CN116751282A - 一种重组ⅹⅶ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
一种重组ⅹⅶ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116751282A CN116751282A CN202310564523.8A CN202310564523A CN116751282A CN 116751282 A CN116751282 A CN 116751282A CN 202310564523 A CN202310564523 A CN 202310564523A CN 116751282 A CN116751282 A CN 116751282A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide sequence
- recombinant
- xvii
- collagen
- humanized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 111
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 111
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 111
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 24
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 102200015136 rs398122975 Human genes 0.000 claims abstract 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 89
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 86
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 86
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 8
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 3
- -1 blowing uniformly Substances 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000686 essence Substances 0.000 claims description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims description 3
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 claims description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 abstract description 10
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 abstract description 10
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 abstract description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 102100028256 Collagen alpha-1(XVII) chain Human genes 0.000 description 18
- 101000860679 Homo sapiens Collagen alpha-1(XVII) chain Proteins 0.000 description 18
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 9
- ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N Minoxidil Chemical group NC1=[N+]([O-])C(N)=CC(N2CCCCC2)=N1 ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 108010044493 collagen type XVII Proteins 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000002951 depilatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229960003632 minoxidil Drugs 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 229940098465 tincture Drugs 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 108010073180 Collagen Type XIII Proteins 0.000 description 1
- 102000009089 Collagen Type XIII Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000034196 cell chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000011382 collagen catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 210000000301 hemidesmosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
