CN116987179B - 一种胶原蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶原蛋白及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域。一种胶原蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的胶原蛋白，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。本发明基于人胶原蛋白序列优化，异源表达后获得重组人源化胶原蛋白，本发明的胶原蛋白不易产生毒素，使用更加安全，且具有比商品化的天然人胶原蛋白更好的耐热性和一定的长效性，而且不影响促细胞增殖、细胞粘附活性、促细胞迁移活性的生物学活性，可在市场中推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种胶原蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
胶原蛋白是由三股多肽链相互咬合缠绕形成长且坚韧的三螺旋结构。胶原蛋白的类型因其三条α链的组合不同而各不相同，一级结构分析表明三螺旋域的最大特点是氨基酸呈现（Gly-X-Y）n周期性重复排列，其中X位置通常为脯氨酸（Pro），Ｙ通常为羟脯氨酸（Hyp）和羟赖氨酸（Hyl），而后两种氨基酸在其他蛋白质中很少见。市场上所售的胶原蛋白主要是利用化学方法和酶解法处理动物组织或器官获得的天然胶原蛋白，这种天然胶原蛋白在处理加工过程中，容易破坏蛋白的天然结构且易降解，最终生物学活性丧失。此外，不同种属来源胶原蛋白的蛋白氨基酸序列差异较大，人体使用时也容易产生免疫排斥和过敏症状。而目前的重组人源化胶原蛋白大部分使用大肠埃希菌和巴斯德毕赤酵母表达系统，其所提取的胶原蛋白耐热性差，难以在市场中推广。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种长效耐热胶原蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的天然胶原蛋白耐热性差的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出了一种长效耐热胶原蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的胶原蛋白，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
可选地，所述胶原蛋白的核苷酸序列是经酿酒酵母密码子优化Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列后得到的。
可选地，所述优化Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列的方式，包括：
由Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列进行串联重复3次后，用一段柔性连接肽连接在人白蛋白第三结构域N端后进行人工设计。
可选地，所述长效耐热胶原蛋白还包括对所述胶原蛋白进行修饰的脂质体。
可选地，所述胶原蛋白的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。
本发明还提出了一种长效耐热胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA；
将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA；
通过对所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA诱导表达，获得诱导产物；
将所述诱导产物纯化后，获得胶原蛋白；
对所述胶原蛋白进行脂质体包裹，获得长效耐热胶原蛋白。
可选地，所述依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA的步骤，包括：
将如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列经过人工合成，插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA。
可选地，所述将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA的步骤，包括：
将重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，再加入山梨醇溶液，混匀，进行电击转化，在SC-U选择培养基上涂平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；
经菌液PCR筛选阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA。
可选地，所述通过对所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA诱导表达，获得诱导产物的步骤，包括：
挑取所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA接种于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在4℃、1500g的条件下离心5min，收集菌体，并取1ml-2ml的所述菌体重新接种于SC-U诱导培养基中，置于30℃下震荡培养94h-98h，再于4℃、15000g的条件下离心5min，收集诱导表达菌体和上清蛋白液；
