CN112126669B

CN112126669B - 免疫调节用的泥丁肽及其制备方法

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Publication number: CN112126669B
Application number: CN202010972082.1A
Authority: CN
Inventors: 何建林; 洪碧红; 谭然; 白锴凯; 牛四文; 唐超
Original assignee: Third Institute of Oceanography MNR
Current assignee: Third Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-09-16
Also published as: CN112126669A

Abstract

本发明公开泥丁肽及其制备方法，具体的其中20‑25％的泥丁肽分子量大于1000，75‑80％的泥丁肽分子量小于1000。本发明提供的泥丁肽对KM鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响，可以显著的促进脾淋巴细胞的增殖，同时，泥丁肽增加了小鼠巨噬细胞吞噬中性红的能力，因此本发明所述的泥丁肽具有免疫调节功能。

Description

免疫调节用的泥丁肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及具有免疫调节能力的泥丁肽。

背景技术

可口革囊星虫，学名：Phascolosoma esculenta，俗称泥丁，隶属于星虫动物门，为我国土著种，广泛分布于长江口以南的沿海地区，产量丰富。可口革囊星虫是高蛋白低脂肪的海洋生物。我国多种草本中记载了其食用和药用价值，是我国民间传统药食滋补佳品，有些地区用其代替中药冬虫夏草。现有技术对可口革囊星虫多糖进行了大量研究，如公告号CN103483462B公开了可口革囊星虫多糖具有抗败血症的作用，但是对其蛋白质的研究甚少。

发明内容

为解决现有技术的缺陷，本发明提供了泥丁肽及其制备方法，具体的其中20-25%的泥丁肽分子量大于1000，75-80%的泥丁肽分子量小于1000。本发明提供的泥丁肽对KM鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响，可以显著的促进脾淋巴细胞的增殖，同时，泥丁肽增加了小鼠巨噬细胞吞噬中性红的能力，因此本发明所述的泥丁肽具有免疫调节功能。

具体，一方面，本发明提供了一种泥丁肽，其中20-25%的泥丁肽分子量大于1000，75-80%的泥丁肽分子量小于1000。

在一些实施例中，蛋白质含量70-72%，灰分3-4%，水分10-12%，总糖5-6%。

在一些实施例中，酸溶性蛋白质68-72%，和/或游离氨基酸6-8%，和/或低聚肽61-63%。

在一些实施例中，所述游离氨基酸包括精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）、丙氨酸（Ala）、苏氨酸（Thr）、甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）、丝氨酸/脯氨酸（Ser/Pro）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、甲硫氨酸（Met）、组氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）。

另一方面，本发明提供了一种制备本发明所述泥丁肽的制备方法，采用以下方法制备得到：

a)前处理：将水加入泥丁体壁肉，搅拌，调节温度及pH值；

b)酶解：加入蛋白酶酶解，酶解是一次或多次，每次酶解时间5-7小时；

c)：后处理：离心，上清液冻干既得。

在一些实施例中，所述蛋白酶包括：胰蛋白酶、动物蛋白水解酶、木瓜蛋白酶、风味酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶和胃蛋白酶中的一种或多种。

在一些实施例中，所述酶解是二次或三次，；每次酶解完，灭酶后再进行下一次酶解。

在一些实施例中，本发明泥丁肽采用以下方法制备得到：

（1）前处理：泥丁体壁肉，加入水，搅拌，加热至45-55 °C，调pH至7-8；

（2）第一酶解：加入动物蛋白水解酶，搅拌5-7 h，灭酶；

（3）第二酶解：调节温度至45-55 °C，调pH至6-7，加入胰蛋白酶，搅拌5-7 h，灭酶；

（4）后处理：离心，上清液冻干既得。

在一些实施例中，动物蛋白水解酶用量为泥丁体壁肉的1-3%；胰蛋白酶用量是泥丁体壁肉的1-3%。

在一些实施例中，调pH的调节剂是酸调节剂或碱调节剂。

本发明提供的泥丁肽对KM鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响，可以显著的促进脾淋巴细胞的增殖，同时，泥丁肽增加了小鼠巨噬细胞吞噬中性红的能力，因此本发明所述的泥丁肽具有免疫调节功能。