- C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及IPC C07K14,更具体地涉及,一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,包括C17A胶原蛋白或C17B胶原蛋白或C17C胶原蛋白。本发明首次利用酿酒酵母系统,并采用特定的优化序列片段,成功表达出分泌可溶性的人源化ⅩⅦ型胶原蛋白。该人源化ⅩⅦ型胶原蛋白相较于大肠杆菌表达的人源化ⅩⅦ型胶原蛋白,具有更高的细胞粘附活性、促细胞增殖活性、促细胞迁移活性以及优异的促进毛发生长的作用,且安全系数高,适合医疗器械或护肤品领域的广泛使用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及IPC C07K14,更具体地涉及,一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是一种生物高分子纤维蛋白,是细胞外基质中含量最多、分布最广的功能性蛋白质之一,约占总蛋白的1/3。在人体肌肤蛋白质的组成中,胶原蛋白起到重要作用,可形成组织或愈合伤口的结构支架,促进细胞黏附和趋化,有助于组织修复,为皮肤提供强度和支撑。目前已发现了至少49种不同的胶原蛋白多肽链,其中可人工合成的胶原蛋白类型有28种。根据在体内的分布,胶原蛋白又可分为间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原,其中间质胶原蛋白是整个机体胶原的主要部分。随着时间的流逝,真皮成纤维细胞数量逐渐减少,合成胶原能力降低,同时蛋白酶释放增加,皮肤中的胶原蛋白降解增加,使皮肤呈现衰老的表现。此外每单位面积皮肤的总胶原含量的减少速度约为每年1%。
人ⅩⅦ型(COL17A1基因编码)胶原蛋白是一种跨膜型非成纤维胶原蛋白,其为三条相同α1(ⅩⅦ)链构成的均相三聚体,分为胞内、跨膜、胞外三大类结构域。COL17A1蛋白是细胞中半桥粒的一种组成成分,在上皮细胞-基底膜的作用中发挥重要作用,可调控上皮细胞的黏附、分离和发育分化,对毛囊细胞的分化和再生有重要作用。
现有专利CN202111082088.2公开了一种重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1L1T及其制备方法和用途,该专利开发的重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1L1T具有促进细胞黏附的活性,在体内无免疫反应,制备方法简单,成本较低。但其修复损伤的效果还有待进一步提高。
发明内容
为了解决现有技术中的问题,本发明第一方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,包括C17A或C17B或C17C。
优选的,所述C17A包括(A)n多肽序列,由A多肽序列重复n次形成;C17B包括(B)n多肽序列,由B多肽序列重复n次形成;C17C包括(AB)n多肽序列,由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联重复n次形成;其中n为4~8的整数。
优选的,所述C17A包括(A)8多肽序列,由A多肽序列重复八次形成,包括456个氨基酸;
优选的,所述C17B包括(B)8多肽序列,由B多肽序列重复八次形成,包括360个氨基酸。
优选的,所述C17C包括(AB)4多肽序列,由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联重复四次形成,包括408个氨基酸。
优选的,所述A多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt:Q9UMD9:G567–623G。
优选的,所述A多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.1。
优选的,所述(A)8多肽序列为SEQ ID No.4,理论分子量为43kDa。
优选的,所述(A)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.7。
优选的,所述(A)8多肽序列的DNA序列根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化,委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
优选的,所述B多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt:Q9UMD9:G1438–1482V。
优选的,所述B多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.2。
优选的,所述(B)8多肽序列为SEQ ID No.5,理论分子量为34.5kDa。
优选的,所述(B)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.8。
优选的,所述(B)8多肽序列的DNA序列根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化,委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
优选的,所述AB多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.3,由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联形成。
优选的,所述(AB)4多肽序列为SEQ ID No.6,理论分子量为39kDa。
优选的,所述(AB)4多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.9。
优选的,所述(AB)4多肽序列的DNA序列根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化,委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
本发明中选取的人17型胶原蛋白螺旋区序列,组合形成A多肽序列和B多肽序列的串联后四次重复的DNA序列,能大量稳定的表达重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,具有较高的细胞粘附活性,促细胞增殖活性,促细胞迁移活性和优异的的促毛囊修复再生的生物学活性;同时,从人17型胶原蛋白的多个螺旋区序列中进行优化筛选,能减少致敏的危险,避免病毒感染。本发明人发现,市场上销售的大多胶原蛋白产品来自猪、牛、鱼等动物组织,不可避免的有免疫原性和潜在的病毒、疫病等生物安全性隐患,无法进行大量应用。且市场上常见的Ⅰ型和Ⅲ型重组胶原蛋白,属于纤维类胶原蛋白,而本发明中的17型胶原蛋白的属于非纤维类胶原蛋白中重要的亚型,在生物体内作用的机理和存在的位置与Ⅰ型和Ⅲ型重组胶原蛋白相差较大,人源ⅩⅦ型胶原蛋白的氨基酸序列很长,是由三个α1链结合形成的同源三聚体,单链分子量180kDa。其中包含有70kDa的球状胞内结构域,一个跨膜域和120kDa的胞外胶原结构域,具有非常强的热稳定性。理论上很难有效分泌于胞外且易于降解,要成功表达就需要进行相关序列的选取。本发明选取了特定的优化序列片段,通过A多肽序列和B多肽序列的串联后四次重复的DNA序列,成功的表达出人源化ⅩⅦ型胶原蛋白,且合成的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白具有较高的细胞粘附活性,促细胞增殖活性,促细胞迁移活性和优异的的促毛囊修复再生的生物学活性。
本发明第二方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的制备方法,包括以下步骤:
S1:将合成的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的DNA序列插入pYES2/CT-MFα表达载体,构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达载体;
S2:将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株INVScl(购自Invitrogen,C81000),构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达菌株;
S3:培养表达菌株,分离纯化重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白。
优选的,所述S1中的具体步骤为:使用质粒提取试剂盒,按照说明书提取pYES2/CT-MFα空载质粒;使用QuickCut NotⅠ和QuickCut XbaⅠ对目的基因和pYES2/CT-MFα空载质粒进行双酶切酶切,酶切体系(50μL)为:QuickCut NotⅠ、QuickCut XbaⅠ和10×QuickCutGreen Buffer各5μL、pYES2/CT-MFα空载质粒或目的基因35μL;在37℃金属浴中酶切2h;酶切后以1.0%琼脂糖凝胶进行电泳,并分别切胶回收酶切后的空载质粒和目的基因片段;将回收后的产物通过T4DNA Ligase连接,连接体系(10μL)为:目的基因5μL、载体片段3μL、T4DNA ligase和10×Ligase buffer各1μL;将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养,PCR鉴定后送公司进行测序;测序无误即获得新的表达载体pYES2/CT-MFα-C17a1。
优选的,所述S2中将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株的具体步骤,包括以下步骤:
M1:将构建成功的表达质粒加入到酿酒酵母INVScl感受态细胞,混匀后转移到预冷的电击杯中,冰上静置3~7min;
M2:将Bio-Rad电转化仪调至真菌档,将M1中的电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化;
M3:电击结束后,迅速向电击转化完成的电击杯中加入预冷的1M山梨醇溶液,混合均匀,孵育,得到混合溶液;
M4:将混合溶液离心后弃去400-500μL上清,吹匀后涂布在SC-U固体平板;
M5:将涂布完成的SC-U固体平板倒置于28~32℃恒温培养,直至长出单克隆菌落。
优选的,所述S3中的具体步骤包括:挑取单菌落接种于SC-U选择培养基,振荡培养过夜;测定其OD600吸光值,计算好相应体积的菌液转接至于SC-U诱导培养基中,使得初始OD600=0.4±0.1继续培养,每24h向培养基中添加半乳糖至终质量浓度为2.0%;诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品,离心收集表达上清;经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
优选的,所述S3中的具体步骤还包括:离心收集诱导了96h后的菌液上清,用0.22μm滤膜过滤后备用;使用Akta蛋白纯化仪,以缓冲液A(20mM NaH2PO4,pH 4.0)平衡阳离子交换介质至280nm波长处的吸光值和电导率值都保持不变后开始上样,设置样品经过泵过层析柱的流速5-6mL/min。监测紫外280nm波长处的吸光值,当其上升时,开始接样。待上样结束后,关闭接样,再以缓冲液A平衡阳离子层析介质,当280nm波长处的吸光值下降时,打开接样,直至紫外和电导降至最低且不再变化,停止接样。用缓冲液B(20mM NaH2PO4,1M的NaCl,pH 4.0)洗脱,收集洗脱液,透析后即得到重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白原液,经考马斯亮蓝法测得蛋白含量约为0.1mg/mL。
本发明中,选用酿酒酵母,利于纯化,生产工艺成熟、成本较低且无免疫原性。本发明人发现,目前常用的表达重组ⅩⅦ型人源化蛋白选用的载体为原核大肠杆菌或毕赤酵母,但原核大肠杆菌表达的胶原蛋白没有对蛋白质的翻译后修饰,无法有效形成天然胶原的三螺旋结构,纯化难度大,还有大量内毒素生成,难以去除。毕赤酵母不是一种食品微生物,发酵时又要添加甲醇,而且大量甲醇的堆放成为潜在风险源。相较于前两种,酿酒酵母在医药和食品工业中是公认的安全微生物体,其生化和遗传研究已经非常详细。选用酿酒酵母,可以对蛋白进行翻译后修饰,生产工艺成熟,利于纯化,成本较低且无免疫原性。
本发明中,通过将重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的基因片段插入pYES2/CT-MFα表达载体,转化酿酒酵母菌株,成功表达出稳定的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,且提高了重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的产量。本发明人发现,ⅩⅦ人源化胶原蛋白的结构十分复杂,ⅩⅦ人源化胶原蛋白结构特征是由3条肽链形成的三螺旋结构,即由3条α肽链以右手超螺旋方式形成蛋白质,这样的三股螺旋区域被称为胶原区域。每个α肽链在分子结构上都是由重复出现的Gly-X-Y(X、Y代表Gly之外的任何氨基酸残基,X往往是Pro,Y往往是Hyp)肽段构成左手螺旋,3条链在氨基酸残基的相互作用下,以同一轴为中心,以右手超螺旋方式形成稳定的三股螺旋结构。因此,ⅩⅦ人源化胶原蛋白的序列很难自发结合成为稳定的三螺旋结构发挥生物学功能。本发明选取了利用酿酒酵母系统,并采用特定的优化序列片段,进行组合优化,成功的表达出稳定的人源化ⅩⅦ型胶原蛋白,且工序简单,操作方便。
本发明第三方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的应用,应用于组织工程产品、化妆品、保健品、医疗器械或药物的制备。
优选的,所述化妆品为面霜、精华水、乳液、面膜、头皮精华液、洗发露。
优选的,所述医疗器械为创面敷料类产品。
有益效果
1、本发明中选创造性的取的人17型胶原蛋白螺旋区序列,组合形成A多肽序列和B多肽序列的串联后四次重复的DNA序列,能大量稳定的表达重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,具有较高的细胞粘附活性,促细胞增殖活性,促细胞迁移活性和优异的的促毛囊修复再生的生物学活性;同时,从人17型胶原蛋白的多个螺旋区序列中进行优化筛选,能减少致敏的危险,避免病毒感染。
2、本发明中,选用酿酒酵母,利于纯化,生产工艺成熟、成本较低且无免疫原性。