将所述上清蛋白液经0.22μm滤膜过滤，得到分子量为45kDa的诱导产物。
可选地，所述将所述诱导产物纯化后，获得胶原蛋白的步骤，包括：
将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得胶原蛋白。
可选地，所述对所述胶原蛋白进行脂质体包裹，获得长效耐热胶原蛋白的步骤，包括：
将卵磷脂、胆固醇和维生素E溶解于无水乙醇中，经剪切、均质、减压蒸发后，得到脂质体薄膜；
在所述脂质体薄膜中加入聚山梨酯80水溶液进行水化，再剪切、纯化、破膜后，得到脂质体；
将所述脂质体与所述胶原蛋白超声混合后，再经过过滤、干燥，得到长效耐热胶原蛋白。
本发明还提出了一种长效耐热胶原蛋白在护肤品中的应用，采用上述长效耐热胶原蛋白作为护肤品中的活性成分。
本发明有益效果为：
本发明基于人胶原蛋白序列优化，异源表达后获得重组人源化胶原蛋白，其中，氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，核苷酸序列如Seq ID NO.2所示，相比于利用化学方法和酶解法处理动物组织或器官获得的天然胶原蛋白，其可溶性、无病毒隐患和排异反应低，且与使用大肠埃希菌和巴斯德毕赤酵母表达系统表达的重组人源化胶原蛋白相比，本发明的胶原蛋白也不易产生毒素，使用更加安全，其具有比商品化的天然人胶原蛋白更好的耐热性，而且不影响促细胞增殖、细胞粘附活性、促细胞迁移活性的生物学活性，可在市场中推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明实施例所述的INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhELP工程菌诱导产物的示意图；
图2为本发明实施例所述的兔抗ColⅠ单抗western-blot鉴定INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhELP工程菌诱导产物的示意图；
图3为本发明实施例所述的兔抗Col Ⅲ单抗western-blot鉴定INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhELP工程菌诱导产物的示意图；
图4为本发明实施例所述的胶原蛋白层析纯化的SDS-PAGE结果示意图；
图5为本发明实验例所述的长效耐热胶原蛋白促角质化细胞迁移活性镜下观察结果的示意图；
图6为本发明实验例所述的使用长效耐热胶原蛋白精华液后不同时间点皮肤弹性R2值的示意图；
图7为本发明实验例所述的使用长效耐热胶原蛋白精华液后不同时间点皮肤皱纹面积均值的示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
序列表说明（序列表内容单独提供）：
Seq ID NO.1所示为本发明实施例中胶原蛋白的氨基酸序列；
Seq ID NO.2所示为本发明实施例中胶原蛋白的核苷酸序列；
Seq ID NO.3所示为本发明实施例中所选择的Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸序列；
Seq ID NO.4所示为本发明实施例中所选择的Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列；
Seq ID NO.5所示为本发明实施例中柔性连接肽的氨基酸序列；
Seq ID NO.6所示为本发明实施例中人白蛋白第三结构域N端的氨基酸序列；
Seq ID NO.7所示为本发明实施例中柔性连接肽的核苷酸序列；
Seq ID NO.8所示为本发明实施例中人白蛋白第三结构域N端的核苷酸序列；
Seq ID NO.9所示为本发明实施例中6×His标签核苷酸序列；
Seq ID NO.10所示为本发明实施例中6×His标签氨基酸序列。
市场上所售的胶原蛋白主要是利用化学方法和酶解法处理动物组织或器官获得的天然胶原蛋白，这种天然胶原蛋白在处理加工过程中，容易破坏蛋白的天然结构且易降解，最终生物学活性丧失。此外，不同种属来源胶原蛋白的蛋白氨基酸序列差异较大，人体使用时也容易产生免疫排斥和过敏症状。而目前的重组人源化胶原蛋白大部分使用大肠埃希菌和巴斯德毕赤酵母表达系统，但其所提取的重组人源化胶原蛋白的耐热性较差，难以在市场中推广。
针对上述现有的重组人源化胶原蛋白所存在的技术问题，本发明的实施例提供了一种长效耐热胶原蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的胶原蛋白，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
本发明基于人胶原蛋白序列优化，异源表达后获得重组人源化胶原蛋白，其中，氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，核苷酸序列如Seq ID NO.2所示，相比于利用化学方法和酶解法处理动物组织或器官获得的天然胶原蛋白，其可溶性、无病毒隐患和排异反应低，且与使用大肠埃希菌和巴斯德毕赤酵母表达系统表达的重组人源化胶原蛋白相比，本发明的胶原蛋白也不易产生毒素，使用更加安全，其具有比商品化的天然人胶原蛋白更好的耐热性，而且不影响促细胞增殖、细胞粘附活性、促细胞迁移活性的生物学活性，可在市场中推广使用。
