KR20200124053A

KR20200124053A - 관능적 쓴맛개선 및 소화율이 향상된 저분자 발효대두단백 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20200124053A
Application number: KR1020190047436A
Authority: KR
Inventors: 정용진; 황지홍; 박다현
Original assignee: 주식회사 케이엠에프
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2020-11-02

Abstract

본 발명은 대두분말로부터 효소적 가수분해를 수행한 후에 미생물 균주를 더 사용하여 발효처리하여 수득되는 발효 분리 대두단백의 제조방법이다. 그에 따라 제조된 대두의 쓴맛과 비린 맛이 동시에 개선시킬 뿐 아니라, 14KD이하의 저분자 펩타이드를 증가시켜 단백질의 소화흡수를 증진시키는 데 그 특징이 있는 분리대두단백을 제공함에 있어서 뉴트라제(Neutrase)와 바실러스 서브틸리스 N₂ 균주를 선택하여 순차 분해 발효처리방법을 제시한 가공식품산업 상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

관능적 쓴맛개선 및 소화율이 향상된 저분자 발효대두단백 및 그 제조방법{Low MW soy protein isolate improved on sensual bitter, fishy taste and digestibility, and preparation method of the same}

본 발명은 관능적 쓴맛과 비린 맛이 개선되고 소화율이 향상된 저분자 분리 대두단백 및 그 제조방법에 관한 것이다.

최근 현대인들은 식생활이 서구화됨에 따라 동물성 단백질을 다량 섭취함으로써 체내에 콜레스테롤을 많이 축적하게 되어 동맥경화성 질환의 원인이 되어 식물성 단백질에 대한 관심이 높아지고 있으며(Park, Y. W. J. Korean Soc. Food Nutr. 1993, 22, 643-649), 그 결과, 건강에 대한 관심증대와 함께 건강식품으로 알려진 콩과 식물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

대두는 콩과 식물 중 가장 단백질 함량이 40%로 풍부하며, 미국 식품의약국(FDA)는 ‘PDCAAS’라는 평가 방법을 통해 대두단백질의 영양가를 계란이나 우유와 같은 완전 단백질로 불리는 동물성 단백질과 같은 1.0등급이라는 최고 수치로 평가하였으며, 이는 쇠고기(0.92)보다 높은 수치이다. 대두에 함유된 불포화 지방산과 제니스테인이란 물질이 혈중 콜레스테롤을 줄이고 암세포의 증식을 억제하며, 콩에 함유된 수용성 비타민과 식이섬유, 사포닌 등의 성분이 항암과 성인병 예방에 효과가 있다는 사실이 입증되면서 우수한 식품소재가 될 수 있다고 재평가 되고 있다. (Park, Y. W. J. Korean Soc. Food Nutr. 1993, 22, 643-649).

분리 대두단백(isolated soy protein) 는 대두에서 단백질 부분만을 분리하여 제품화한 것으로서, 탄수화물, 지방이 제거되어 영양학적으로 완벽한 식물성 단백질원이며 식품 제조 시 사용 및 응용범위가 매우 넓은 식품소재이다. 특히 분리 대두단백은 90% 이상의 단백질을 함유하고 있고 필수아미노산을 풍부하게 제공할 수 있는 양질의 식물성 단백으로써 동물성 단백과 비교하여 가격이 저렴하므로 동물성 단백의 대체식품으로 사용되고 있지만 가공조건에 따른 쓴맛과 콩 비린내 나아가, 소화 흡수율 저하 등으로 인해 제품 개발이 제한되었다.

펩타이드는 여러 종류의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 중합물을 형성하고 있는 것으로 일반적으로 2-50개의 아미노산이 결합되어 있고 분자량이 10,000 Da(dalton)이하의 것을 말한다. 저분자 대두 펩타이드 경우 용해도가 높고 인체 내 흡수속도가 빠르며 알러지 유발 가능성도 매우 낮아 건강식품 소재로 응용이 다양하다. 분자량 1,000 Da 이상의 올리고펩타이드는 소장 내의 담즙산 및 콜레스테롤과 결합하여 배출되어 혈청 콜레스테롤 농도를 낮추는 효과와 항종양, 항고혈압, 면역증강 등의 생리활성 기능이 보고되어 있다.(Kim, J. S. Korea Soybean Digest. 1996, 13, 17-24; Sung, M. K. Korea Soybean Digest. 1996, 13, 19-31).

또한 분자량 1,000 Da 이하의 저분자 대두 펩타이드는 일반 단백질이나 아미노산보다 흡수가 빠르며, 섭취 후 20분 이내 소화가 완료된다. 펩타이드는 복수로 한꺼번에 흡수되는 성질 때문에 빠르게 흡수가 된다. 알러지를 유발하는 큰 분자량의 단백질 및 올리고펩타이드가 제거되어 저알러지 식품이나 비알러지 유아식에도 사용할 수 있다고 보고되고 있다.