3、本发明中,通过将重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的基因片段插入pYES2/CT-MFα表达载体,转化酿酒酵母菌株,成功表达出稳定的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,且提高了重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的产量。
4、本发明中合成的ⅩⅦ人源化胶原蛋白比商品化的天然人胶原蛋白更具有优异的细胞粘附活性、细胞迁移活性等生物学活性。
5、本发明首次制备得到了一种新的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,无内毒素、成本交底且无免疫原性,可大批量制备,有效弥补市场空缺,丰富同类胶原产品。
附图说明
图1为实施例1中pYES2/CT-MFα-COL17a1载体图谱;
图2为实施例1~3中酿酒酵母上清中表达C17A、C17B、C17C的SDS-PAGE检测结果图;
图3为实施例1~3中C17A、C17B、C17C和BSA、商品化胶原蛋白的细胞贴壁状态观察图。
图4为实施例1~3中C17A、C17B、C17C和BSA、商品化胶原蛋白促细胞贴壁的效价的柱形图;
图5为实施例1~3中C17A、C17B、C17C和BSA、商品化胶原蛋白促细胞迁移的镜下观察的试验细胞结果图;
图6为实施例1~3中C17A、C17B、C17C和BSA、商品化胶原蛋白促细胞迁移的结果图;
图7为实施例3中C17C(实验组)、对照组(蛋白原液)、米诺地尔组中的小鼠在0天、7天、10天、14天、21天的背部毛发生长情况;从上至下分别为对照组、实验组、米诺地尔组的背部毛发生长情况。
图8为实施例3中C17C(实验组)、对照组(蛋白原液)、米诺地尔组中的小鼠在0天、7天、10天、14天、21天背部皮肤组织切片情况;从上至下分别为对照组、实验组、米诺地尔组的背部皮肤组织切片情况。
具体实施方式
实施例1
本实施例第一方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,为C17A胶原蛋白。
所述C17A胶原蛋白包括(A)8多肽序列,由A多肽序列重复八次形成,包括456个氨基酸;
所述A多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt:Q9UMD9:G567–623G,基础单元多肽序列为SEQ ID No.1。
所述(A)8多肽序列为SEQ ID No.4,理论分子量为43kDa。
所述(A)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.7,根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化,委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
本实施例第二方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的制备方法,包括以下步骤:
S1:将合成的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的DNA序列插入pYES2/CT-MFα表达载体,构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达载体;
S2:将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株INVScl(购自Invitrogen,C81000),构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达菌株;
S3:培养表达菌株,分离纯化重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白。
所述S1中的具体步骤为:使用质粒提试剂盒,按照说明书提取pYES2/CT-MFα空载质粒;使用QuickCut NotⅠ和QuickCut XbaⅠ对目的基因和pYES2/CT-MFα空载质粒进行双酶切酶切,酶切条件为37℃,2h,酶切体系(50μL)为:QuickCut NotⅠ、QuickCut XbaⅠ和10×QuickCut Green Buffer各5μL、pYES2/CT-MFα空载质粒或目的基因35μL。在37℃金属浴中酶切2h。酶切后以1.0%琼脂糖凝胶进行电泳,并分别切胶回收酶切后的空载质粒和目的基因片段。将回收后的产物通过T4 DNA Ligase连接,连接体系(10μL)为:目的基因5μL、载体片段3μL、T4 DNA ligase和10×Ligase buffer各1μL。将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养,PCR鉴定后送公司进行测序。测序无误即获得新的表达载体pYES2/CT-MFα-COL17a1(C17A),载体图谱见图1。
所述S2中将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株的具体步骤,包括以下步骤:
M1:将10μL构建成功的表达质粒加入到80μL酿酒酵母INVScl感受态细胞,混匀后转移到预冷的电击杯中,冰上静置3~7min;
M2:将Bio-Rad电转化仪调至真菌档,将M1中的电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化;
M3:电击结束后,迅速向电击转化完成的电击杯中加入500μL预冷的1M山梨醇溶液,混合均匀,30℃孵育1h,得到混合溶液;
M4:将混合溶液离心后弃去400μL上清,吹匀后涂布在SC-U固体平板;
M5:将涂布完成的SC-U固体平板倒置于30℃恒温培养,直至长出单克隆菌落;
所述S3中的具体步骤包括:挑取上述的单菌落接种于20mL的SC-U选择培养基,经30℃、220rpm振荡培养过夜;测定其OD600吸光值,计算好相应体积的菌液转接至于100mL的SC-U诱导培养基中,使得初始OD600为0.4继续培养,每24h向培养基中添加半乳糖至终质量浓度为2.0%;诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品,离心收集表达上清;经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。结果见图2。
所述S3中的具体步骤还包括:离心收集诱导了96h后的菌液上清,用0.22μm滤膜过滤后备用;使用Akta蛋白纯化仪,以缓冲液A(20mM NaH2PO4,pH 4.0)平衡阳离子交换介质(千纯生物SP Purose 6Fast Flow填料)至280nm波长处的吸光值和电导率值都保持不变后开始上样,设置样品经过泵过层析柱的流速5-6mL/min。监测紫外280nm波长处的吸光值,当其上升时,开始接样。待上样结束后,关闭接样,再以缓冲液A平衡阳离子层析介质,当280nm波长处的吸光值下降时,打开接样,直至紫外和电导降至最低且不再变化,停止接样。用缓冲液B(20mM NaH2PO4,1M的NaCl,pH 4.0)洗脱,收集洗脱液,透析后(透析液为PBS,pH7.4)即得到重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白原液,即COL17a1(C17A)蛋白原液,经考马斯亮蓝法测得蛋白含量为0.1mg/mL。