详细说明

一方面，本发明提供了一种泥丁肽，其中20-25%的泥丁肽分子量大于1000，75-80%的泥丁肽分子量小于1000。

在一些实施例中，其中22.7%的泥丁肽分子量大于1000，77.3%的泥丁肽分子量小于1000。

在一些实施例中，蛋白质含量70.36%，灰分3.9%，水分10.23%，总糖5.5%。

在一些实施例中，酸溶性蛋白质69.43%，和/或游离氨基酸6.89%，和/或低聚肽62.54%。

在一些实施例中，所述游离氨基酸包括0.8-1.0%精氨酸（Arg）、0.8-1.0%赖氨酸（Lys）、0.5-0.6%丙氨酸（Ala）、0.3-0.4%苏氨酸（Thr）、0.3-0.4%甘氨酸（Gly）、0.4-0.5%缬氨酸（Val）、0.3-0.4%丝氨酸/脯氨酸（Ser/Pro）、0.9-1.0%异亮氨酸（Ile）、0.2-0.4%亮氨酸（Leu）、0.4-0.5%甲硫氨酸（Met）、0.1-0.2%组氨酸（His）、0.2-0.3%苯丙氨酸（Phe）、0.8-0.9%谷氨酸（Glu）、0.01-0.03%半胱氨酸（Cys）、0.1-0.2%酪氨酸（Tyr）

在一些实施例中，所述游离氨基酸包括0.90%精氨酸（Arg）、0.95%赖氨酸（Lys）、0.55%丙氨酸（Ala）、0.35%苏氨酸（Thr）、0.32%甘氨酸（Gly）、0.45%缬氨酸（Val）、0.32%丝氨酸/脯氨酸（Ser/Pro）、0.92%异亮氨酸（Ile）、0.30%亮氨酸（Leu）、0.49%甲硫氨酸（Met）、0.14%组氨酸（His）、0.22%苯丙氨酸（Phe）、0.83%谷氨酸（Glu）、0.02%半胱氨酸（Cys）、0.14%酪氨酸（Tyr）。

在一些实施例中，所述泥丁肽采用以下方法制备得到：

a)前处理：将水加入泥丁体壁肉，搅拌，调节温度及pH值；

c)：后处理：离心，上清液冻干既得。

调节温度及pH值是基于后续酶解选择的具体酶种类来进行的，不同确定的酶具有确定的适应性温度及pH值是本领域公知的。

在一些实施例中，所述蛋白酶包括：胰蛋白酶、动物蛋白水解酶。

在一些实施例中，所述蛋白酶用量为泥丁体壁肉的1-3%。

在一些实施例中，所述蛋白酶用量为泥丁体壁肉的2%。

在一些实施例中，所述酶解是二次或三次，每次酶解完，灭酶后进行下一次酶解。

在一些实施例中，所述酶解是二次，第一次采用动物蛋白水解酶，第二次采用胰蛋白酶。

在一些实施例中，所述泥丁肽采用以下方法制备得到：

a)前处理：泥丁体壁肉，加入水，搅拌，加热至45-55 °C，调pH至7-8；

b)第一酶解：加入动物蛋白水解酶，搅拌5-7 h，灭酶；

c)第二酶解：调节温度至45-65 °C，调pH至6-7，加入胰蛋白酶，搅拌5-7 h，灭酶；

d)后处理：离心，上清液冻干既得。

在一些实施例中，动物蛋白水解酶用量为泥丁体壁肉的2%；胰蛋白酶用量是泥丁体壁肉的2%。

在一些实施例中，调节pH可采用常规的调节剂，根据需要可以是酸调节剂，也可以是碱调节剂，pH调节剂本身对泥丁肽没有影响。在一些实施例中，pH调节剂为Ca(OH)₂。

另一方面，本发明提供了一种制备本发明所述泥丁肽的方法，其特征在于，包括：

a)前处理：将水加入泥丁体壁肉，搅拌，调节温度及pH值；

c)：后处理：离心，上清液冻干既得。

在一些实施例中，所述蛋白酶用量为泥丁体壁肉的1-3%。

在一些实施例中，所述蛋白酶用量为泥丁体壁肉的2%。

在一些实施例中，所述制备泥丁肽的方法包括：

（2）第一酶解：加入动物蛋白水解酶，搅拌5-7 h，灭酶；

（4）后处理：离心，上清液冻干既得。

在一些实施例中，所述制备泥丁肽的方法包括：

（1）前处理：泥丁体壁肉，加入水，搅拌，加热至50 °C，调pH至7.5；

（2）第一酶解：加入动物蛋白水解酶，搅拌6 h，灭酶；

（3）第二酶解：冷却后调节温度至50 °C，调pH至6.5，加入胰蛋白酶，搅拌6 h，灭酶；

（4）后处理：冷却离心，上清液冻干既得。

在一些实施例中，所述灭酶是指90 °C处理10 min。

定义和一般术语

除非另有说明，本发明所用在说明书和权利要求书中的术语具有下述定义。

现在详细描述本发明的某些实施方案。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下（包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等），以本申请为准。