作为本发明的一种可实施方式，所述胶原蛋白的核苷酸序列是经酿酒酵母密码子优化Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列后得到的。
本发明为提高所获取的胶原蛋白的使用安全性，运用酿酒酵母表达体系异源表达胶原蛋白，研究发现，重组人源化胶原蛋白常使用的大肠埃希菌表达系统和巴斯德毕赤酵母表达系统，在生产胶原蛋白时容易残留大量内毒素或是造成甲醇残留，去除时不仅会加大生产成本，使用时也容易对健康造成影响，而本发明采用的酿酒酵母表达体系主要以葡萄糖、半乳糖作为碳源和能源，较为安全，且不会产生毒素。
作为本发明的一种可实施方式，所述优化Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列的方式，包括：
由Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列进行串联重复3次后，用一段柔性连接肽连接在人白蛋白第三结构域N端后进行人工设计。
在具体应用中，Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸序列参考：Uniprot P02452序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02452），Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列参考：UniprotAGL34959.1序列 （https:// www .uniprot .org/uniprot/ AGL34959.1），均选择胶原区域E值较高的序列，其中，所选择的Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸序列为GPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGDRGIKGHRGFSGLQGPPGPP（简称为Col Ⅰ），如Seq ID NO.3所示，所选择的Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列为GPAGSRGAPGPQGPRGDKGETGERGAAGIK GHRGFPGNP（简称为Col Ⅲ），如Seq IDNO.4所示，将Col Ⅰ与Col Ⅲ进行串联重复3次后，用柔性连接肽（简称为Linker），连接在人白蛋白第三结构域N端（简称为3DHSA），即为（Col Ⅰ-Col Ⅲ）3-Linker-3DHSA，其氨基酸序列如Seq ID NO.1所示。
其中，柔性连接肽的氨基酸序列为（GGGGS）3，如Seq ID NO.5所示；
人白蛋白第三结构域N端的氨基酸序列如Seq ID NO.6所示。
即编码该胶原蛋白的核苷酸序列则是将编码Ⅰ型胶原蛋白的核苷酸序列与编码Ⅲ型胶原蛋白的核苷酸序列进行串联重复3次后，再通过编码柔性连接肽的核苷酸序列将编码人白蛋白第三结构域的核苷酸连接后进行人工设计得到的，编码该胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
其中，编码柔性连接肽的核苷酸序列如Seq ID NO.7所示；
编码人白蛋白第三结构域N端的核苷酸序列如Seq ID NO.8所示。
作为本发明的一种可实施方式，所述长效耐热胶原蛋白还包括对所述胶原蛋白进行修饰的脂质体。
本发明为提高胶原蛋白长效耐热的特征，在运用酿酒酵母表达体系异源表达获得胶原蛋白后，该胶原蛋白虽然具有较好的耐热性和一定的长效性，但长效性还有待提高，在该胶原蛋白的使用和产品推广中会受到一定的阻碍，故而本发明通过脂质体对胶原蛋白进行修饰改造，使胶原蛋白经过脂质体修饰后缓慢释放，从而较大程度地增大了胶原蛋白的长效性，提高胶原蛋白的长效使用。
作为本发明的一种可实施方式，所述胶原蛋白的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。
具体的，经酿酒酵母密码子优化后的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示，其中，Not I酶切位点的核苷酸序列为GCGGCCGC；
Xba I酶切位点的核苷酸序列为TCTAGA；
起始密码子的核苷酸序列为ATG；
终止密码子的核苷酸序列为TAA；
6×His标签核苷酸序列为：CATCACCATCACCATCAC，如Seq ID NO.9所示，所对应的6×His标签氨基酸序列为HHHHHH，如Seq ID NO.10所示。
本发明的实施例还提供了一种长效耐热胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S10、依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA。
在具体应用中，委托南京金斯瑞生物科技有限公司依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA。
S20、将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA。
在具体实施过程中，将10μl重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA加入80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中；冰浴5min，擦干电击杯外壁；将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击；迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U板；30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；在SC-U选择培养基（含氨苄）生长的为含有pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA的酿酒酵母转化子，经菌液PCR（正向引物：GAL1-F；反向引物：CYC1-RR）筛选阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA。
具体的，在这一步中，SC-U选择培养基的配置包括：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸， 20g琼脂粉，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20%葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用。
S30、通过对所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA诱导表达，获得诱导产物。
在具体实施过程中，挑取INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA单菌落接种于20ml SC-U选择培养基，经30°C、220rpm震荡培养过夜，测定其OD600nm吸光值，计算相应体积的菌液转接至于100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD600nm达到0.4；
在4℃、1500g的条件下离心5min，收集菌体，并取1ml-2ml的所述菌体重新接种100ml的SC-U诱导培养基中，置于30℃下震荡培养94h-98h，再于4℃、15000g的条件下离心5min，收集诱导表达菌体和上清蛋白液；
将所述上清蛋白液经0.22μm滤膜过滤。
具体的，在这一步中，SC-U诱导培养基的配置包括：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20%葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20%半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用。
在具体应用中，对诱导产物进行鉴定，将诱导表达得到的上清蛋白液经SDS-PAGE电泳可观察到45kDa左右有明显的特异性条带出现，如图1所示，其中，泳道M：Marker；泳道1：INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhELP工程菌诱导上清蛋白液，泳道2~8：空载质粒酿酒酵母菌株产物；
使用兔抗ColⅠ单抗（abcam公司，ab260043）和兔抗Col Ⅲ单抗（abcam公司，ab184993）经Western blot鉴定含有pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA质粒的酿酒酵母菌株的诱导上清蛋白液，均可观察到45Da左右特异性条带，如图2和图3所示，图2中，泳道M：Marker；泳道1：空载质粒酿酒酵母菌株产物；泳道2：INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhELP工程菌诱导上清蛋白液；图3中，泳道M：Marker；泳道1：空载质粒酿酒酵母菌株产物；泳道2~3：INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhELP工程菌诱导上清蛋白液。
由此可见，本发明制备的含胶原蛋白的真核表达载体pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA的酿酒酵母工程菌经半乳糖诱导能产生45kDa左右的胶原蛋白。
S40、将所述诱导产物纯化后，获得胶原蛋白。
在具体实施过程中，将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得胶原蛋白。
具体的，在这一步中，离心收集上述上清蛋白液，经0.22μm滤膜过滤用以上样；使用GE Healthcare公司Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料，用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用PBS平衡2-3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5ml/min；再用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD280nm稳定；再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到胶原蛋白。
通过SDS-PAGE检测，500mM咪唑可明显洗脱目的蛋白，检测结果如图4所示，其中，泳道M：Marker；泳道1：500mM咪唑洗脱产物；泳道2：空载质粒酿酒酵母菌株产物。
