CN107974443A

CN107974443A - 一种用于制备脾肽的酰化蛋白酶组合物

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Publication number: CN107974443A
Application number: CN201711452895.2A
Authority: CN
Inventors: 栗婧闻
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2018-05-01

Abstract

本发明公开了一种全新的、用于制备脾肽的酰化蛋白酶组合物。本酰化蛋白酶组合物是由蛋白酶（包括风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶中的两种或两种以上组合物）经琥珀酸酐酰化改性而得。在将动物来源的脾脏经过预处理后，通过此酰化蛋白酶组合物在不同ph环境下进行水解，可制得具有特定分子量范围的脾肽产物。相较于传统的蛋白水解酶，本蛋白水解酶组合物在制备多肽的过程当中，水解蛋白的速率更快、水解酶用量更少，并且制得的脾肽产物可具有特定的分子量范围。所得脾肽产物进入人体后，无需再经胃液、小肠水解，可由人体直接吸收，能够更加有效的调节体内各个系统和细胞的生理功能。所得活性多肽产物可作为原料广泛用于食品、药品及保健品行业。

Description

一种用于制备脾肽的酰化蛋白酶组合物

技术领域

本发明涉及医药技术领域。具体地，本发明公开了一种用于制备脾肽的酰化酶组合物，将动物来源的脾脏经过预处理后，通过此酶组合物在不同 ph环境下进行水解，得到具有特定分子量范围及功能性作用的脾肽产物。

背景技术

与未经制备成脾肽的脾组织原材相比，制备所得的脾肽更易被人体吸收，能更加迅速的给机体提供能量，能够更加有效的调节体内各个系统和细胞的生理功能。同时，相比较脾脏内的蛋白类物质，脾肽在具备广泛的功能特性和生理活性的同时，具有更加稳定的生物活性，剔除出了蛋白类物质自身可能存在异味、易发生变性等固有缺点，具有更好的耐酸性和耐热稳定性，依据脾肽自身的特性，可开发出具有相应功能的产品，其在食品、保健品、发酵食品及医药行业中都有着广泛的应用。

当前国内活性多肽的制备方法主要有酸解法即化学降解法和酶解法，化学降解法易改变多肽物质的氨基酸的构型，使多肽本身受到严重破坏，导致多肽物质丧失原有的生物活性功能，因此，在我国生产的活性肽多采用酶解法制备，相较于化学降解法，酶解法可以在特定的条件下对蛋白类物质进行定位水解，水解的程度可以控制，完整的保留了多肽物质的理化性质和生理功能。因此，在生产活性多肽的过程中酶的选择是关键。

目前国内对制备活性多肽的研究多集中在动物脑肽上，通过相关文献及专利查阅可发现，关于脑肽的制备有着大量的工艺研究，在其制备过程中，针对酶种的选择和生产技术路线已有成熟的模式。但是针对脾肽的制备却缺乏相应的研究，并且针对动物脑肽的酶种选择及生产工艺对其他种类活性多肽并不具备普适性。专利CN104225572 A 中，公布了一种脑蛋白水解物及其制备方法，此专利针适用于动物脑肽产物的制备且所得脑肽产物的为分子量小于 1000 Da的短链多肽。 CN 103125989 A 中发明了一种利用超声辅助酶解，通过超临界萃取方法获得鱼脑肽产物的方法，所用技术路线较为复杂，不利于实际生产且所针对对象具有局限性。CN 104511007 A 中涉及了一种猪脑水解物的制备方法。专利CN103285372 A 中采用了电渗析的工艺制备了具有较低氯化钠含量的猪脑肽。其他众多相关专利中均存在同一问题，其所公开的技术研究在生产过程中对于水解酶种的选择都相对单一，消耗酶量过大，反应时间过长，最终所制备的脾肽的分子量也无法人为的通过生产过程加以控制。

国内目前针对脾肽的制备的相关研究较少，并且由于在当前关于活性多肽制备的研究当中存在两个短板，第一是，大量关于活性多肽制备的研究仅局限于动物脑肽，忽略了针对其他来源的活性多肽制备的研究。第二，在制备多肽过程中最为关键的酶种选择上固化、单一，水解效率低下，使得制备方法普适性不强且无法实现生产工艺和产品收率上的最优化。此外，利用当前的酶解法制备的活性多肽，所得多肽产品的分子量无法在生产过程中进行限定，通常只能在多肽制备完成后通过固定截留分子量的半透膜或滤膜的过滤来得到一定分子量范围的多肽产品，因此造成了大量的多肽产品损失且所得多肽的分子量范围无法人为限定。因此，开发一种适用于脾肽的制备并且能够人为设定脾肽产物分子量的技术方案有着现实的必要。