应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个（种）”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个（即至少一个）宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。

可口革囊星虫, 学名：Phascolosoma esculenta, 俗称泥丁。

GB/T 22729-2008《海洋鱼低聚肽粉》，标准规定了海洋鱼低聚肽粉的产品分类、技术要求、试验方法、检验规则以及标签、包装、运输和贮存。该标准适用于海洋鱼低聚肽粉产品的生产、检验和销售。

GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，标准规定了食品中蛋白质的测定方法。标准第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定，第三法适用于蛋白质含量在10g/100g以上的粮食、豆类奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的测定。该标准不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品的测定。

本发明百分比均为质量百分比，质量分数。

本发明分子量一般指的是相对分子量。

本发明所涉及的数值或数值范围，如2%、1-3%，pH 7-8，时间5-7 h，温度45-55 °C等，字面上包括两端点值及中间值，但与两端值具有一定差异的也属于等同技术，与具体值有一定差异的也属于等同技术，在本发明保护范围内；在一些实施例，差异为0至±10%，如±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、±1%、±0%；差异为0理解为无差异。

一般制备过程

一般地，本发明的多肽可以通过本发明所描述的方法制备得到。下面的反应方案和实施例用于进一步举例说明本发明的内容。

所属领域的技术人员将认识到：本发明所描述的制备过程可以用来制备地许多本发明的其他具体多肽，且用于制备本发明的多肽的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。例如，根据本发明那些非例证的多肽的制备可以成功地被所属领域的技术人员通过修饰方法完成，如适当的调整参数，通过利用其他已知的试剂除了本发明所描述的，或将反应条件做一些常规的修改。另外，本发明所公开的制备或已知的制备条件也公认地适用于本发明其他产品的制备。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例

一、泥丁肽的制备

清水洗净鲜活泥丁体表泥沙，再以钝头竹签将泥丁体腔捅翻，除去内脏至无残留，保留体壁。取处理好的泥丁体壁肉200 g，加入600 mL水，搅拌，水浴加热至50 °C，少量Ca(OH)₂溶液调pH至7.5，加入4 g动物蛋白水解酶，搅拌6 h，90 °C灭酶10 min，冷却后调节温度至50°C，调pH至6.5，加入胰蛋白酶4 g，搅拌6 h，90 °C灭酶10 min，冷却离心，上清液冻干既得。

二、泥丁肽的表征

依据GB/T 22729-2008《海洋鱼低聚肽粉》以及GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》所述方法，对泥丁肽进行表征，结果如下：

泥丁肽的分子量分布

样品名称	>1000	<1000
			泥丁肽	22.7%	77.3%

泥丁肽的含量测定

泥丁肽中游离氨基酸含量分析

序号	氨基酸	泥丁肽氨基酸含量
			1	精氨酸（Arg）	0.90%
2	赖氨酸（Lys）	0.95%
			3	丙氨酸（Ala）	0.55%
4	苏氨酸（Thr）	0.35%
			5	甘氨酸（Gly）	0.32%
6	缬氨酸（Val）	0.45%
			7	丝氨酸/脯氨酸（Ser/Pro）	0.32%
8	异亮氨酸（Ile）	0.92%
			9	亮氨酸（Leu）	0.30%
10	甲硫氨酸（Met）	0.49%
			11	组氨酸（His）	0.14%
12	苯丙氨酸（Phe）	0.22%
			13	谷氨酸（Glu）	0.83%
14	天冬氨酸（Asp）	未检出
			15	半胱氨酸（Cys）	0.02%
16	酪氨酸（Tyr）	0.14%
			合计		6.89%

