.５）溶液を加え、溶液を一晩
放置した。ギ酸２μｌを加えると反応は停止した。

【００４１】 ◆ MALDI分析と定量化加工していない消化物（０.５μｌ）を、Ziptip^TM（ミリポア社製アメリカ
マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて脱塩し、７０％メタノール、１
％酢酸で溶出し、同量のマトリクス溶液（α−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮
酸の５０％アセトニトリル溶液１０ｍｇ/ｍｌ、１.２５％TFA の水溶液）で１つ
に結晶化した。無水サンプルとマトリクス溶液の混合物を、氷冷１％TFA で３度
洗浄し、MALDI ターゲット上の混合物とした。Voyager Elite MALDI-TOF質量分
析計（Perseptive Biosystems社製，アメリカマサチューセッツ州フラミンガ
ム）のディレイドエクストラクションリフレクター方式で、加速電圧２０ｋＶ、
パルス遅延時間１５０ｎｓ、グリッド電圧６０％、ガイドワイヤー電圧０.０５
％の条件で質量スペクトルを記録した。スペクトルは、３２レーザーショット間
蓄積される。得られた質量は、マスサーチ（MassSearch）プログラムとペプチド
サーチ（PeptideSeach）プログラム（文献１８,１９）を有する配列データベー
ス（Swissplot release 38 and nrdb 10 Jan 1999）の検索に使用された。Ｄ４
とＨ４で標識されたペプチドの割合を、相対的なピーク高さより計算し、同定さ
れたタンパク質に特有だとわかる全てのペプチドで平均した。

【００４２】 ◆ MS/MS分析及び新規配列決定 Finnigan MAT LC-Qイオントラップ型質量分析計（アメリカカリフォルニア
州サンホセ）で MS/MS 配列決定を行った。脱塩した消化物の７０％メタノール
−１％酢酸溶液を内製のナノスプレーチップに戴置し、シリンジポンプを用いて
流量０.２μｌ/ｍｉｎで質量分析計内にエレクトロスプレーした。全ての同位体
分布を含むのに十分な幅の質量領域で、関心を引くピークを選択した。ＭＨ⁺イ
オンに対しては３５ないし６０単位の相対衝突エネルギーで、またＭＨ²⁺イオン
に対しては２０ないし３５単位の相対衝突エネルギーで断片化を実施した。スペ
クトルを手動で解析し、推定した配列を（T）FASTA 相同検索に使用した（文献
２０）。

【００４３】《結果及び考察》 ◆実験原理 1D PAGE 又は 2D PAGE で抽出されたタンパク質の同位体標識化により、２つ
の異なる生物状態の間に起こるタンパク質発現の変化の定量化が可能になる（図
１）。タンパク質は、消化前にリジンのε−アミノ基を阻害するため、先ずスク
シニル化される。次に、対応するペプチド生成物のＮ末端を軽い同位体標識又は
重い同位体標識で反応させて、各発現状態をそれぞれ同定する。消化物を混合す
ることにより定量化が行われ、各状態に存在するタンパク質の量の割合が軽い標
識と重い標識の割合から得られる。４つの質量単位に分離され、MALDI 質量スペ
クトルで得られたピークのピーク高さから、これらの割合を推定する。複数のタ
ンパク質がスポット内に存在しても、各タンパク質の個々の発現割合が得られる
。図１において、２つの状態中でタンパク質Ａの発現は一定であるが、一方タン
パク質Ｂの発現は３倍に増えている。この同位体標識パターンは同時に、質量分
析法による新規ペプチド配列決定を容易にする。MS/MS 断片化中、Ｎ末端への正
電荷の定着はｂイオン（Ｎ末端を含んでいる）の形成に非常に有利に働く。ｂイ
オンは、一重線として現れるｙイオン（Ｃ末端から生じる）とは違い、４つの質
量単位に分離された二重線として現れるため、容易に同定可能である。よって、
断片化スペクトルからのペプチド配列の推定は非常に容易である。