本实施例第三方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的应用,应用于化妆品的制备。所述的化妆品为头皮精华液。
实施例2
实施例2的具体实施方式同实施例1,不同之处在于,所述重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,为C17B胶原蛋白。
所述C17B胶原蛋白包括(B)8多肽序列,由B多肽序列重复八次形成,包括360个氨基酸。
所述B多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt:Q9UMD9:G1438–1482V,基础单元多肽序列为SEQ ID No.2。
所述(B)8多肽序列为SEQ ID No.5,理论分子量为34.5kDa。
所述(B)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.8,根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化,委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
本实施例提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的应用,应用于化妆品的制备。所述的化妆品为洗发露。
实施例3
实施例3的具体实施方式同实施例1,不同之处在于,所述重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,为C17C胶原蛋白。
所述C17C胶原蛋白包括(AB)4多肽序列,由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联重复四次形成,包括408个氨基酸。
所述A多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt:Q9UMD9:G567–623G,基础单元多肽序列为SEQ ID No.1。
所述B多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt:Q9UMD9:G1438–1482V,基础单元多肽序列为SEQ ID No.2。
所述AB多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.3。
所述(AB)4多肽序列为SEQ ID No.6,理论分子量为39kDa。
所述(AB)4多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.9,根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化,委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
本实施例提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的应用,应用于医疗器械的制备。所述的医疗器械为创面敷料。
实施例中序列见表1。
表1
重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白效果测试结果
1、重组胶原蛋白细胞粘附活性检测
1.1试验材料
完全细胞培养液:量取胎牛血清10mL,双抗1mL,加入DMEM培养液90mL,4℃保存。
无血清培养基:量取双抗1mL,加入1640培养液99mL,4℃保存。
消化液:0.25%胰蛋白酶。
PBS缓冲液:称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并定容至1000mL,经121℃、15分钟高压灭菌。
Balb/c 3T3细胞在完全细胞培养液中呈单层、贴壁生长,每4~5天传代一次,1︰2消化传代,于完全培养液中生长繁殖。
样品:实施例1~3中制备得到的C17A、C17B和C17C原液,BSA(牛血清白蛋白,购自Solarbio,A8020),商品化胶原蛋白(即ⅩⅦ型胶原对照,购自Sigma,C7661)。
1.2试验操作
1.2.1样品稀释及孵育
将C17A、C17B和C17C原液分别用PBS预稀释至0.5μg/mL,预稀释完成后在96孔板中进行2倍梯度稀释,共做10个稀释度,每孔50μL不同稀释度的样本,并设立阴性对照,加入50μL PBS作为对照,4℃过夜孵育。
1.2.2促细胞贴壁试验
孵育完成后弃去板中液体,每孔加入100μL 30g/L BSA封闭,置于37℃温箱孵育1h,取出弃去板中液体,加入3T3细胞悬液(用无血清培养基重悬),细胞接种密度为1.0×105个/mL,每孔接种100μL,温箱孵育5h。
1.3试验结果
将孵育完成的细胞板用PBS洗涤3次,镜下观察细胞贴壁情况,结果见图3;选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数,根据计数结果使用四参数拟合曲线得出效价。结果见表2、图4。
表2
2.促细胞迁移试验
2.1试验原理
当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像,通过比较图像以确定细胞迁移速率。
2.2试验步骤
2.2.1先用marker笔在6孔板背后,用直尺对齐,均匀得划横线,每隔0.5cm一道,横穿过孔。
2.2.2向6孔板孔中加入浓度为5×105个/mL的3T3细胞悬液2mL。
2.2.3第二天观察到6孔板内细胞均长满单层,用枪头比着直尺,垂直于背后的横线划痕,每孔内划2道。
2.2.4用PBS洗细胞3次,洗掉划下的悬浮细胞。
2.2.5根据分组往孔中加入1.8mL无血清培养液,之后分别加入200μL的实施例1~3中制备得到的C17A、C17B和C17C原液,BSA,商品化胶原蛋白(即ⅩⅦ型胶原对照,购自Sigma,C7661),细胞对照孔加入等量的PBS溶液。
2.2.6放入37度5% CO2培养箱,培养。0时拍照,记录每孔内拍照位置。后续观察时对固定位置进行观察、拍照。
2.3试验结果
根据拍摄的照片,计算细胞的迁移率,结果见表3,图5,图6。
表3
3.促细胞生长活性测定
3.1包括以下步骤:
(1)将小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/c 3T3细胞)用完全培养液于37℃、5%二氧化碳培养,控制细胞浓度为每1mL含1.0×105~5.0×105个细胞,传代后24-36h用于生物学活性测定;
(2)弃去步骤(1)培养瓶中的培养液,消化和收集细胞,用完全培养液配成每1mL含5.0×104~8.0×104个细胞的细胞悬液,接种于96孔板中,接种过程中不停摇匀,保持每孔接种数相同,每孔100μL,于37℃、5%二氧化碳条件下培养;