发明内容

基于此，本发明目的在于克服现有多肽制备过程中的局限性，提供一种高效的、可以广泛应用于各种动物来源脾肽的制备的酰化蛋白酶组合物，并且使最终制备的脾肽产品的分子量可在生产过程中实现人为设定。

本发明公开了由酰化风味蛋白酶、酰化木瓜蛋白酶、酰化胰蛋白酶中的两种或两种以上组成的新型的、高效的酰化蛋白酶组合物，可广泛用于各种动物来源的脾肽的制备。

本发明通过对酰化蛋白酶的选择及所选酶用量配比的调整，可制备具有目标分子量范围的活性多肽，所制备的脾肽分子量可限定在200-10000Da区间内的任意分子量范围。

具体技术方案如下：

酰化蛋白酶的制备：本发明描述的酰化蛋白酶是通过对风味蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶进行琥珀酰化制备的。

在蛋白酶改性过程当中，需将琥珀酸酐在PH7.5-10.0条件下不断加入到蛋白酶溶液当中进行琥珀酰化，采用邻苯二甲醛法检测酰化程度，至蛋白酶酰化完全。

酰化后的蛋白酶溶液需采用1KDA的透析袋在4℃下透析8-16个小时，后经冻干24小时既得本酰化蛋白酶。

原料预处理：将动物来源的脾脏用生理盐水清洗，干燥后粉碎，作为水解原料备用。

取水解原料加入到2~9倍重量生理盐水中，室温条件下进行匀浆，制得水解液

盐酸溶液调节水解液ph=5.0~7.0，加入重量为水解液重量 0.1-7% 的酰化风味蛋白酶或酰化木瓜蛋白酶中的一种或两种，50℃水解1～2h。

加入氢氧化钠溶液调节水解液 ph=9.0~11.0，加入总重量为水解液重量0.1-9%的酰化胰蛋白酶，50℃水解时间2~2.5h。

水解结束后，100℃加热水解液10min~15min进行酶灭活，冷却后，调节水解液ph=6.8~7.2，5000-7500 转 / 分钟离心，得到上清液，10000Da 截留分子量的超滤膜进行超滤，得超滤液，纳滤浓缩，得脾肽产物。

具体实施方式

实施例1 ：琥珀酰化木瓜蛋白酶的制备。

在维持温度35℃-60℃条件下，将100g木瓜蛋白酶溶于800ml水中，溶解过程始终保持溶液PH在7.5-10.0之间，待完全溶解向溶液中逐量加入琥珀酸酐，继续保持溶液PH在7.5-10.0之间，以邻苯二甲醛法测定蛋白酶酰化程度，酰化完全后即可停止加入，将酰化完成的蛋白酶溶液置于4℃下进行透析12小时，透析后溶液加入1%甘露醇作为冻干保护剂对蛋白溶液进行冻干24小时，既得所述辅料。

琥珀酰化风味蛋白酶及琥珀酰化胰蛋白酶的制备过程同实例1。

实施列2 3000~5000Da 羊脾多肽的制备。

酰化蛋白酶的制备过程同实例1。

原料预处理：将新鲜的羊脾经生理盐水洗净后，干燥粉碎，作为水解原料备用。

将粉碎后的羊脾加入到3倍重量的生理盐水中，室温条件下进行匀浆，制得水解液。

盐酸溶液调节羊脾水解液 ph=6.0，加入总重量为水解液重量6.3%的酰化风味蛋白酶和酰化木瓜蛋白酶，二者加入的重量比为0.9：1.7，50℃水解2h。

加入氢氧化钠溶液调节羊脾水解液 ph=9.5，加入总重量为水解液重量4.4%的酰化胰蛋白酶，50℃水解时间2～2.5h。

水解结束后，100℃加热羊脾水解液15min进行酶灭活，冷却后，调节羊脾水解液ph=6.8~7.2，5000-7500 转 / 分钟离心，得到上清液，10000Da 截留分子量的超滤膜进行超滤，得超滤液，纳滤浓缩，得活性羊脾多肽产物。

羊脾多肽分子量测定结果

羊脾多肽分子量分布

由羊脾多肽分子量分布可知，所得分子量在3000~5000Da 之间的羊脾肽占制得的羊脾肽总量的91.2%。

实施例3 酰化蛋白酶与未酰化蛋白酶水解效率对比

参照实施例1制备酰化木瓜蛋白酶、酰化风味蛋白酶及酰化胰蛋白酶。

原料预处理：将新鲜的猪脾经生理盐水洗净后，干燥粉碎，作为水解原料备用。

取两份等量的粉碎后的猪脾加入到2倍重量的生理盐水中，室温条件下进行匀浆，制得水解液。

盐酸溶液调节猪脾水解液 ph=5.5，一份加入总重量为水解液重量4.7%的风味蛋白酶及木瓜蛋白酶，二者加入的重量比为3：1.1；另一份加入总重量为水解液重量4.7%的酰化风味蛋白酶及酰化木瓜蛋白酶，二者加入的重量比为3：1.1 ，50℃水解2h。

加入氢氧化钠溶液调节两份猪脾水解液 ph=9.5，分别加入总重量为水解液重量2.5%的胰蛋白酶和酰化胰蛋白酶，50℃水解时间2~2.5h。

水解结束后，100℃加热猪脾水解液15min进行酶灭活，冷却后，调节猪脾水解液ph=6.8~7.2，5000-7500 转 / 分钟离心，得到上清液，10000Da 截留分子量的超滤膜进行超滤，得超滤液，纳滤浓缩，得两种活性猪脾多肽产物。

猪脾多肽含量测量结果

未酰化蛋白酶组猪脾多肽含量测定结果

酰化蛋白酶组猪脾多肽含量测定结果

通过对猪脾多肽的含量测定可知，酰化蛋白酶组在相同的ph环境、时间及酶用量条件下，通过水解蛋白制备多肽的效率要高于未酰化蛋白酶组。

Claims

1.一种用于制备脾肽的酰化蛋白酶组合物，其特征在于，将动物来源的脾脏经过预处理后，利用此酰化蛋白酶组合物在不同 ph环境下对其进行水解，可在相较于传统蛋白酶更少酶用量的前提下，更加快速的制得具有特定分子量范围的脾肽产物。

2.根据权利要求1所述的一种用于制备脾肽的酰化蛋白酶组合物，其特征在于，本酰化蛋白酶组合物是由蛋白酶（包括风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶中的两种或两种种以上组合物）经琥珀酸酐酰化制备而得。

3.根据权力要求2所述的酰化蛋白酶组合物，其特征在于，所述的酰化蛋白酶组合物在水解过程中的总用量为水解底物重量的 0.1-16% 。

4.根据权力要求2所述的酰化蛋白酶组合物，其特征在于，当所述的酰化蛋白酶组合物中包括酰化风味蛋白酶、酰化木瓜蛋白酶及酰化胰蛋白酶中的两种或两种以上时，其相互之间的重量比为（1~5):(1~15)：(0.2~10)。

5.根据权利要求1所述的一种用于制备脾肽的酰化蛋白酶组合物，其特征在于，所述的不同 ph环境包含以下两种ph 环境中的一种或两种：ph=5.0~8.0，优选 ph=5.0~7.0; ph=8.5~12,优选 ph=9~11。

6.根据权利要求1所述的一种用于制备脾肽的酰化蛋白酶组合物，其特征在于，通过琥珀酸酐对蛋白水解酶进行酰化改性，引入琥珀酰基封闭蛋白酶中氨基阳离子，减弱蛋白酶分子之间的静电作用，降低蛋白酶分子间的聚集作用，使蛋白酶的分子间分散性增大，提高酶对底物的水解效率，降低水解酶使用量，加速水解进程。

7.根据权利要求1所述的具有限定分子量范围的脾肽产物，其特征在于，通过对酶组合物中酶的用量及配比进行调整，可将所制备的脾肽产物的分子量限定在200-10000Da区间中的任意分子量范围内。

8.根据权利要求1所述的一种用于制备脾肽的酶组合物，其特征在于，所述的动物来源的脾脏可以是任意一种哺乳动物的脾脏或任意几种哺乳动物脾脏的化合物。