S50、对所述胶原蛋白进行脂质体包裹，获得长效耐热胶原蛋白。
在具体实施过程中，将卵磷脂、胆固醇和维生素E溶解于无水乙醇中，经剪切、均质、减压蒸发后，得到脂质体薄膜；
在所述脂质体薄膜中加入聚山梨酯80水溶液进行水化，再剪切、纯化、破膜后，得到脂质体；
将所述脂质体与所述胶原蛋白超声混合后，再经过过滤、干燥，得到长效耐热胶原蛋白。
经过脂质体包裹胶原蛋白，可较大程度地改善胶原蛋白的长效性。
本发明的实施例还提供了一种长效耐热胶原蛋白在护肤品中的应用，采用上述长效耐热胶原蛋白作为护肤品中的活性成分。该长效耐热胶原蛋白在任意护肤品中添加，可达到抗衰除皱、增加皮肤弹性的功效。
下面结合具体实施例对本发明上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
将如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列经过人工合成，插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA；
将重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，再加入山梨醇溶液，混匀，进行电击转化，在SC-U选择培养基上涂平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；
经菌液PCR筛选阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA；
挑取所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA接种于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在4℃、1500g的条件下离心5min，收集菌体，并取1ml-2ml的所述菌体重新接种于SC-U诱导培养基中，置于30℃下震荡培养94h-98h，再于4℃、15000g的条件下离心5min，收集诱导表达菌体和上清蛋白液；
将所述上清蛋白液经0.22μm滤膜过滤，得到分子量为45kDa的诱导产物；
将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得胶原蛋白。
实施例2
一种脂质体修饰的长效耐热胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
将卵磷脂、胆固醇和维生素溶解于60℃的无水乙醇中，得到混合物；
将混合物先在18000r/min的速度下剪切5min，再在15MPa条件下均质5min，再在80℃下水浴减压蒸发，得到脂质体薄膜；
向脂质体薄膜加入质量百分比浓度为0 .5％的聚山梨酯80水溶液，先在50℃下水化1h后，再在18000r/min的速度下剪切5min，再经过纯化和破膜后，即得脂质体；
将脂质体溶解于水中，得到质量百分比浓度为20mg/mL的脂质体水溶液，按1:1的重量比向脂质体水溶液中加入实施例1所述的胶原蛋白后，先在100w的条件下超声搅拌1min，再进行滤膜过滤和干燥处理，即得长效耐热胶原蛋白。
实验例1
对实施例1的胶原蛋白和实施例2的长效耐热胶原蛋白进行促细胞粘附活性测试。
分别将实施例1制备的胶原蛋白和实施例2制备的长效耐热胶原蛋白用20mM、pH7.4的PBS溶液预稀释至0.5μg/ml，预稀释完成后分别在96孔板中进行2倍梯度稀释，共做10个稀释度，设置每孔50μl的不同稀释度，每个样品平行测试三次，并设立阴性对照，加入20mM PBS最为对照，设置天然提取的大鼠尾胶原蛋白（购自Sigma公司，货号为C7661）作为阳性对照，4℃孵育过夜。孵育完成后弃去板中液体，每孔加入100μl、30g/L BSA封闭，置于37℃的温箱孵育1h；取出弃去板中液体，加入BALB/c 3T3小鼠胚成纤细胞悬液（用无血清DMEM培养基重悬），细胞接种密度为1.0×105个/ml，每孔接种100μl，37℃温箱孵育5h。将孵育完成的细胞板用20mM的PBS洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况，选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果四参数拟合曲线得出效价。结果如下表1所示。
表1 促BALB/c 3T3小鼠胚成纤细胞粘附活性
由表1可见，胶原蛋白、长效耐热胶原蛋白促BALB/c 3T3小鼠胚成纤细胞粘附活性与大鼠尾胶原蛋白比较并无差别，这说明胶原蛋白与人白蛋白第三结构域偶联并且经过脂质体修饰后不影响蛋白促粘附活性。
实验例2
对实施例1的胶原蛋白和实施例2的长效耐热胶原蛋白进行促角质化细胞迁移活性测试。
当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过比较图像以确定细胞迁移速率。