(3)步骤(2)中完全培养液培养24h后,换成维持培养液,置37℃、5%二氧化碳培养24h;
(4)待步骤(3)培养24h后,将制备的细胞培养板弃去维持液,分别加入实施例1~3中制备得到的C17A、C17B和C17C原液,BSA,商品化胶原蛋白(即ⅩⅦ型胶原对照,购自Sigma,C7661),每孔100μL,置37℃、5%二氧化碳培养64h;
(5)采用MTT比色法检测结果:每孔加入MTT溶液20μL,于37℃、5%二氧化碳培养5h。
以上操作均在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后,向每孔中加入DMSO 100μL,混匀后在酶标仪上,以630nm为参比波长,570nm为试验波长测定吸光度,记录测定结果。
3.2试验结果
采用MTT法检测不同蛋白组对Balb/c 3T3细胞的促细胞生长效果,结果见下表4。
表4
4、小鼠毛发生长实验
4.1实验目的
在本实验中,通过创建小鼠雄性脱发模型,使用含有蛋白的水溶液,观察各组小鼠毛发的生长情况。
4.2试验材料与方法
4.2.1实验动物
选择健康的成年黑色雌性C57BL/6小鼠24只,按照清洁级环境饲养,给予充分饲料和水自由喂养,每天喂料喂水,检查动物生理活动情况。
4.2.2试验试剂
蛋白原液(由芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司生产制备,蛋白含量为1mg/瓶),实施例3中制备得到的C17C原液;米诺地尔酊2%(购自山西振东安欣生物制药有限公司),脱毛膏(购自利洁时家化(中国)有限公司);10%福尔马林(购自南昌雨露实验器材有限公司)。
4.2.3试验仪器
荧光显微镜(迈时迪(东莞)科技有限公司,型号MSD530)
4.3实验方法
4.3.1试验分组
将24只C57BL/6雌性小鼠(5周龄)随机分为3组,每组8只小鼠,分别为实验组(实施例3中制备得到的C17C原液),对照组(蛋白原液),米诺地尔组。
4.3.2建立小鼠模型及干预方案
在试验前将脱毛膏大面积涂于小鼠背部,15min后,擦去脱毛膏,从而达到拔毛的效果。实验组涂抹蛋白原液,对照组涂抹蒸馏水,米诺地尔组涂抹2%米诺地尔酊。每日定时给药1次,连续给药21天。
4.3.3毛发生长的观察
实验组分别在第0d、7d、10d、14d、21d观察小鼠毛发的生长情况,每日在固定光源下拍照。
4.3.4组织学检查
分别在第0d、7d、10d、14d、21d处死1只小鼠,取背部皮肤切取皮肤表本,进行组织学观察。10%福尔马林固定,脱水,石蜡包埋,切片,HE染色,光学显微镜下观察毛囊的周期性变化。
4.4实验结果
通过毛发生长观察结果图7及组织切片观察结果图8,可以得出蛋白原液可促进小鼠静止期毛囊提前进入生长期,促进毛发生长的结论。
Claims (10)
1.一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,其特征在于,包括C17A或C17B或C17C;所述C17A包括(A)n多肽序列,由A多肽序列重复n次形成;C17B包括(B)n多肽序列,由B多肽序列重复n次形成;C17C包括(AB)n多肽序列,由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联重复n次形成;其中n为4~8的整数;所述A多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.1;所述B多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.2。
2.根据权利要求1所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,其特征在于,所述C17A包括(A)8多肽序列,由A多肽序列重复八次形成,包括456个氨基酸;所述C17B包括(B)8多肽序列,由B多肽序列重复八次形成,包括360个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,其特征在于,所述C17C包括(AB)4多肽序列,由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联重复四次形成,包括408个氨基酸。
4.根据权利要求1所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,其特征在于,所述A多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt:Q9UMD9:G567–623G。
5.根据权利要求1所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,其特征在于,所述B多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt:Q9UMD9:G1438–1482V。
6.根据权利要求2所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白,其特征在于,所述(A)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.7;所述(B)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.8;所述(AB)4多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.9。
7.一种根据权利要求1~6任一项所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:将合成的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的DNA序列插入pYES2/CT-MFα表达载体,构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达载体;
S2:将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株INVScl,构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达菌株;
S3:培养表达菌株,分离纯化重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白。
8.根据权利要求7所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的制备方法,其特征在于,所述S2中将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株的具体步骤,包括以下步骤:
M1:将构建成功的表达质粒加入到酿酒酵母INVScl感受态细胞,混匀后转移到预冷的电击杯中,冰上静置3~7min;
