CN108165567A - 人溶菌酶基因的合成及其表达产物的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人溶菌酶基因的合成及其表达产物的构建方法。所述人溶菌酶基因根据hLZ原基因序列和hLZ氨基酸序列，在不改变其氨基酸序列的前提下，将毕赤酵母稀有密码子优化成毕赤酵母常用密码子。通过优化人溶菌酶基因片段的密码子，使其在真核表达时能够得到产量高、纯度高的人溶菌酶重组蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域。
背景技术
人溶菌酶(human lysozyme，hLZ)属于溶菌酶家族的c型，由130个氨基酸组成的碱性多肽，分子量为14.7KDa，等电点为11。人溶菌酶基因位于12号染色体长臂上(12q15)，序列全长6807bp(GenBank序列号：X14008)，含有4个外显子和3个内含子。人溶菌酶是人体的一种非特异性免疫物质，广泛存在于人体体液中，如乳汁、泪液、唾液、鼻黏液、尿液、脑脊液、子宫颈黏液以及羊水等，同时也存在于呼吸道和肠道组织中。
人溶菌酶具有杀菌消炎作用，它水解细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine，NAG)与N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(N-acetylmuramic acid，NAM)之间的β-1，4糖苷键，从而破坏细菌的细胞壁。溶菌酶还具有调节炎症反应的能力，它结合脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)和脂磷壁酸(Lipteihcoicacid，LTA)，防止其与肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells，IEC)和肠巨噬细胞上的受体相互作用；溶菌酶还对LPS具有螯合作用，抑制引发促炎症反应；溶菌酶对中性粒细胞也具有显著的免疫调节作用，减少对几种促炎症因子的产生，降低中性粒细胞中的氧化代谢但不抑制吞噬作用。因此，人溶菌酶可广泛应用于食品保鲜、婴幼儿奶粉、抗菌消炎药和抗生素替代等方面。
目前，人溶菌酶主要来源于人乳汁或人胎盘等，因原料来源受限及分离纯化成本较高，从而限制了其应用。国内虽有利用基因工程菌生产hLY的报道，但酶产量和活性均较低，质量不稳定。
发明内容
本发明旨在分析人溶菌酶基因序列，在不改变其氨基酸序列的前提下，将其中的密码子由毕赤酵母稀有密码子优化成毕赤酵母常用密码子，进而表达出产量高、纯度高的人溶菌酶。
本发明所采取的技术方案是：
一种人溶菌酶基因针对毕赤酵母优化表达的序列，其根据hLZ原基因序列：
AAGGTTTTCGAAAGGTGCGAATTGGCTAGAACTTTGAAGAGATTGGGAATGGACGGTTACAGAGGCATTTCTTTGGCAAATTGGATGTGCTTGGCTAAGTGGGAATCAGGTTACAACACTAGAGCTACTAATTATAACGCCGGCGATAGATCTACCGATTACGGCATTTTCCAGATCAACTCCAGATATTGGTGCAACGACGGTAAAACACCAGGAGCAGTTAACGCTTGTCATTTGTCTTGTTCCGCCTTGTTGCAAGATAATATTGCCGATGCAGTTGCTTGCGCTAAAAGAGTTGTTAGAGATCCACAAGGAATTAGAGCTTGGGTTGCTTGGAGAAATAGGTGCCAAAATAGAGACGTTAGACAATACGTTCAAGGTTGCGGAGTT(SEQ ID No.2)，
和hLZ氨基酸序列：
KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGVHHHHHH(SEQ ID No.3)，
在不改变其氨基酸序列的前提下，将毕赤酵母稀有密码子优化成毕赤酵母常用密码子：AAGGTTTTCGAAAGGTGCGAATTGGCTAGAACTTTGAAGAGATTGGGAATGGACGGTTACAGAGGCATTTCTTTGGCAAATTGGATGTGCTTGGCTAAGTGGGAATCAGGTTACAACACTAGAGCTACTAATTATAACGCCGGCGATAGATCTACCGATTACGGCATTTTCCAGATCAACTCCAGATATTGGTGCAACGACGGTAAAACACCAGGAGCAGTTAACGCTTGTCATTTGTCTTGTTCCGCCTTGTTGCAAGATAATATTGCCGATGCAGTTGCTTGCGCTAAAAGAGTTGTTAGAGATCCACAAGGAATTAGAGCTTGGGTTGCTTGGAGAAATAGGTGCCAAAATAGAGACGTTAGACAATACGTTCAAGGTTGCGGAGTT(SEQ ID No.1)。
构建表达人溶菌酶重组菌的方法，包括以下步骤：
1)按SEQ ID No.1所示序列合成人溶菌酶基因片段，其两端分别加入酶切位点XhoI和Not I；
2)步骤1的基因片段通过双酶切插入质粒pPICZαA中，构建表达载体pPICZαA-hLZ；
3)将表达载体pPICZαA-hLZ通过电转化至毕赤酵母X-33。
其中，步骤2和3之间还包括步骤：2’)利用大肠杆菌Top10进行表达载体pPICZαA-hLZ的单克隆扩增。
利用上述构建方法获得的表达人溶菌酶重组菌进行人溶菌酶的制备：以甲醇诱导表达，通过亲和层析树脂纯化获得人溶菌酶；具体表达步骤和纯化步骤包括：扩大培养含人溶菌酶重组菌4L，收集培养基进行下游纯化，取诱导96h后的培养液离心，上清液用0.22um膜过滤，在4℃环境下透析16h，缓冲液50mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0，透析结束后用Ni-IDA树脂纯化。
本发明的有益效果是：通过优化人溶菌酶基因片段的密码子，使其在真核表达时能够得到产量高、纯度高的人溶菌酶重组蛋白。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：hLZ蛋白质的制备
1)其根据hLZ原基因序列和hLZ氨基酸序列，在不改变其氨基酸序列的前提下，将毕赤酵母稀有密码子优化成毕赤酵母常用密码子，并合成人溶菌酶基因片段，其两端分别加入酶切位点Xho I和Not I；
2)步骤1的基因片段通过双酶切插入质粒pPICZαA中，构建表达载体pPICZαA-hLZ；
3)利用大肠杆菌Top10进行表达载体pPICZαA-hLZ的单克隆扩增；