用黑色记号笔在6孔细胞培养板背后，用直尺对齐，均匀划横线，大约每隔0.5cm-1cm一道，横穿过孔；向上述6孔细胞板中加入浓度为5×105/ml的HaCaT角质化细胞悬液2ml，放置37℃ 5%二氧化碳培养箱培养24h，待细胞长满单层，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道横线，用PBS洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞，然后向6孔内加入1.8ml无血清DMEM培养基，最后向孔内添加待检样品，胶原蛋白、长效耐热胶原蛋白用20mMpH 7.4 的PBS溶液稀释至0.5μg/ml分别加入上述6孔内，同时设置天然提取的大鼠尾胶原蛋白（购自Sigma公司，货号为C7661）作为阳性对照和PBS空白对照。将上述6孔细胞板放置37℃ 5%二氧化碳培养箱培养24h，培养。0时拍照，记录每孔内拍照位置。加入待检样品处理的HaCaT角质化细胞培养24h后，对固定位置进行观察、拍照。使用Image J软件对细胞迁移的图片进行处理，获得初始划痕面积和无细胞空白区域面积数据，计算迁移率，迁移率＝无细胞空白区域面积/初始划痕面积×100％。
细胞对照孔与各个样品孔0h与18h观察结果如图5所示，并且计算各个处理组对HaCaT角质化细胞促迁移效果，计算结果如下表2所示。
表2 促HaCaT角质化细胞迁移率
实验例3
对实施例1的胶原蛋白和实施例2的长效耐热胶原蛋白进行热稳定性测试。
分别将实施例1制备的胶原蛋白和实施例2制备的长效耐热胶原蛋白用20mM pH7.4 的PBS溶液稀释至稀释至1mg/ml，分别分装至5ml西林瓶中，每瓶2ml，将其放置55℃恒温恒湿培养箱中进行加速破坏试验，分别放置第4h、8h、12h、24h、3d、5d、15d和30d取出样品，检测各个时间段促BALB/c 3T3小鼠胚成纤细胞粘附活性和HaCaT角质化细胞促迁移效果，检测方法同实验例1和实验例2。热稳定性试验促BALB/c 3T3小鼠胚成纤细胞粘附结果如下表3所示，热稳定性试验促HaCaT角质化细胞迁移结果如下表4所示。
表3 热稳定性试验促BALB/c 3T3小鼠胚成纤细胞粘附活性
表4 热稳定性试验促HaCaT角质化细胞迁移率
由表3可见，在55℃加速破坏试验中，胶原蛋白加热第12h，促细胞粘附活性几乎没有变化，而加热至第24h，活性仅仅降低了约为10%（相较于第0h），加热至第3d，活性约为3%，加热至第5d及更长时间促细胞贴壁活性消失；而长效耐热胶原蛋白加热至第30d，促细胞粘附活性仅仅降低了5%，活性几乎没有变化；阳性对照大鼠尾胶原蛋白活性加热4h，活性降低了约为93%，而第8h及更长时间，活性为0。
由表4可见，在55℃加速破坏试验中，胶原蛋白加热第12h，促HaCaT角质化细胞促迁移率降低仅降低了5%，加热至第3d，活性为0；而长效耐热胶原蛋白加热至第30d，促HaCaT角质化细胞促迁移率仅仅降低了7%；大鼠尾胶原蛋白加热至第8h，促HaCaT角质化细胞促迁移效果丧失。
由此可见，胶原蛋白与人白蛋白偶联表达形成的胶原蛋白，在55℃加热12h，生物学活性不影响，但继续加热至第3d活性几乎丧失，而耐热胶原蛋白经过脂质体修饰后，55℃加热30d生物学活性几乎不损失，具有长效性。而天然的大鼠尾胶原蛋白不耐热。
实验例4
测试实施例2制备的长效耐热胶原蛋白促成纤维细胞胶原蛋白生成效果。
胶原蛋白是真皮细胞外基质的主要成分之一，由成纤维细胞合成，分泌至胞外，在末端前胶原肽酶的作用下，聚合形成胶原纤维。胶原蛋白或长效耐热胶原蛋白可促进BALB/C 3T3小鼠胚成纤维细胞分泌胶原蛋白。
选择传代后24h-36h的3T3细胞用，弃去培养液，用0.25%胰酶消化和收集细胞，用RPMI1640培养基含10%新生牛血清（以下简称“完全培养液”）重悬细胞配成5.0×104~8.0×104/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。培养24h，弃去上清液，换成RPMI1640培养基含0.4%新生牛血清（以下简称“维持培养液”），置于37℃、5%二氧化碳条件下继续培养。培养第24h后，用维持培养液对长效耐热胶原蛋白样品进行稀释，稀释成浓度分别为10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml，将稀释后的样品加入至上述96孔中，每孔0.2ml，每个浓度设3个复孔；此外，同样的方法稀释胶原蛋白和大鼠尾胶原蛋白，其稀释浓度为10μg/ml加入至上述96孔中，每孔0.2ml，每个浓度设3个复孔。同时设立细胞对照组和维生素C阳性对照，继续7℃、5%二氧化碳条件下继续培养72h。然后，弃去培养上清液，用20mM、PBS洗涤细胞3次后，向孔中添加100μl的4%多聚甲醛室温固定20分钟，弃去固定液，每孔加入20mM、PBS再洗涤细胞3次。向每孔加入0.15mL 0.1%天狼猩红苦味酸染液，室温染色1h，吸出染液，每孔加入0.2mL 0.1%冰醋酸，洗3遍，每遍5min。最后向每孔加入100μl 0.1mol/L氢氧化钠室温充分振荡1h，放入酶标仪中检测540nm波长处吸光度A值，检测胶原蛋白变化情况。天狼猩红苦味酸染液可与胶原蛋白结合，两者结合物可被0.1mol/L氢氧化钠溶解，检测540nm波长处吸光度A值大小，反应了BALB/C 3T3小鼠胚成纤维细胞（以下简称“3T3细胞”）分泌胶原蛋白高低。结果如下表5所示。
表5
由表5可见，随着长效耐热胶原蛋白浓度降低，胞体被呈红色逐渐变弱，呈梯度变化关系；经过将长效耐热胶原蛋白用氢氧化钠溶解，并在波长540nm处检测吸光值后，发现长效耐热胶原蛋白浓度为10μg/ml、1μg/ml以及0.1μg/ml时促3T3成纤维细胞生成胶原蛋白均与细胞对照组差异显著。
实验例5
对实施例2制备的长效耐热胶原蛋白进行人体皮肤功效学评价。
将实施例2制备的长效耐热胶原蛋白制备成长效耐热胶原蛋白精华液，长效耐热胶原蛋白精华液由以下重量百分比的原料组成：长效耐热胶原蛋白0.5%、卡波姆0.30、羟乙基纤维素0.08%、EDTA二钠0.05%、透明质酸钠0.05%、甘油3.0%、甜菜碱2.00%、丁二醇5.00%、1,2-己二醇1.00%、余量为水。通过30名年龄30~55周岁的亚洲成年健康女性受试者在正常情况下在面部连续使用长效耐热胶原蛋白精华液样品28天，随机测试受试女性使用第14d和28d面部部位的皮肤弹性R2值和鱼尾纹的皮肤皱纹面积，统计30位受试女性的皮肤弹性R2值平均值和鱼尾纹的皮肤皱纹面积的平均值，经过统计学软件分析，比较在使用长效耐热胶原蛋白精华液第14d和28d与使用前的差异性。结果如图6和图7所示。其中，R2值提高表明皮肤弹性升高，“*”表示与使用前比较差异性显著，P<0.05。
由图6可见，受试女性在使用长效耐热胶原蛋白精华液后，使用14d时皮肤弹性R2值与使用前比较差异不显著，而使用第28d时皮肤弹性R2值显著提高，差异显著。由图7可见，使用第14d和28d时，鱼尾纹的皮肤皱纹面积与使用前比较明显降低，差异显著。可见本发明所制备的长效耐热胶原蛋白具有显著的抗皱除皱效果。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种胶原蛋白，其特征在于，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的胶原蛋白，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
2.一种如权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA；
将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA；
通过对所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA诱导表达，获得诱导产物；
将所述诱导产物纯化后，获得胶原蛋白；
对所述胶原蛋白进行脂质体包裹，获得脂质体包裹的胶原蛋白。
3.根据权利要求2所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA的步骤，包括：
将如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列经过人工合成，插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA。
4.根据权利要求2所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA的步骤，包括：
将重组质粒pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，再加入山梨醇溶液，混匀，进行电击转化，在SC-U选择培养基上涂平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；
经菌液PCR筛选阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA，获得重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA。
5.根据权利要求2所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述通过对所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA诱导表达，获得诱导产物的步骤，包括：
挑取所述重组工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-ColⅠ-ColⅢ-3DHSA接种于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在4℃、1500g的条件下离心5min，收集菌体，并取1ml-2ml的所述菌体重新接种于SC-U诱导培养基中，置于30℃下震荡培养94h-98h，再于4℃、15000g的条件下离心5min，收集诱导表达菌体和上清蛋白液；
将所述上清蛋白液经0.22μm滤膜过滤，得到分子量为45kDa的诱导产物。
6.根据权利要求2所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述诱导产物纯化后，获得胶原蛋白的步骤，包括：
将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得胶原蛋白。
7.根据权利要求2所述的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述对所述胶原蛋白进行脂质体包裹，获得脂质体包裹的胶原蛋白的步骤，包括：
将卵磷脂、胆固醇和维生素E溶解于无水乙醇中，经剪切、均质、减压蒸发后，得到脂质体薄膜；
在所述脂质体薄膜中加入聚山梨酯80水溶液进行水化，再剪切、纯化、破膜后，得到脂质体；
将所述脂质体与所述胶原蛋白超声混合后，再经过过滤、干燥，获得脂质体包裹的胶原蛋白。
8.一种胶原蛋白在制备抗衰护肤品中的应用，其特征在于，采用如权利要求1所述的胶原蛋白作为抗衰护肤品中的活性成分。
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- 2023-09-20 CN CN202311214821.0A patent/CN116987179B/zh active Active
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