M2:将Bio-Rad电转化仪调至真菌档,将M1中的电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化;
M3:电击结束后,迅速向电击转化完成的电击杯中加入预冷的1M山梨醇溶液,混合均匀,孵育,得到混合溶液;
M4:将混合溶液离心后弃去400-500μL上清,吹匀后涂布在SC-U固体平板;
M5:将涂布完成的SC-U固体平板倒置于28~32℃恒温培养,直至长出单克隆菌落。
9.根据权利要求7所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的制备方法,其特征在于,所述S3中的具体步骤包括:挑取单菌落接种于SC-U选择培养基,振荡培养过夜;测定其OD600吸光值,计算好相应体积的菌液转接至于SC-U诱导培养基中,使得初始OD600=0.4±0.1继续培养,每24h向培养基中添加半乳糖至终质量浓度为2.0%;诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品,离心收集表达上清;经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
10.一种根据权利要求1~6任一项所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的应用,其特征在于,应用于组织工程产品、化妆品、保健品、医疗器械或药物的制备;所述化妆品为面霜、精华水、乳液、面膜、头皮精华液、洗发露;所述医疗器械为创面敷料类产品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310564523.8A CN116751282B (zh) | 2023-05-17 | 2023-05-17 | 一种重组ⅹⅶ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310564523.8A CN116751282B (zh) | 2023-05-17 | 2023-05-17 | 一种重组ⅹⅶ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116751282A true CN116751282A (zh) | 2023-09-15 |
CN116751282B CN116751282B (zh) | 2024-07-12 |
Family
ID=87959871
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310564523.8A Active CN116751282B (zh) | 2023-05-17 | 2023-05-17 | 一种重组ⅹⅶ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116751282B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116987179A (zh) * | 2023-09-20 | 2023-11-03 | 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 | 一种长效耐热胶原蛋白及其制备方法与应用 |
CN117003857A (zh) * | 2023-09-28 | 2023-11-07 | 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 | 一种具有快速吸收功效的胶原蛋白及其制备方法与应用 |
CN117088963A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-11-21 | 博汇美萃生物工程技术(广东)有限公司 | 一种用于头皮修护的peg修饰长效重组胶原蛋白及制备方法 |
CN117756926A (zh) * | 2023-12-26 | 2024-03-26 | 广州普言生物科技有限公司 | 一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17及其制备方法和应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090291474A1 (en) * | 2008-05-16 | 2009-11-26 | Szu-Wen Wang | Collagen-like polypeptides and encoding polynucleotides |
CN110845603A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-02-28 | 中国科学院生物物理研究所 | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 |
CN113185604A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-07-30 | 江苏创健医疗科技有限公司 | 一种重组人xvii型胶原蛋白、制备方法和应用 |
WO2023024552A1 (zh) * | 2021-08-23 | 2023-03-02 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 |
CN115960211A (zh) * | 2022-12-23 | 2023-04-14 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 一种重组人源ⅵ型胶原蛋白及其制备方法和应用 |
-
2023
- 2023-05-17 CN CN202310564523.8A patent/CN116751282B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090291474A1 (en) * | 2008-05-16 | 2009-11-26 | Szu-Wen Wang | Collagen-like polypeptides and encoding polynucleotides |
CN110845603A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-02-28 | 中国科学院生物物理研究所 | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 |
US20220348639A1 (en) * | 2019-10-31 | 2022-11-03 | Shanxi Jinbo Bio-Pharmaceutical Co., Ltd. | Human collagen 17-type polypeptide, production method therefor and use thereof |