펩타이드성 신물질 개발에 이용된 방법으로 효소에 의한 peptide 제조법은 단백질 가수분해 효소를 이용해 큰 단백질을 작은 peptide들과 아미노산으로 분해한 후 그 중에서 원하는 peptide를 분리하거나, peptide에서 아미노산으로 가수분해되는 과정의 역반응을 이용하여 새로운 peptide를 개발하는 것이다. 단백질 가수분해 산물로는 유리아미노산, oligopeptide, 저분자 단백질을 들 수 있으며, 이들은 각각 원래 단백질에서 분해 후 처음과 다른 생리활성을 지니게 되며 이를 이용하여 새로운 생물소재로 개발되고 있으며, 가수분해도를 잘 조정하면 기능성을 향상시킬 수 있다고 제안되고 있으며, 이들 가수분해물이 노화나 발암 억제에 아주 유효한 성분이 되고, 항산화 작용 및 생리활성작용이 밝혀지고 있다(Yeum, D. M. et al. J. Korean Soc. Food Nutr. 1993, 22(2), 226-233; Susumu, M. et al. Agric. Biol. Chem. 1985, 49, 1405; Toshiro, M. et al. Biosci. Biotech. Biochem. 1993, 57, 922; Kim, S. B. et al. Korean J. Food Sci. Technol. 1989, 21(4), 492-497; 山口 Nippon Shokuhin Kogyo Gakkkaishi. 1979, 26, 14; Adler-Nissen, J. J. Agric. Food Chem. 1976, 26, 14).

그러나, 대두에 대한 관심이 증대하면서 대두 및 분리 대두단백을 이용한 식품들이 활발하게 개발되고 있음에도 불구하고 저분자 가수분해 공정에서 관능적으로 쓴맛이 발생되어 식물성 단백질 소재로서의 활용이 매우 제한적이었다.

본 발명자들은 분리 대두단백의 저분자 가수분해 효소와 미생물을 순차적으로 적용하여 관능적 쓴맛뿐 아니라 비린 맛을 동시에 개선하고 소화율이 향상된 저분자화 식물성 대두단백질 및 그 제조 방법을 완성하였다.

종래에도 EU 특허 제 225560호 등에 가수분해된 단백질의 폴리펩타이드의 쓴맛을 개선하기 위한 시도로서 효소적 가수분해 방법이 제안된 바 있다. 사용된 단백 분해효소는 protease이며 대두단백, 글루텐, 유청단백, 카세인, 효모 글로빈, 효모 엑기스, 미생물 유래의 단백질이 사용되었다. 또 국내 공개특허 1995-0013948호에는 치즈, 닭브로스, 카제인, 유청 및 대두단백질의 제거하는 방법이 효소 가수분해물을 Lactobacillus spp. 발효하여 폴리펩타이드 유래의 쓴맛성분을 제거하는 방법이 개시되어있다.

이밖에 Alcalse를 이용한 말태반의 저분자효소적 가수분해물 제조법에 대하여는 국내 등록특허 1751718호에, 그리고 protease를 이용한 저분자 펩타이드 제조를 위한 자라 효소가수분해물을 국내 공개특허 1996-0028910, 또한 protease를 이용한 3KD이하의 유청 단백질 가수분해물을 10-1626291호에 각각 개시되어 있다. 그러나 지금까지 최적 효소의 처리조건과 미생물 균주를 이용하여 분리 대두단백질의 최적 발효조건을 구하여 대두의 관능적 쓴맛과 비린 맛을 동시에 저감시킨 분리 대두단백분말을 제조하는 방법은 지금까지 개시되거나 암시된 바 없다.

(1) Kim HJ, Lee JJ, Cheigh MJ, Choi SY. 1998. Amylase, protease, peroxidase and ascorbic acid oxidase activity of kimchi ingredients. Korean J Food Sci Technol 30: 1333-1338. (2) Yoon JY , Kim NY , Rhee YK , Han MJ (2007) Quality characteristics and biological activities of traditionally fermented Ginseng wine , Food Sci. Biotechno. L, Vol.16 (2) ; pp.198-204 (3) Miller DD, Schricker BR, Rasmussen RR, Van Campen D. 1981. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. Am J Clin Nutr 34: 2248-2256. (4) 허선진, 이시경, 김영찬, 최인욱 (2012). 건강기능 식품소재 연구를 위한 in vitro 소화모델의 개발. 식품과학과 산업, 45(4), 40-49. (5) Knuckles BE, Kuzmicky DD, Betschart AA. 1985. Effect of partially hydrolyzed phytate on in vitro protein digestibility. J Food Sci 50: 1080-1082. (6) Kim EB, Kim EJ, Lee HN, Lee MK, Oh JS, Kim SO, Lee SY. 2008. The quality characteristics of soy cultures using textured soy protein treated with different enzymes. Korean J Food Culture 23: 507-513. (7) Lee MK. 2009. The quality characteristics of soy wan-ja using proteolytic enzyme treated textured soy protein. MS Thesis. Chungang University, Seoul, Korea.

