JP5437378B2 - ヒャッポダ由来のヘモコアグラーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、ヒャッポダの蛇毒から単離されたトロンビン様酵素である蛇毒ヘモコアグラーゼを提供することを目的とする。
また、本発明は、前記ヘモコアグラーゼを単離及び精製する方法を提供することを目的とする。
(1)前記酵素は、252個のアミノ酸を含み、分子量が29.3kDa〜29.5kDaであり、等電点pIが5.5である。
(2)前記酵素は、αサブユニットとβサブユニットとからなり、これらサブユニットの鎖間は7つのジスルフィドで結合されている。
(3)前記αサブユニットが129個のアミノ酸を含み、分子量が15kDであり、そのアミノ酸配列は配列番号1に示す通りであり、前記βサブユニットが123個のアミノ酸を含み、分子量が14.5kDであり、そのアミノ酸配列は配列番号2に示すとおりである。
(4)酵素活性をフッ化フェニルメタンスルホニル(PMSF)によって完全に抑制することができ、これは、前記酵素がセリンプロテアーゼであることを示している。
(5)前記酵素は、ヒトフィブリノーゲンのα鎖を加水分解することができる。
蛇毒を前処理する工程(1)と、
前処理した蛇毒溶液を前平衡されたDEAE−セファロース高流速(DEAE−Sephrose FAST FLOW)アニオン交換クロマトグラフィーカラムに注入し、0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで溶出し、次いで0M〜1MのNaClを含有する0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで段階的に溶出し、0.06MのNaCl溶液の溶出液を収集する工程(2)と、
前記収集した溶出液を、適当に濃縮した後に透析して前記NaClを除くか又は数回希釈してから限外濾過処理して前記NaClを除く工程(3)と、
透析後の溶液を再度、前平衡されたDEAE−セファロース高流速クロマトグラフィーカラムに注入して、0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで溶出し、次いで0M〜1MのNaClを含む0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで段階的に溶出し、0.06MのNaCl溶液の第2溶出ピーク際の溶出液を収集する工程(4)と、
前記溶出液を適当に濃縮した後、蒸留水で透析し、又はセファデックス−G25(Sephadex−G25)カラムにより脱塩する工程(5)と、を含む。
数グラムの蛇毒を採取し、前記蛇毒の質量の5倍〜10倍の体積の予冷された0.01M、pH7.0〜7.5のPBSに4℃〜8℃温度のクロマトグラフィーの装置内で30分間〜60分間攪拌しながら前記蛇毒を溶解させ、4℃〜8℃で遠心力5,000g〜10,000gで10分間〜20分間遠心分離し、得られた上清液を透析袋に入れ、蛇毒質量の5倍〜10倍体積の予冷されたPBSを沈殿物に加え、攪拌した後、再度遠心分離する。低分子のポリペプチドの除去及び溶液のイオン強度を低減するため、このように2回の遠心分離により得られた上清液を透析袋(分画分子量7,000D〜10,000D)に集め、4℃〜8℃のクロマトグラフィー装置において0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで12時間〜24時間透析し、その間、2回〜4回のPBS換液を行う。
特に指定しない限り、実施例における技術手段は、すべて当業者が公知的な技術手段である。
ヒャッポダ由来の蛇毒粉末(ロット番号:20061001、中国広西蛇毒研究所製)30gを、蛇毒質量の10倍体積の予冷された0.01M、pH7.4のPBSに4℃のクロマトグラフィーの装置中で30分間攪拌しながら溶解させ、4℃で遠心力10,000gで10分間遠心分離を行い、得られた上清液を透析袋に移し、遠心分離沈澱物に蛇毒重量の10倍体積の予冷されたPBSを加え、再度攪拌した後、再び遠心分離した。2回の遠心分離によって得られた上清液を透析袋(分画分子量7,000D)に集め、4℃のクロマトグラフィーの装置中で0.01M、pH7.4のPBSを利用して24時間透析し、その間、PBS換液を3回行った。前処理された蛇毒溶液を、0.01M、pH7.4のPBSで前平衡されたDEAE−セファロース高流速アニオン交換クロマトグラフィーカラムに注入し、0.01MのpH7.4のPBSで溶出し、次いでそれぞれ0.02M、0.06M及び1.0MのNaClを含む0.01M、pH7.4のPBSで段階的に溶出し、0.06MのNaCl溶液の溶出ピーク際の溶出液を収集した。