4)将表达载体pPICZαA-hLZ通过电转化至毕赤酵母X-33
5)扩大培养含人溶菌酶重组菌4L，收集培养基进行下游纯化，取诱导96h后的培养液离心，上清液用0.22um膜过滤，在4℃环境下透析16h，缓冲液50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0，透析结束后用Ni-IDA树脂纯化。
实施例2：hLZ的蛋白质印迹法检测
采集经纯化后的重组人溶菌酶(prhLZ)溶液，用15％的SDS-PAGE凝胶电泳，50V，1h；90V，2h进行电泳。电泳完毕后利用Bio-Rad转膜仪350mA，转膜30min。完成转膜后，用5％脱脂奶粉封闭过夜，然后用抗His单抗(1:1000稀释)进行孵育1h，TBST洗膜3×10min，然后HRP标记的羊抗兔二抗(1:10000稀释)孵育1h，TBST洗膜3×10min，最后进行BCL显色。重组人溶菌酶的分子量约14.7KDa。
实施例3：hLZ蛋白质浓度测定
利用PierceTM BCA Protein Assay Kit提供的方法进行测定，具体过程为：考马斯亮蓝G-250与蛋白质的碱性和芳香族氨基酸特别是精氨酸(Arginine)在酸性介质中结合后，溶液转变为蓝色，溶液最大吸收峰从465nm迁移到595nm，颜色的变化与蛋白质浓度成正比，再通过检测595nm处的吸光度对溶液中蛋白质浓度进行测定。
以BSA为标准品，测定实施例1所得hLZ的蛋白浓度，测得浓度为0.121mg/ml。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 人溶菌酶基因的合成及其表达产物的构建方法
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaggttttcg aaaggtgcga attggctaga actttgaaga gattgggaat ggacggttac 60
agaggcattt ctttggcaaa ttggatgtgc ttggctaagt gggaatcagg ttacaacact 120
agagctacta attataacgc cggcgataga tctaccgatt acggcatttt ccagatcaac 180
tccagatatt ggtgcaacga cggtaaaaca ccaggagcag ttaacgcttg tcatttgtct 240
tgttccgcct tgttgcaaga taatattgcc gatgcagttg cttgcgctaa aagagttgtt 300
agagatccac aaggaattag agcttgggtt gcttggagaa ataggtgcca aaatagagac 360
gttagacaat acgttcaagg ttgcggagtt 390
<210> 2
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaggttttcg aaaggtgcga attggctaga actttgaaga gattgggaat ggacggttac 60
agaggcattt ctttggcaaa ttggatgtgc ttggctaagt gggaatcagg ttacaacact 120
agagctacta attataacgc cggcgataga tctaccgatt acggcatttt ccagatcaac 180
tccagatatt ggtgcaacga cggtaaaaca ccaggagcag ttaacgcttg tcatttgtct 240
tgttccgcct tgttgcaaga taatattgcc gatgcagttg cttgcgctaa aagagttgtt 300
agagatccac aaggaattag agcttgggtt gcttggagaa ataggtgcca aaatagagac 360
gttagacaat acgttcaagg ttgcggagtt 390
<210> 3
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly
1 5 10 15
Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala
20 25 30
Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly
35 40 45
Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp
50 55 60
Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala
85 90 95
Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp
100 105 110
Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys
115 120 125
Gly Val His His His His His His
130 135
Claims (4)
1.一种人溶菌酶基因针对毕赤酵母优化表达的序列，如SEQ ID No.1所示。
2.构建表达人溶菌酶重组菌的方法，包括以下步骤：
1)按权利要求1所述序列合成人溶菌酶基因片段，其两端分别加入酶切位点Xho I和Not I；
2)步骤1的基因片段通过双酶切插入质粒pPICZαA中，构建表达载体pPICZαA-hLZ；
3)将表达载体pPICZαA-hLZ通过电转化至毕赤酵母X-33。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2和3之间还包括步骤：2’)利用大肠杆菌Top10进行表达载体pPICZαA-hLZ的单克隆扩增。
4.一种制备人溶菌酶的方法，其特征在于，使用根据权利要求2或3所述的构建方法获得的表达人溶菌酶重组菌，以甲醇诱导表达，通过亲和层析树脂纯化获得人溶菌酶；所述表达步骤和纯化步骤包括：扩大培养含人溶菌酶重组菌4L，收集培养基进行下游纯化，取诱导96h后的培养液离心，上清液用0.22um膜过滤，在4℃环境下透析16h，缓冲液50mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0，透析结束后用Ni-IDA树脂纯化。
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