본 출원은 분리 대두단백의 효소적 가수분해물의 미생물의 순차발효를 통하여 대두의 쓴맛뿐 아니라 비린 맛을 동시에 제거하는 가장 바람직한 관능효과 및 소화 흡수율을 갖는 저분자화 분리 대두단백을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 저분자화 분리 대두단백의 진보된 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 출원의 상기 목적은 최적 가수분해효소 선정 단계와; 상기에서 얻은 가수분해효소의 최적 가수분해조건을 설정하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 가수분해물의 소화율 증대를 위해 최적 미생물 균주를 선택하여 발효시키는 단계와; 상기 단계에서 얻은 분리 대두단백 발효물을 건조한 분말을 제조하는 단계로 이루어지고; 상기에서 얻은 분리 대두단백 분말의 쓴맛과 콩 비린 맛 기타 분자량, 유리아미노산 함량, 침전안정성 등 품질을 조사하고 관능검사를 수행하여 평가하는 단계를 통하여 달성된다.

본 발명은 단백질 가수분해효소 뉴트리제(Neutrase)와 발효미생물 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) N₂ 균주(KCTC3014)를 사용하여 신규한 분리 대두단백의 제조방법을 제공하는 효과가 있고, 상기 방법에 따라 쓴맛과 동시에 비린 내가 없으며 14KD이하의 저분자량 펩타이드가 분리 대두단백보다 3배 이상 증진되어 소화율이 향상될 뿐 아니라 침전안정성이 증대된 분리 대두단백분말을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 쓴맛과 비린 맛이 동시에 제거된 저분자화된 분리 대두단백분말 제품의 제조공정도이다.
도 2는 본 발명에 따른 리커드 5점 척도를 사용한 가수분해효소제 선정 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명에 따른 가수분해효소제별 처리결과 그 형상과 모양을 보인 사진도이다.
도 4는 본 발명에 따른 효소제 Neutrase의 농도별, 처리시간별 관능검사 결과를 보인 그림이다.
도 5는 본 발명에 따른 효소 처리 후 미생물 B.subtilis N₂ 균주(KCTC3014) 처리 후 얻은 분리 대두단백분말 최종 제품의 가용성단백질 함량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 ISP와 본 발명에 따른 발효 ISP의 침전안정성을 비교한 사진도이다.

본 발명에 따른 구체적인 실험방법과 실시예는 하기와 같다.

(1) 최적 효소 설정

본 실험에 사용된 효소는 Alcalase 2.4L, Flavourzyme, Neutrase, Protamex는 Novo사 (Novo Nordisk, Bagsvared, Denmark)에서 구입하여 사용하였고, 및 ProteX, Thermoase ㈜세인코퍼레이션에서 제공받아 사용하였다. 가수분해에 적합한 protease를 선발하기 위하여 각각 20%(w/v) 대두분말 용액을 만들어 기질에 대해 protease를 각각 0.2%(w/w)가 되도록 첨가하고 50℃에서 2시간 동안 100 rpm으로 진탕한 후 90℃에서 10분간 효소반응을 정지시키고 8,000 rpm으로 20분간 원심분리후 상등액을 사용하여 고형분 함량, 가수분해도, 관능이 우수한 것을 선별하였다

(2) 최적효소 처리 조건(시간, 효소농도) 설정

가수분해 시간 및 효소 농도에 따른 조건을 확인하기 위해 대두단백에 물을 첨가하여 20.0%(w/v)의 수용액으로 제조하였다. 상기 단계에서 확인한 최적 프로테아제를 총 대두단백중량 대비 0, 0.1, 0.2, ,0.3, 0.5, 0.7%(w/w) 혼합 한 다음 50℃에서 1, 2, 3, 4시간 동안 효소적 가수분해한 시료 중 우수한 것을 선별하였다.

(3) 고형분 함량(상등액)

가수분해물의 고형분 함량은 가수분해한 후 반응이 종료된 반응 혼합물을 원심분리(12,000 pm, 15분)하여 상층액으로부터 2 ml를 취하고, 여기에 20% (v/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid; TCA) 2 mL를 동량 첨가하여 원심분리(8,000 rpm, 15분)한 상등액을 고형분 함량 측청기로(digital refractometer (PR-101, ATAGO Co., Tokyo, Japan) 고형분 함량을 측정하였다

(4) 가수분해물 조성물의 관능평가

리커트 척도의 5점 척도를 사용하였음. ‘매우 좋음, 좋음, 보통, 나쁨, 매우 나쁨’ 으로 범주를 설정하여 ‘매우 좋음’을 1점, ‘좋음’을 2점, ‘보통’을 3점, ‘나쁨’을 4점, ‘매우 나쁨’을 5점으로 하여 점수 환산하였으며, 값이 가장 낮은 실험군을 최적 배합비로 선정하였다.

(5) 아미노산성 질소 분석을 통한 품질평가

아미노산성 질소 (NH2-N)는 식품공전에 준하여 포르몰(Formol)적정법에 의하여 측정하였다. 시료 10 g에 증류수 100 ml을 가하여 균질화 한 후 4,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 그 상등액을 시료로 사용하였으며, 상등액 5 ml에 formaldehyde 용액 10 ml를 가하여 0.1 N NaOH 용액으로 pH 8.3이 되도록 중화적정을 시행하였다. 공시험은 상등액 대신 증류수 5 ml을 이용하였으며 그 값을 이용하여 보정 하였다.

(6) 발효

6-1) 스타터 배양액 제조

스타터 배양액은 혼합 곡물(대두,백미) 10% 용액(w/v)을 균질화한 후 121℃에서 15분간 멸균한 액체 배지 50 mL에 MRS agar plate에서 42 ℃에서 24시간 동안 배양한 Bacillus. subtilis N₂ 균주(KCTC3014)를 접종 후 진탕배양기(SI-900R, JEIO TECH Co., Daejeon, Korea) 에서 42 ℃에서 24시간 동안 배양하여 스타터로 사용하였다.

6-2) 발효대두단백의 발효

가수분해된 ISP에 상기에서 얻은 Bacillus. subtilis N₂(KCTC3014) starter 2.5%(w/w)를 접종하여 항온 발효조에서 30 rpm, 42℃에서 시간별로 발효하여 건조하여 사용하였다.

(7) 유리아미노산분석

유리아미노산 함량은 시료를 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 후 상등액을 취해 0.45 ㎛ membrane filter(PVDF-2545, Chemco Scientific, Osaka, Japan)로 여과한 용액을 유리아미노산 측정시료로 사용하였으며, Amino Acid Analyzer(L-8900, Hitachi, Tokyo, Japan)로 분석하였다.

구성아미노산 함량은 시료를 500 mg 칭량하여 6 N HCl을 1 ml을 가해 질소로 충전한 후 110℃에서 24시간동안 가수분해한 시료를 80℃에서 건조 시킨 후 0.02 N HCl 1 ml을 가하여 잘 교반하며 추출한 후 0.45 μm 필터(PVDF-2545, Chemco Scientific, Osaka, Japan)로 여과하여 0.02 N HCl로 희석하여 사용였으며, Amino Acid Analyzer(L-8900, Hitachi, Tokyo, Japan)로 분석하였다.

(8) 효소활성도 측정

Protease의 활성은 식품공전에 준하여 측정 하였다. 시료 추출액 1 mL에 0.6% casein 기질용액(0.2 M phosphate buffer, pH 7.0)을 넣고 37°C에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 0.44 M trichloroacetic acid(TCA) 5 mL를 넣어 반응을 중지하였다. 실온에서 30분간 방치한 다음 여과지(No.1, Whatman, Buckinghamshire, UK)에 여과한 여액 2 mL에 0.55 M Na₂CO₃ 용액 5 mL와 4배 희석된 Folin reagent 용액 1 mL를 넣어 실온에서 30분간 반응한 후 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질 tyrosine을 단계적으로 희석하여 동일한 방법으로 분석 후 standard curve를 이용하여 1 unit은 1분 동안 tyrosine 1 μg을 유리시키는 양을 환산하여 계산하였다.

α-Amylase 활성 측정은 식품공전에 준하여 측정 하였다. 1% soluble starch 0.1mL에 시료 상등액 0.1mL, phosphate buffer (pH 6.0) 0.1 mL을 섞은 후 100℃에서 5분간 가열하여 시료의 amylase를 불활성화시켜 3,5-dinitrosalicle acid (DNS)법으로 측정하여 대조구로 사용하였다. 그리고 1% soluble starch 0.1 mL에 시료 상등액 0.1 mL, phosphate buffer 0.1 mL을 섞은 후 40℃에서 15분 동안 반응시킨 후 100℃에서 5분간 가열시켜 효소를 불활성화 시키고 DNS법 으로 당의 함량을 측정하였다(Yoon et al. 2008).

(9) 단백질의 생체 이용률

In vitro 아미노산 이용률은 multi-step model 방법으로 실험하였다. Pepsin 용액은 0.1 N HCl에 pepsin 1%를 첨가하여 제조하였으며, pancreatin-bile extract mixture는 0.1 M NaHCO₃에 pancreatin 0.4%와 bile extract 2.5%를 첨가하여 제조하였다. Pepsin-HCl digestion에서는 6 N HCl로 시료의 pH를 2로 보정한 후 pepsin 용액을 1.3%(v/w) 첨가하여 37℃ 진탕수용조에서 2시간 소화시켰다. 물 25 mL와 0.5 N NaHCO₃를 넣은 투석막(Spectra/Por^ⓡ 4, M.W. : 12-14,000, Spectrum Laboratories Inc.)을 시료가 담긴 비커에 넣고 37℃에서 pH 5가 되도록 진탕시킨 후 pancreatin-bile extract mixture를 5 mL 첨가하고 2시간 더 진탕시켰다. 이때 0.5 N NaHCO₃ 첨가량은 시료에 pancreatin-bile extract mixture를 5 mL 첨가한 후 0.5 N KOH로 pH를 7.5로 보정할 때 첨가한 양과 동일 양을 첨가하였다. 진탕 종료 후 투석막 안의 투석액을 membrane filter(pore size 0.45 μm, Advantec MFS, Tokyo, Japan)로 여과하여 가용성 단백질 함량을 측정하였다(Miller DD et al, 2012).

<실시예>

9-1) Lab scale에서의 최적 효소제 설정(가수분해 ISP)

본 발명의 가장 바람직한 실시예는 도 1에 도시되어 있다.

1-1) Lab scale에서의 생산 효소 설정

본 실험에 사용된 공시 효소제는 현재 시판되는 Alcalase 2.4L, Flavourzyme, Neutrase, Protamex Thermoase를 사용하였다. Alcalase 2.4L, Flavourzyme, Neutrase, Protamex는 Novo사 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하여 사용하였고, ProteAX 및 Thermoase ㈜세인코퍼레이션에서 제공받아 사용하였다.

실험실용 가수분해에 사용된 진탕배양기(HB 205SWM, Hanbeak Scientific Co., Korea)에서 5개 효소의 최적 가수분해 조건인 50℃에서 0.5%로 2시간 가수분해 하였으며, 그에 따른 고형분 함량, 관능, 아미노산성 질소 함량을 비교하여 최적 효소를 선정하였다(표 1).

공시효소제

Enzyme	Type	Optimal conditions		Manufacture origin
Enzyme	Type	Temp.(℃)	pH	Manufacture origin
Alcalase	Endo	55-70	6.5-8.5	Bacillus licheniformis
Flavourzyme	Endo/Exo	50	5.0-7.0	Aspergillus orysae
Neutrase	Endo	45-55	5.5-7.5	Bacillus amyloliiensquefaciens
Protamex	Endo	35-60	5.5-7.5	Bacillus sp.
Thermoase	Endo	65-70	5.0-8.5	Bacillus stearothermophilus
ProteAX	Endo	50-60	6.0-9.0	Aspergillus oryzae

식물성 대두단백에 적합한 효소의 농도를 선정하기 위하여, 각 종류별 효소를 처리한 시료를 20% TCA를 처리하여 단백질 침전 후 상등액에 대한 고형분 함량을 측정해본 결과ProteAX 실험군에서 11.8로 가장 높았으며, Flavourzyme이 8.4로 가장 낮게 측정되었다.아미노산성 질소는 아미노산에 포함되어 있는 질소를 말하며 아미노산함량의 예측할 수 있는 지표이다. 아미노산성 질소를 측정해본결과 ProteAX가 649로 가장 높았으며, Alcalse 2.4L이 404로 가장 낮게 측정 되었다. 고형분 및 아미노산성 질소의 함량 측정 결과 고형분이 낮지만 아미노산성 질소 함량이 높은 효소제인 Thermoase, Neutrase, Flavourzyme를 1차 선정하였다(표 2).

상등액 2 ml + 20% TCA 2 ml -> 8,000rpm 10분간 원심분리 후 상등액의 고형분 함량

효소제	Alcalase 2.4L	Flavourzyme	Neutrase	Protamex	Thermoase	ProteAX
고형분 (%)	11.1	8.4	9.6	11.4	10.7	11.8

관능 항목인 쓴 맛과, 콩 비린내를 평가해 본 결과 ProteAX의 경우 맛 강도가 가장 높게 평가되었고, Neutrase의 경우 맛 강도가 가장 낮게 측정되었다. 대부분의 효소처리 단백질의 경우 쓴맛이 강하여 기호도가 매우 떨어짐으로 이 시험결과를 통해 가장 적합한 효소제로 Neutrase를 최종 선정하였다.

1-2) 관능평가(n=6)

리커트 척도의 5점 척도를 사용하여 관능평가를 시행함. ‘매우 좋음’을 1점, ‘좋음’을 2점, ‘보통’을 3점, ‘나쁨’을 4점, ‘매우 나쁨’을 5점으로 하여 점수 환산하였으며, 평균값이 가장 낮은 실험군을 최적 효소농도 및 처리시간으로 선정하였다.

효소제에 따른 관능평가 결과 쓴맛은 protamex, Alcalase 2.4L, Thermoase, ProteAX, Neutrase, Flavourzyme 순으로 나타났으며, 콩 비린 맛의 경우 ProteAX, Thermoase, Flavourzyme, Protamex, Alcalase 2.4L, Neutrase 순으로 나타났다.

쓴맛과, 콩 비린 맛에 대한 관능평가 결과에 따라(표 3~표 4) 점수가 가장 낮은 Neutrase를 최적효소로 선정하였다(도 2).

쓴맛

	매우 쓰다 (5점)	쓰다 (4점)	보통(3점)	쓰지 않다 (2점)	전혀 쓰지 않다 (1점)
Alcalase 2.4L	2	4	0	0	0
Flavourzyme	0	0	1	3	2
Neutrase	0	0	2	3	1
Protamex	5	1	0	0	0
Thermoase	0	3	3	0	0
ProteAX	0	2	4	0	0

콩 비린 맛

	매우 비리다 (5점)	비리다 (4점)	보통(3점)	비리지 않다 (2점)	전혀 비리지 않다 (1점)
Alcalase 2.4L	0	1	1	4	0
Flavourzyme	2	3	1	0	0
Neutrase	0	0	0	4	2
Protamex	0	1	2	3	0
Thermoase	2	4	0	0	0
ProteAX	4	2	0	0	0

관능평가 결과

효소제	고형분	아미노산성 질소 (mg%)	맛 강도(n=6) Max : 60
Alcalase 2.4L	11.1	404	40.8
Flavourzyme	8.4	445	36
Neutrase	9.6	460	22.8
Protamex	11.4	467	45
Thermoase	10.7	526	46.8
ProteAX	11.8	649	48

1-3) 최적효소 처리 조건(시간, 효소농도) 설정

식물성 펩타이드 가수분해물 조제에 적합한 효소의 농도 및 처리시간을 선정하기 위하여, Neutrase를 농도별로 처리하여 50℃에서 1, 2, 3, 4시간 동안 가수분해하였으며, 고형분 함량, 아미노산성 질소 함량, 관능평가가 가장 좋은 실험군의 효소농도 및 처리시간을 최종 선정하였다.

2-1) TCA처리 후 상등액 고형분 함량 측정

농도별 sample 2g + TCA 2ml 혼합 후 원심분리기 8,000rpm, 10분

농도	1h	2h	3h	4h
0	1	1	1	1
0.1	8.1	8.6 (+0.5)	9.0 (+0.4)	9.3 (+0.3)
0.2	8.7	9.2 (+0.5)	9.6 (+0.4)	10.1 (+0.5)
0.3	9.1	9.6 (+0.5)	10.1 (+0.5)	10.5 (+0.4)
0.5	9.4	10.0 (+0.6)	10.5 (+0.5)	10.8 (+0.3)
0.7	9.9	10.6 (+0.7)	11.0 (+0.4)	11.3 (+0.3)

효소제의 농도 및 처리시간에 따라 성상이 묽어졌으며, 효소처리 2시간 이후부터 고형분 함량 증가 속도가 감소 되는 것으로 봤을 때 효소반응 시간은 1~2시간이 적절할 것으로 판단되었다(도 3).

아미노산성 질소 함량 (mg%)

농도	1h	2h	3h	4h
0	6	7	6	5
0.1	93	99(+6)	102(+3)	105(+3)
0.2	95	100(+5)	102(+2)	106(+8)
0.3	100	106(+6)	108(+2)	110(+2)
0.5	102	110(+8)	114(+4)	117(+3)
0.7	107	111(+4)	119(+8)	131(+12)

시간 증가에 따른 아미노산성 질소의 함량 증가보다는 효소제 농도의 증가에 따른 아미노산성 질소 함량 증가가 더 유의적으로 증가하였다(도 1).

2-2) 관능평가

본 발명에 따른 효소제의 농도 및 처리시간에 따라 관능적 쓴맛 및 콩 비린 맛은 하기 표 8 및 표 9와 같다.