ヒャッポダ蛇毒粉末(ロット番号:20061001、中国広西蛇毒研究所製)30gを300mLの予冷された0.01M、pH7.4のPBSに、4℃のクロマトグラフィーの装置で60分間攪拌しながら溶解させた。得られた溶液を4℃で遠心力1,000gで15分間遠心分離を行って、得られた上清液を透析袋に移し、遠心分離沈澱物に300mLの予冷されたPBSを添加し、再度攪拌し懸濁させた後、再び遠心分離した。2回の遠心分離によって得られた上清液を透析袋(分画分子量10,000D)に集め、4℃のクロマトグラフィーの装置で0.01MのpH7.4のPBSを利用して24時間透析し、その間、PBS換液を3回行った。
工程(1)において、ヒャッポダ蛇毒の乾燥粉末(ロット番号:20061001、中国広西蛇毒研究所製)100gを4℃〜8℃のクロマトグラフィーの装置に入れ、2,000mLの予冷された0.01M、pH7.4のPBSに60分間攪拌しながら溶解させた。その蛇毒溶液を4℃で遠心力10,000gで20分間遠心分離を行い、得られた上清液を3,000mLのビーカーに移した。そして、ミリポアペリコン2接線流れ限外濾過器(0.1M2の分画分子量8kDaの膜)で上清液を限外濾過し、500mLに濃縮し、さらに、予冷された0.01M、pH7.4のPBS溶液1,500mLを上記の濃縮液に添加し、そして、再度500mLまで限外濾過した。このように限外濾過濃縮を3回に繰り返した。
実施例2で単離されたヘモコアグラーゼをHPLCで更に精製して、HPLC3次元検査により求めた蛋白質純度が100%であり、また、酵素活性が10u/mLであるヘモコアグラーゼ溶液を得た。
生理食塩水で1%の牛フィブリノーゲン(シグマ社製)を調製した。
溶液濃度が4mg/mLになるようにイソプロパノールでフッ化フェニルメタンススルフォニル(PMSF、メルク社製)を溶解した。
工程(1)において、1%の牛フィブリノーゲン溶液2mLを37℃恒温で5分間放置した。
結果を表1に示す。
100ppm濃度のPMSFがヘモコアグラーゼの活性を完全に抑制することにより、上記ヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼがセリンプロテアーゼであることがわかる。微量のイソプロパノールは上記凝集反応に影響を与えない。
50mMのTris−HCl(pH7.4)緩衝液を用いて、4mg/mLのヒトフィブリノーゲン溶液を調製し、そして、5つの試験管にそれぞれヒトフィブリノーゲン溶液0.5mLを添加した。そのうち、4つの上記試験管に1活性単位の精製ヘモコアグラーゼを加え、37℃の水浴にそれぞれ4時間、2時間、1時間、及び0.5時間という異なる保温時間で維持した。保温完了した直後にSDS−PAGE電気泳動を行い、ヒトフィブリノーゲンの加水分解度を観測した。一方、残った1つの0.5mLのヒトフィブリノーゲン溶液を含む試験管を対照サンプルとし、37℃の水浴中で4時間保温した。
ヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼ単位の定義及び活性測定方法
生理食塩水で調製した1.0%の牛フィブリノーゲン(シグマ社製)1mLを試験管に加え、37±0.5℃の水浴で3分間保温し、そして、さらに37±0.5℃の予熱された酵素溶液1mLを添加した直後に計時を始める。試験管を120±30秒間振盪し、牛フィブリノーゲン溶液に白色フロックが発生すると、上記酵素溶液の活性単位が1u/mLであることを確認できる。
標準ヒト血漿1mLを試験管に加え、37±0.5℃の水浴で3分間予熱し、そして、さらに37±0.5℃の予熱された酵素溶液1mLを前記試験管に添加した直後に計時を始める。試験管を60±20秒間振盪し、ヒト血漿に白色フロックが発生すると、この酵素溶液の活性単位が1u/mLであることを確認できる。
Claims (10)
- ヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼであって、
αサブユニットとβサブユニットとにより形成され、前記αサブユニットと前記βサブユニットとが7つのジスルフィドで結合され、
前記αサブユニットは、129個のアミノ酸を含有し、配列番号1に示すアミノ酸配列を有し、
前記βサブユニットが123個のアミノ酸を含有し、配列番号2に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼ。 - セリンプロテアーゼであり、ヒトフィブリノーゲンのα鎖を加水分解可能であることを特徴とする請求項1に記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼ。
- 請求項1又は2に記載のヘモコアグラーゼを含むことを特徴とする薬物。
- 凍結乾燥散剤、止血パッチ、又は液状噴霧剤の剤型である請求項3に記載の薬物。
- 請求項1又は2に記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼを精製する方法であって、
蛇毒を前処理する工程(1)と、
前処理した蛇毒溶液を前平衡されたDEAE−セファロース高流速アニオン交換クロマトグラフィーカラムに注入し、0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで溶出し、次いで0M〜1MのNaClを含む0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで段階的に溶出し、0.06MのNaCl溶液の溶出ピーク際の溶出液を収集する工程(2)と、
前記収集されたNaCl溶出液を、適当に濃縮するか又は数回希釈してから限外濾過濃縮した後に透析し、NaClを除く工程(3)と、
透析後の溶液を前平衡されたDEAE−セファロース高流速クロマトグラフィカラムに注入し、0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで溶出し、次いで0M〜1MのNaClを含有する0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで段階的に溶出し、0.06MのNaCl溶液の溶出ピーク際の溶出液を収集する工程(4)と、
前記収集された溶出液を適当に濃縮した後、蒸留水で透析し、又はセファデックス−G25カラムを利用してNaClを除く工程(5)と、
を備えることを特徴とするヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。 - 工程(1)における蛇毒の前処理が、蛇毒を予冷された0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで溶解し、遠心分離した後、得られた上清液を透析するか、又は数回希釈して限外濾過濃縮する方法である請求項5に記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。
- 工程(1)における蛇毒の前処理が、
数グラムの蛇毒を採取する工程と、
蛇毒の質量の5倍〜10倍相当の容積の予冷された0.01M、pH7.0〜7.5のPBSに前記蛇毒をクロマトグラフィー箱中で4℃〜8℃で30分間〜60分間攪拌しながら溶解させる工程と、
その後、4℃〜8℃で遠心力5,000g〜10,000gで10分間〜20分間遠心分離する工程と、
得られた上清液を透析袋に入れる工程と、
遠心分離による沈澱物に再び蛇毒質量の5倍〜10倍の容積の予冷された前記PBSを加えて攪拌した後、再度遠心分離する工程と、
2回の遠心分離により得られた上清液を透析袋に集め、4℃〜8℃のクロマトグラフィー箱中で、0.01M、pH7.0〜7.5のPBSを利用して12時間〜24時間透析し、その間、PBS換液を2回〜4回行う工程;又は、蛇毒を蛇毒質量の10倍〜20倍の体積の予冷された0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで溶解し、PBSを繰り返し加えることにより希釈と分画分子量5,000D〜10,000Dの限外濾過膜での限外濾過とを繰り返す工程と、
によって、工程(1)での蛇毒の前処理を行う請求項6に記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。 - 工程(2)及び工程(4)において、DEAEセファロース高流速クロマトグラフカラムを0.01M、pH7.0〜7.5のPBSで前平衡したものを使用し、試料を注入する請求項5から7のいずれかに記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。
- 工程(5)で得られた脱塩後の溶液を直接凍結乾燥するか、又は坑凍結剤を添加して凍結乾燥する工程を更に含む請求項5から8のいずれかに記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。
- 分画分子量5,000D〜10,000Dの限外濾過膜で限外濾過濃縮して目的蛋白質溶出液の体積を減量してから、透析して脱塩するか;又は、分画分子量5,000D〜10,000Dの限外濾過膜で、溶出液を繰り返して希釈し、そして限外濾過して脱塩と目的蛋白質の濃縮とを行う請求項5から9のいずれかに記載のヒャッポダ蛇毒由来のヘモコアグラーゼの精製方法。
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