【００４４】 ◆新規ペプチド配列決定Ｎ末端での選択ニコチニル化を定量的に行うことが可能なタンパク質は、まず
リジン側鎖上でスクシニル化される。この時観察される唯一の副反応は、チロシ
ンのスクシニル化もしくはニコチニル化で、ヒドロキシアミン処理により置換で
きる。大腸菌タンパク質からのペプチド（m/z 1+952/956）の MS/MS スペクトル
を図２Ａに示す。ｂイオン系列は容易に同定され、ｙイオンの形成にとても有利
に働くＣ末端のアルギニンがあるにもかかわらず、検出率は完全であった。イオ
ントラップの MS/MS 質量範囲を限定すると（親イオンの質量の約２／３のイオ
ンしか効率よくトラップできない）、完全なイオン系列の蓄積の妨げとなる。今
回は、Ｎ末端に対し完全な配列検出率である MS³ 実験において、支配的なｂ３
イオン（422/426）を容易に同定、単離、断片化できる（図２Ｂ）。完全な配列(
ＮＭＡＧＳＬＶＲ)が迅速に抽出可能である。この配列を、タンパク質を大腸菌
の５０Ｓリボソ−ムサブユニットを持つタンパク質Ｌ１７（50S ribosomal subu
nit protein L17）として同定する FASTA 相同性検索に使用した。２０分間とい
う短い時間でのデータ蓄積で、入手可能な１２７個のうち４７個の残基に対しペ
プチド配列が得られ、検出率は３７％であった。

【００４５】全てのペプチドのＮ末端上におけるアルカリ性の高いニコチニル基の配置は、¹⁸ Ｏを用いたＣ末端の標識化に関し有利な点がいくつかある（文献１２）。ｂイ
オンの収率が非常に増大し、その同位体パターン（４つの質量単位により分離さ
れたゴールポスト）により容易に同定される。本方法は、任意のタンパク質分解
による消化、もしくは化学的消化に適用でき、かなり廉価で、¹⁸Ｏで標識された
水の再利用がよりしやすくなる（文献１３）。ｂイオン強度が増加してｂイオン
を二重線として認識し易くなることで、イオントラップ中において m/z＞1000
であるペプチドの配列全体での検出が可能となり、通常配列決定できる範囲を広
げることができる。最終的に、タンパク質のスクシニル化は、内部リジンによる
電荷局在化を抑制してｂイオンの収率を増加させ、また低エネルギー MS/MS 断
片化方式におけるリジンとグルタミンの識別を可能にする。

【００４６】 ◆２Ｄ電気泳動により分離されたタンパク質の同位体定量化包括的なタンパク質発現の２Ｄゲル解析が始めて開発されて以来、大腸菌はこ
の技術のモデルシステムの役割を担ってきた（文献１４）。ゲノム内の注釈が付
けられたタンパク質を生成する遺伝子が４２２８個あるにもかかわらず、これま
で２Ｄゲル上ではたった１６００個のスポットしか観察されていない（文献１５
）。主要な原因の１つは、数個のタンパク質が１つのスポットに一緒に移動する
ことがよくあるということである。この問題に対処するため、本発明者は、本発
明に係る同位体標識化の手法（図１）を採用し、１Ｄゲル及び２Ｄゲルからのバ
ンド／スポットで得られたタンパク質の定量化を可能にした。

【００４７】大腸菌のタンパク質発現プロファイルにおいて炭素源を限定した効果を、2D P
AGE で視覚化した（図３）。強度に強弱のあるスポット４０個を切り出し、炭素
成長に限定のない方は軽い試薬で、炭素成長に限定のある方は重い試薬で、それ
ぞれスクシニル化して標識した。同位体の割合を全てのスポットに対して決定し
、ゲル走査で得られた総合的な光学密度比と比較した（表１）。同位体の割合は
、光学密度値と同じ変動性（約±０.０５の標準偏差）、ほぼ同じ絶対値を示し
たが、利点が３つあった。１つめは、同位体の値が染色法で頻繁に発生する飽和
状態による影響（この場合スポット４,６,７,１６,１８,２３,３６,３７）を受
けなかったことである。２つめは、２Ｄ分析ソフトウェアでは判定できないよう
な非常に弱い染色スポット（スポット２８,３１,３２,３９）に対しても割合が
得られたことである。そして、同位体による方法の最も重要な利点である３つめ
の利点は、１つのスポットに存在する複数のタンパク質を定量化できたことであ
る。スポット３７（図３）は、両方のゲルで濃度が高すぎて光学密度では分析で
きなかったが、視覚では減少していることがはっきりと観察できた。標識された
消化物の MALDI MS 分析により、２つのタンパク質が存在し、１つは発現レベル
が変化しなかった recA で、もう１つは欠乏条件下で発現レベルが３倍増加した
malE である（図４）ことがはっきりと示された。２つのタンパク質の相対量は
、異なる配列を持つペプチドのイオン化効率に差があるため、判定不可能である
。状態１と状態２におけるタンパク質の相対量の判定は、ペプチドの配列が同一
で標識の水素／重水素置換のみが異なるので可能であり、少なくとも１０個のペ
プチドがタンパク質発現の変化を計算するのに用いられている。スポットが完全
に新規誘導されている場合、迅速な配列決定を可能にするには D4H4 NicNHS の
５０：５０混合液で修飾すればよい。

【００４８】本発明における定量化と新規配列決定を行う方法は、どんな場合にも適用可能
であり、システインやリジン等のある種のアミノ酸を含むタンパク質を必要とし
ない。さらに、本方法はインビボ（in vivo）代謝標識法を必要としない。本方
法は、複数のタンパク質を1D SDS-PAGE により部分的に分離することができ、単
一のバンドにある複数のタンパク質を同位体標識化によって定量化することが可
能なので、膜タンパク質発現の変化の分析に理想的に適する。本方法は自動化に
も対応し、データベース内を検索し、相同性や翻訳後修飾による差違を考慮した
柔軟なシーケンスを可能にする。

【００４９】 ◆表１光学密度と同位体比によるタンパク質の定量化の比較を示す。図４で標識され
たタンパク質スポットをスクシニル化し、Asp/GluC プロテアーゼで消化し、図
１に概略を述べたように軽い試薬もしくは重い試薬で修飾した。MSスペクトルよ
り得られた D4/H4 比を、MALDI スペクトルでの相対ピーク高さから計算した。D
4/H4 比を、クマシー染色されたゲルをレーザ濃度計内で走査することにより得
られた光学濃度比と比較した。１つ以上のタンパク質を含むスポットに関しては
、タンパク質の変化する割合のみを測定している。飽和状態を示す強く染色して
いるスポットを＊で、染色が弱すぎて２Ｄ分析ソフトウェアでは定量化不可能な
スポットを＃で示している。

【００５０】

【表１】

【００５１】当業者には、実施形態に示される発明に対し、概略して述べられている本発明
の精神や範疇から逸脱することなく、多数の変更及び／又は修正が可能であるこ
とが理解されよう。従って、本実施形態は例示されるあらゆる点において検討さ
れるべきであり、かつ限定されるものではない。

【００５２】 −参考文献− １．オダ，Ｙ．，ファン，Ｋ．，クロス，Ｆ．Ｒ．，カウバーン，Ｄ．，シャ
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【図面の簡単な説明】

【図１】タンパク質の定量化と配列決定の手法を示す。異なる条件下で得られた細胞か
らの抽出物を、２次元 SDS-PAGE 電気泳動法で分離する。個々のスポットを選択
して切り出し、リジン残基を Asp/GluC プロテアーゼによる消化の前にスクシニ
ル化する。状態１で得られたペプチドのＮ末端を軽い試薬 H4NicNHS（1-(H4-ニ
コチノイルオキシ)スクシンイミド）により、状態２で得られたペプチドのＮ末
端を重い試薬 D4NicNHS により、それぞれ明確に標識する。消化物を混合し、個
々のペプチドの D4/H4 比からタンパク質の相対量を定量化するために、画分を
MALDI MS で分析する。次に、発現レベルの変化を示しているタンパク質からで
きたペプチドを、タンデム質量分析法で分析する。

【図２】 MS/MS によるペプチド配列決定を示す。大腸菌タンパク質をスクシニル化し、
V8 プロテアーゼとトリプシンの混合物で消化した。消化物を、H4/D4-ニコチノ
イル化し、その後Ｃ１８ビーズを含むマイクロチップ上で脱塩し、イオントラッ
プ型質量分析計内でのナノエレクトロスプレーイオン化により分析した。１価の
親イオンの同位体クラスタ952/956は修飾（本図Ａに示すズームスキャン）によ
る特徴的な同位体分布をはっきりと示している。ペプチドクラスタを単離し、CA
D MS/MS を施す（本図Ｂ）。全てのｂイオンは４つの質量単位に分離された二重
線として現れるが、一方ｙイオンは単に一重線である。隣接する二重線間の質量
差より配列を迅速に読み出すことができる。MS/MS 条件下ではイオンをトラップ
する質量範囲が限られているため、部分的な配列しか読み出されなかった。全体
の配列はスペクトルの最小の二重線（422/426,b3）の MS/MS/MS 分析により得ら
れる。ペプチドの完全な配列(ＮＭＡＧＳＬＶＲ)を推定し、５０Ｓリボソ−ムサ
ブユニットを持つタンパク質Ｌ１７として検索する FASTA法によりタンパク質を
同定した。

【図３】完全な培地（本図Ａ）と炭素を制限した培地（本図Ｂ）で成長した大腸菌の２
次元SDS-PAGEによる分離を示す。２つのゲルから切り出したタンパク質の位置を
本図Ａに示す。

【図４】図３に示すスポット３７における混合された消化物の MALDI質量スペクトルを
示す。スペクトルは２つの種が存在することを示しており、そのうちアスタリス
クで示すペプチドの第１の列は、MS/MS 配列決定により recA（ＤＮＡ依存性Ａ
ＴＰアーゼ）として同定された発現レベルが変化していないタンパク質より発生
している。第２の列は、炭素が限定された条件下で３重に折れて増殖した malE
（ペリプラズム内でのマルトース結合タンパク質）として同定されたタンパク質
より発生している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 33/68 33/68 27/26 ３１５Ｚ３１５Ｈ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】タンパク質を標識する方法であって、（ａ）タンパク質のリジン残基に存在するε−アミノ酸基を阻害するために該
タンパク質を保護剤で処理する工程と、（ｂ）上記タンパク質を開裂してペプチド混合物にする工程と、（ｃ）上記ペプチド混合物を上記ペプチドのＮ末端アミノ酸に結合する標識剤
で処理する工程とを備えている方法。
【請求項２】上記工程（ａ）が上記タンパク質のスクシニル化である請求
項１記載の方法。
【請求項３】上記保護剤が無水コハク酸である請求項２記載の方法。
【請求項４】上記工程（ｂ）における開裂が Asp/GluC（V8）プロテアー
ゼを用いたインキュベーションによるものである請求項１乃至３の何れか１つに
記載の方法。
【請求項５】上記工程（ｃ）が 1-(H4/D4 ニコチノイルオキシ)スクシン
イミド（H4又はD4 Nic-NHS）エステルで処理する工程である請求項１乃至４の何
れか１つに記載の方法。
【請求項６】タンパク質を同定及び／又は解析する方法であって、請求項１乃至５の何れか１つに記載の方法によってタンパク質を標識する工程
と、該工程の後に続く（ｄ）上記ペプチド上の標識量の検出又は測定を行う工程とを備えている方法。
【請求項７】上記検出又は測定が質量分析法によって行われる請求項６記
載の方法。
【請求項８】上記質量分析法が MALDI 質量分析法である請求項７記載の
方法。
【請求項９】（ｅ）上記標識されたペプチドのアミノ酸配列を同定する工程を備えている請求項６乃至８の何れか１つに記載の方法。
【請求項１０】上記工程（ｅ）がイオントラップ型質量分析計を用いた質
量スペクトル分析によるものである請求項９記載の方法。
【請求項１１】上記タンパク質が標識化の前に他のタンパク質から分離さ
れている請求項１乃至１０の何れか１つに記載の方法。
【請求項１２】上記タンパク質が１Ｄ又は２Ｄポリアクリルアミドゲル電
気泳動法（PAGE）により分離されている請求項１１記載の方法。
【請求項１３】第１の細胞と第２の細胞におけるタンパク質発現を比較又
は決定する方法であって、（i）第１の細胞と第２の細胞からタンパク質を得る工程と、（ii）請求項１乃至５の何れか１つに記載の方法により上記第１の細胞と上
記第２の細胞からのタンパク質をそれぞれ標識する工程であって、第１の標識剤
が上記第１の細胞からのタンパク質の識別に使用され、第２の標識剤が上記第２
の細胞からのタンパク質の識別に使用されると共に、上記第１の標識剤と第２の
標識剤が識別可能となっている工程と、（iii）ペプチド上の第１及び第２の標識剤の量をそれぞれ検出又は測定する
工程とを備えている方法。
【請求項１４】上記第１の標識剤と第２の標識剤とが質量を基準として識
別可能になっている請求項１３記載の方法。
【請求項１５】上記工程（iii）が MALDI MS である請求項１４記載の方
法。
【請求項１６】上記第１の標識剤と上記第２の標識材のうち、何れか一方
が軽い同位体を用いた標識を備え、残りの他方が重い同位体を用いた標識を備え
ている請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】上記第１の標識剤と上記第２の標識材のうち、何れか一方
が 1-(H4 ニコチノイルオキシ)スクシンイミド（H4 Nic-NHS）エステルであり、
残りの他方が 1-(D4 ニコチノイルオキシ)スクシンイミド（D4 Nic-NHS）エステ
ルである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】（iv）上記標識されたペプチドのアミノ酸配列を同定する工程を備えている請求項１３乃至１７の何れか１つに記載の方法。
【請求項１９】上記工程（iv）がイオントラップ型質量分析計を用いた質
量スペクトル分析によるものである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】上記標識されたペプチド混合物を互いに混ぜ合わせてから
上記工程（iii）を行う請求項１３乃至１９の何れか１つに記載の方法。
【請求項２１】ペプチド及び／又はタンパク質に対する標識剤としての、
識別用に同位体で標識した２種類以上のスクシニル化剤の使用。
【請求項２２】上記スクシニル化剤が 1-(H4 ニコチノイルオキシ)スクシ
ンイミドエステルと 1-(D4 ニコチノイルオキシ)スクシンイミドエステルである
請求項２１記載のスクシニル化剤の使用。