쓴맛

농도	1h	2h	3h	4h
0	6	6	6	6
0.1	11	10	23	20
0.2	11	15	25	30
0.3	15	17	27	30
0.5	20	25	30	30
0.7	25	27	30	30

콩 비린 맛

농도	1h	2h	3h	4h
0	30	30	30	30
0.1	28	26	12	6
0.2	26	20	10	6
0.3	26	17	10	6
0.5	25	14	10	6
0.7	20	10	9	6

효소제를 농도별, 시간별로 처리한 시료를 관능평가를 진행해 본 결과 효소제의 농도가 증가할수록, 시간이 증가할수록 쓴맛이 증가하는 경향을 보였다.

효소제의 농도가 증가할수록, 효소제 특유의 맛이 올라와 낮은 농도에서 적절한 시간대를 선택해야 할 것으로 판단하고 평가해본 결과 Neutrase 효소농도 0.3%, 2시간 샘플이 관능적으로 가장 우수하여 최적처리 조건을 설정하였다(도 4).

3) 발효

최근에는 대두단백을 물성을 개선하거나 효소처리에 의해 단백질에서 생성되는 펩타이드의 기능성에 대한 연구가 진행되고 있으며(Kim et al., 2008), 고초균의 경우 고체 발효(solid-state fermentation) 시 침지 공정을 생략할 수 있어 간편하게 기능성 발효물 생산을 생산할 수 있는 적합한 소재로서 보고되었다(Lee et al., 2008). 상기 실험결과로 나온 발효 ISP를 소화성 증대를 위하여 Bacillus spp. 균주(KCTC3014)를 사용하여 발효를 시행하였다. 발효 숙성 과정 중에 상기 미생물 균주에 의해 다양한 효소 및 생리활성물질이 만들어지며, 고초균은 암모니아, 인돌 및 아민 등의 발암 유도물질의 생성을 감소시키고 이러한 유해물질들을 흡착하여 변과 함께 배설시킨다고 알려져 있다.

3-1) 효소역가 측정

한편 발효시간별 효소활성도의 측정결과는 하기 표 10과 같다.

발효 시간별 효소활성도 측정

시간	24시간	36시간	48시간	60시간
a-amylase	254	480	528	491
Protease	200	331	432	378

시간 별(24, 36, 48, 60) 효소활성도를 측정하였을 때 42℃에서 48시간 발효했을 경우 아밀라아제,프로테아제 활성이 가장 높았지만 24시간 이후부터 발효취가 많이나 발효시간은 24시간으로 설정하였다.

4) 건조 및 분쇄

발효한 분리 대두단백 발효추출물을 건조후 분쇄하여(60 mesh) 분리 대두단백발효분말을 제조하고 최종 발효 ISP의 품질을 조사하였다.

5) 최종 생산된 발효 ISP/ 일반 ISP 품질비교

본 발명에 따른 발효시킨 분리 대두단백 발효추출물 분말의 일반 ISP와 품질 비교 결과는 하기 표 11과 같다. 류신이 없고 메티오닌과 프롤린이 생합성된 것이 특징이다.

유리아미노산

구분		ISP (mg/g)	효소 ISP (mg/g)	발효 ISP (mg/g)
Non polar	Alanine	0.011	ND	0.150
	Glycine	0.009	0.020	0.023
	Isoleucine	0.003	0.641	1.148
	Leucine	0.021	ND	ND
	Methionine	ND	0.048	0.084
	Proline	ND	0.020	0.015
	Valine	0.009	0.033	0.051
Polar	Serine	0.003	0.052	0.094
	Threonine	0.003	0.049	0.078
	Cystein	0.026	0.116	0.172
Basic	Lysine	0.002	ND	ND
	Arginine	ND	ND	ND
	Histidine	ND	0.005	ND
Acid	Aspartic acid	0.006	0.218	0.374
Acid	Glutamic acid	0.005	0.080	ND
Aromatic	Phenylalanine	0.019	ND	ND
	Tyrosine	0.006	0.012	0.014
	Citrulline	0.012	ND	ND
	Cystathionine	ND	0.216	0.414
	Ethanol amine	0.013	ND	ND
	α-amino-n-butyric acid	ND	0.147	0.268
	β-alanine	0.024	0.263	0.480
	β-amino isobutyric acid	0.012	1.195	2.195
	γ-amino-n-butyric acid	0.002	0.065	ND
Total amino acid contents (mg/g)		0.186	3.180	5.560
Total EAAs (mg/g)		0.057	0.776	1.361
Total BCAAs (mg/g)		0.033	0.674	1.199

또, 효소분해 후 발효과정을 통하여 방향성(Aromatic)물질 Cystathionine, α-amino-n-butyric acid가 생성됨과 동시에 Phenylalanine, Citrulline, γ-amino-n-butyric acid가 제거되고 Tyrosine, β-alanine 및 β-amino isobutyric acid는 각각 2~20배 이상 증가되었다(표 11).

5-2) 효소활성도 측정

본 발명에 따른 발효 ISP와 일반 ISP제품의 효소활성도를 측정한 결과는 하기 표 12와 같다.

효소활성도 측정

시간	ISP	발효 ISP
a-amylase	0	254
Protease	0	200

5-3) 생체이용률

In vitro 소화실험이란 시험관 조건에서 인체의 소화 환경과 유사한 환경을 만든 후 식품소재를 소화시켜 소화/흡수, 구조변화 또는 bioavailability 등을 측정하는 것을 말하며, In vitro 소화실험에 있어 가장 중요한 요소는 인체의 소화 조건과 최대한 동일한 환경을 구현하는 것으로써 소화효소의 조성과 함량, 전해질의 조성과 함량 및 pH 변화, 소화시간 및 온도 등 매우 다양한 요소를 고려해야만 한다. 허선진 등(2012) 논문을 참고하여 Multi-step 방법으로 실험을 설계하였으며, In vitro 소화액은 무기물과 유기물 용액 및 효소로 구성하였으며, in vitro 소화방법은 multi-step 방법을 이용하여 구강에서 소장까지 소화단계를 시뮬레이션하였고, 최종적으로 흡수되는 발효 ISP의 bioavailability를 측정하였다.

또, 선행연구(Abdel-Aal, 2008) 조건과 동일하게 평균 성인 한사람이 1일 단백질 섭취량을 75g으로 보았을 때 분비되는 pepsinogen/pepsin의 함량은 10mg 정도 수준이므로 pepsin과 단백질은 1:7500정도의 비율로 설정하였다.

투과막 내부 측정

구분	고형분함량 (%)	아미노산성 질소 (mg%)
ISP	1.2	19
발효 ISP	2.1	30

ISP와 발효 ISP를 In vitro 소화실험을 통해 생체막 내부 시료를 분석해본 결과 고형분 함량 및 아미노산성 질소의 함량이 50% 이상 증가 되는 것을 확인였다.

또, 본 발명에 따른 Neutrase효소 및 Bacillus subtilis N₂ 균주를 이용하여 발효한 결과 단백질 저분자화가 일반 ISP에 비하여 약 50% 수준 증가하여 진행된 것을 확인하였다(표 13).

6) 가용성 단백질 함량 Lowry method

ISP와 발효 ISP를 In vitro 소화실험을 통해 분리된 시료를 Lowry 방법으로 가용성 단백질 함량을 측정해본 결과 분자량이 14,000 이상인 펩타이드의 경우 ISP가 44 mg/mL로 발효 ISP보다 많았으며, 분자량 14,000인 펩타이드 경우 발효 ISP가 20 mg/mL로 ISP보다 3배 이상 증가 된 것을 확인하였다(도 5).

6-1) 침전 안정성

ISP, 발효 ISP를 증류수와 혼합하여 10%(w/v)용액으로 조제 후 상온에서 일정 시간 간격으로 침전 여부를 조사하여 침전에 대한 안정성을 비교해 본 결과 아래 그림과 같이 ISP는 1시간 이후부터 침전 현상이 발생하였으며, 발효 ISP의 경우 3일 경과 후에도 침전 안정성이 유지되는 것을 확인하였다(도 6).

Claims

대두분말용액에 프로테이스를 첨가하여 효소적 가수분해를 수행하여 가수분해된 ISP를 수득한 다음 상기 ISP에 미생물 균주를 접종하여 발효처리하여 발효 ISP를 수득하는 제조방법에 있어서; 상기 프로테이스가 Neutrase이고, 미생물 균주가 Bacillus subtilis N₂(KCTC3014)인 것이 특징인 발효 분리 대두단백의 제조방법
제1항에 있어서, 상기 Neutrase의 효소농도는 0.3%이고 2시간 반응시키는 것이 특징인 제조방법
제1항에 있어서, 상기 미생물 균주 Bacillus subtilis N₂(KCTC3014)는 42℃에서 24시간 발효시키는 것이 특징인 제조방법
제1항의 방법에 따라 제조된 쓴맛과 비린 맛이 개선되고 소화율이 증진된 발효 분리 대두단백
제4항의 발효 분리 대두단백은 류신, 페닐아라닌 및 에탄올 아민 함유되어있지 않고 메티오닌과 프롤린이 생합성되고 티로신, 베타-알라닌 및 베타아미노이소뷰틸릭산이 증가된 것이 특징인 발효 분리 대두단백
제4항의 발효 분리 대두단백은 3일 이상 경과 후에도 침전 안정성이 유지되는 분자량 14KD이하의 저분자 펩타이드가 증진되어 소화율이 증진된 것이 특징인 발효 분리 대두단백