三、脾淋巴细胞增殖实验

将小鼠脱臼处死，立即置于75%酒精中浸泡5 min，无菌取脾，于PBS中清洗2遍，置于盛有4 °C预冷PBS的200目细胞筛中，用5 mL注射器内芯研磨，研磨后透过细胞筛的即为脾细胞悬液。于1500 r/min，4 °C离心5 min，弃上清；加入3 mL Tris-NH₄Cl溶液混匀，于1500 r/min，4 °C离心5 min，弃上清，加入1640RPMI-FBS液重悬细胞，稍静置，转移上清液到新的离心管，以5×10⁶ /mL，200 μL/孔铺96孔板，2 h后加入泥丁肽、海参肽或阳性药脂多糖（LPS）处理。给药46 h后，以1:10的比例加入CCK8，37 °C培养箱孵育2~3 h后，放入酶标仪中，检测OD 450 nm的吸光度，620 nm为参比波长。取各组平均）OD值，按下式计算各浓度样品对脾淋巴细胞的增殖率影响。

增殖率（%）=（OD_样品组-OD_{空白对照组}）/（OD _{正常对照组}-OD_{空白对照组}）×100%

实验结果：

泥丁肽对脾淋巴细胞增殖的影响（Mean±SD, n=6）

注：*p<0.05 vs 对照，****p<0.0001 vs 对照

本实验检测了不同浓度的泥丁肽对KM鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响。实验结果表明，泥丁肽可以显著的促进脾淋巴细胞的增殖，具有免疫调节功能，其效果显著优于海参肽。

四、巨噬细胞实验

用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养巨噬细胞（Raw264.7），调整细胞浓度，将其接种于96孔细胞培养板中，使得细胞浓度为2×10⁴个/孔，然后加入不同浓度受试样品。以不加药组为对照。培养24小时之后吸去培养基，用PBS洗涤多余的培养基，加入0.08％中性红，37 °C下，5％CO₂孵育30 min，PBS洗净多余中性红，加细胞裂解液(无水乙醇：冰醋酸＝1:1，体积比)，震荡10-15mim后，在酶标仪上540 nm处测吸光度值，通过吸光值的大小评价样品促进巨噬细胞吞噬中性红能力。

吞噬率（%）=（OD_样品组-OD_{空白对照组}）/（OD _{正常对照组}-OD_{空白对照组}）×100%

实验结果：

泥丁肽对巨噬细胞(Raw264.7)吞噬中性红能力的影响（Mean±SD, n=6）

注：*p<0.05 vs 对照，***p<0.001 vs 对照，****p<0.0001 vs 对照

实验结果表明泥丁肽增加了小鼠巨噬细胞吞噬中性红的能力，具有免疫调节作用，且效果显著优于虾蛋白肽。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“另一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种泥丁肽，其特征在于，其中20-25%的泥丁肽分子量大于1000，75-80%的泥丁肽分子量小于1000；所述泥丁肽的制备方法包括将泥丁体壁肉进行酶解，所述酶解包括：加入蛋白酶酶解，所述蛋白酶包括动物蛋白水解酶和胰蛋白酶，动物蛋白水解酶用量为泥丁体壁肉的1-3%；胰蛋白酶用量是泥丁体壁肉的1-3%；所述泥丁肽中，蛋白质含量70-72wt%，灰分3-4wt%，水分10-12wt%，总糖5-6wt%；所述泥丁肽的制备方法包括：

（2）第一酶解：加入动物蛋白水解酶，搅拌5-7 h，灭酶；

（4）后处理：离心，上清液冻干既得。

2.根据权利要求1所述的泥丁肽，其特征在于，酸溶性蛋白质68-72wt%，和/或游离氨基酸6-8wt%，和/或低聚肽61-63wt%。

3.根据权利要求2所述的泥丁肽，其特征在于，所述游离氨基酸包括精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）、丙氨酸（Ala）、苏氨酸（Thr）、甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）、丝氨酸/脯氨酸（Ser/Pro）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、甲硫氨酸（Met）、组氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述泥丁肽的方法，其特征在于：

（2）第一酶解：加入动物蛋白水解酶，搅拌5-7 h，灭酶；

（4）后处理：离心，上清液冻干既得；

动物蛋白水解酶用量为泥丁体壁肉的1-3%；胰蛋白酶用量是泥丁体壁肉的1-3%。

5.根据权利要求4所述的制备泥丁肽的方法，其特征在于，调pH的调节剂是酸调节剂或碱调节剂。