CN113185604A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-07-30 | 江苏创健医疗科技有限公司 | 一种重组人xvii型胶原蛋白、制备方法和应用 |
WO2023024552A1 (zh) * | 2021-08-23 | 2023-03-02 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 |
CN115960211A (zh) * | 2022-12-23 | 2023-04-14 | 江苏创健医疗科技股份有限公司 | 一种重组人源ⅵ型胶原蛋白及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
K TASANEN: "Hemizygosity for a glycine substitution in collagen XVII: Unfolding and degradation of the ectodomain", JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, vol. 115, no. 2, 31 August 2000 (2000-08-31), pages 207 - 212 * |
王荣春, 徐德昌, 秦兰霞: "胶原蛋白与Ⅵ型胶原蛋白的结构概述", 生物信息学, no. 04, 20 December 2004 (2004-12-20), pages 31 - 34 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117088963A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-11-21 | 博汇美萃生物工程技术(广东)有限公司 | 一种用于头皮修护的peg修饰长效重组胶原蛋白及制备方法 |
CN116987179A (zh) * | 2023-09-20 | 2023-11-03 | 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 | 一种长效耐热胶原蛋白及其制备方法与应用 |
CN116987179B (zh) * | 2023-09-20 | 2023-12-12 | 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 | 一种胶原蛋白及其制备方法与应用 |
CN117003857A (zh) * | 2023-09-28 | 2023-11-07 | 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 | 一种具有快速吸收功效的胶原蛋白及其制备方法与应用 |
CN117003857B (zh) * | 2023-09-28 | 2024-01-05 | 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 | 一种具有透皮吸收性能的胶原蛋白及其制备方法与应用 |
CN117756926A (zh) * | 2023-12-26 | 2024-03-26 | 广州普言生物科技有限公司 | 一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17及其制备方法和应用 |
CN117756926B (zh) * | 2023-12-26 | 2024-06-07 | 广东普言生物科技有限公司 | 一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116751282B (zh) | 2024-07-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN116751282B (zh) | 一种重组ⅹⅶ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
CN110606896B (zh) | 重组人源III型胶原蛋白α1链及其应用 | |
CN110204608B (zh) | 一种酵母发酵小分子重组纤连蛋白肽及其制备方法和应用 | |
CN111334512B (zh) | 含羟脯氨酸与羟赖氨酸的重组类人胶原蛋白及其生产方法 | |
CN106554410B (zh) | 一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法 | |
CN114276435B (zh) | 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白及其应用 | |
CN111217903B (zh) | 一种重组人纤连蛋白ⅲ1-c及其制备方法和应用 | |
CN116987179B (zh) | 一种胶原蛋白及其制备方法与应用 | |
CN116535494B (zh) | 一种重组类人源ⅲ型胶原蛋白及其应用 | |
CN102747097B (zh) | Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体及其表达纯化方法 | |
CN113186109A (zh) | 一种酿酒酵母表达长效重组纤连蛋白及其在化妆品中的应用 | |
CN116535520A (zh) | 一种细胞外基质蛋白融合蛋白及其制备方法和应用 | |
CN116574172B (zh) | 重组人源化i型胶原蛋白及其制备方法 | |
CN115960209B (zh) | 一种重组人源化胶原蛋白及其应用 | |
CN116640205A (zh) | 重组xvii型胶原蛋白及其表达菌株 | |
CN116925207A (zh) | 重组人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
CN117069864B (zh) | 一种具有修复活性的重组纤连-胶原融合蛋白及其制备方法与应用 | |
CN116970071B (zh) | 一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白及其制备方法与应用 | |
CN113150173A (zh) | 一种重组人胶原蛋白肽及其制备方法和应用 | |
CN109251896A (zh) | 一株高表达hKLs-his蛋白的细胞株及其制备方法和应用 | |
CN116003635A (zh) | 一种长效纤连蛋白及其制备方法和应用 | |
CN118064468B (zh) | 一种重组弹性蛋白、制备方法及其应用 | |
CN116640231B (zh) | 一种重组人源化17型胶原多肽及其制备方法 | |
CN117886922B (zh) | 一种重组人源纤连蛋白及其表达体系 | |
CN117126874B (zh) | 大规模制备164.88°三螺旋结构胶原蛋白生物方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |