CN116751282A - 一种重组ⅹⅶ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及IPC C07K14，更具体地涉及，一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，包括C17A胶原蛋白或C17B胶原蛋白或C17C胶原蛋白。本发明首次利用酿酒酵母系统，并采用特定的优化序列片段，成功表达出分泌可溶性的人源化ⅩⅦ型胶原蛋白。该人源化ⅩⅦ型胶原蛋白相较于大肠杆菌表达的人源化ⅩⅦ型胶原蛋白，具有更高的细胞粘附活性、促细胞增殖活性、促细胞迁移活性以及优异的促进毛发生长的作用，且安全系数高，适合医疗器械或护肤品领域的广泛使用。

Description

一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及IPC C07K14，更具体地涉及，一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是一种生物高分子纤维蛋白，是细胞外基质中含量最多、分布最广的功能性蛋白质之一，约占总蛋白的1/3。在人体肌肤蛋白质的组成中，胶原蛋白起到重要作用，可形成组织或愈合伤口的结构支架，促进细胞黏附和趋化，有助于组织修复，为皮肤提供强度和支撑。目前已发现了至少49种不同的胶原蛋白多肽链，其中可人工合成的胶原蛋白类型有28种。根据在体内的分布，胶原蛋白又可分为间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原，其中间质胶原蛋白是整个机体胶原的主要部分。随着时间的流逝，真皮成纤维细胞数量逐渐减少，合成胶原能力降低，同时蛋白酶释放增加，皮肤中的胶原蛋白降解增加，使皮肤呈现衰老的表现。此外每单位面积皮肤的总胶原含量的减少速度约为每年1％。
人ⅩⅦ型(COL17A1基因编码)胶原蛋白是一种跨膜型非成纤维胶原蛋白，其为三条相同α1(ⅩⅦ)链构成的均相三聚体，分为胞内、跨膜、胞外三大类结构域。COL17A1蛋白是细胞中半桥粒的一种组成成分，在上皮细胞-基底膜的作用中发挥重要作用，可调控上皮细胞的黏附、分离和发育分化，对毛囊细胞的分化和再生有重要作用。
现有专利CN202111082088.2公开了一种重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1L1T及其制备方法和用途，该专利开发的重组Ⅰ型人源化胶原蛋白C1L1T具有促进细胞黏附的活性，在体内无免疫反应，制备方法简单，成本较低。但其修复损伤的效果还有待进一步提高。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明第一方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，包括C17A或C17B或C17C。
优选的，所述C17A包括(A)n多肽序列，由A多肽序列重复n次形成；C17B包括(B)n多肽序列，由B多肽序列重复n次形成；C17C包括(AB)n多肽序列，由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联重复n次形成；其中n为4～8的整数。
优选的，所述C17A包括(A)8多肽序列，由A多肽序列重复八次形成，包括456个氨基酸；
优选的，所述C17B包括(B)8多肽序列，由B多肽序列重复八次形成，包括360个氨基酸。
优选的，所述C17C包括(AB)4多肽序列，由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联重复四次形成，包括408个氨基酸。
优选的，所述A多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt：Q9UMD9：G567–623G。
优选的，所述A多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.1。
优选的，所述(A)8多肽序列为SEQ ID No.4，理论分子量为43kDa。
优选的，所述(A)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.7。
优选的，所述(A)8多肽序列的DNA序列根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化，委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
优选的，所述B多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt：Q9UMD9：G1438–1482V。
优选的，所述B多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.2。
优选的，所述(B)8多肽序列为SEQ ID No.5，理论分子量为34.5kDa。
优选的，所述(B)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.8。
优选的，所述(B)8多肽序列的DNA序列根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化，委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
优选的，所述AB多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.3，由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联形成。
优选的，所述(AB)4多肽序列为SEQ ID No.6，理论分子量为39kDa。
优选的，所述(AB)4多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.9。
优选的，所述(AB)4多肽序列的DNA序列根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化，委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
本发明中选取的人17型胶原蛋白螺旋区序列，组合形成A多肽序列和B多肽序列的串联后四次重复的DNA序列，能大量稳定的表达重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，具有较高的细胞粘附活性，促细胞增殖活性，促细胞迁移活性和优异的的促毛囊修复再生的生物学活性；同时，从人17型胶原蛋白的多个螺旋区序列中进行优化筛选，能减少致敏的危险，避免病毒感染。本发明人发现，市场上销售的大多胶原蛋白产品来自猪、牛、鱼等动物组织，不可避免的有免疫原性和潜在的病毒、疫病等生物安全性隐患，无法进行大量应用。且市场上常见的Ⅰ型和Ⅲ型重组胶原蛋白，属于纤维类胶原蛋白，而本发明中的17型胶原蛋白的属于非纤维类胶原蛋白中重要的亚型，在生物体内作用的机理和存在的位置与Ⅰ型和Ⅲ型重组胶原蛋白相差较大，人源ⅩⅦ型胶原蛋白的氨基酸序列很长，是由三个α1链结合形成的同源三聚体，单链分子量180kDa。其中包含有70kDa的球状胞内结构域，一个跨膜域和120kDa的胞外胶原结构域，具有非常强的热稳定性。理论上很难有效分泌于胞外且易于降解，要成功表达就需要进行相关序列的选取。本发明选取了特定的优化序列片段，通过A多肽序列和B多肽序列的串联后四次重复的DNA序列，成功的表达出人源化ⅩⅦ型胶原蛋白，且合成的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白具有较高的细胞粘附活性，促细胞增殖活性，促细胞迁移活性和优异的的促毛囊修复再生的生物学活性。
本发明第二方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1：将合成的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的DNA序列插入pYES2/CT-MFα表达载体，构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达载体；
S2：将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株INVScl(购自Invitrogen，C81000)，构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达菌株；
S3：培养表达菌株，分离纯化重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白。
优选的，所述S1中的具体步骤为：使用质粒提取试剂盒，按照说明书提取pYES2/CT-MFα空载质粒；使用QuickCut NotⅠ和QuickCut XbaⅠ对目的基因和pYES2/CT-MFα空载质粒进行双酶切酶切，酶切体系(50μL)为：QuickCut NotⅠ、QuickCut XbaⅠ和10×QuickCutGreen Buffer各5μL、pYES2/CT-MFα空载质粒或目的基因35μL；在37℃金属浴中酶切2h；酶切后以1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，并分别切胶回收酶切后的空载质粒和目的基因片段；将回收后的产物通过T4DNA Ligase连接，连接体系(10μL)为：目的基因5μL、载体片段3μL、T4DNA ligase和10×Ligase buffer各1μL；将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养，PCR鉴定后送公司进行测序；测序无误即获得新的表达载体pYES2/CT-MFα-C17a1。
优选的，所述S2中将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株的具体步骤，包括以下步骤：
M1：将构建成功的表达质粒加入到酿酒酵母INVScl感受态细胞，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰上静置3～7min；
M2：将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，将M1中的电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化；
M3：电击结束后，迅速向电击转化完成的电击杯中加入预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，孵育，得到混合溶液；
M4：将混合溶液离心后弃去400-500μL上清，吹匀后涂布在SC-U固体平板；
M5：将涂布完成的SC-U固体平板倒置于28～32℃恒温培养，直至长出单克隆菌落。
优选的，所述S3中的具体步骤包括：挑取单菌落接种于SC-U选择培养基，振荡培养过夜；测定其OD600吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于SC-U诱导培养基中，使得初始OD600＝0.4±0.1继续培养，每24h向培养基中添加半乳糖至终质量浓度为2.0％；诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品，离心收集表达上清；经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
优选的，所述S3中的具体步骤还包括：离心收集诱导了96h后的菌液上清，用0.22μm滤膜过滤后备用；使用Akta蛋白纯化仪，以缓冲液A(20mM NaH2PO4，pH 4.0)平衡阳离子交换介质至280nm波长处的吸光值和电导率值都保持不变后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6mL/min。监测紫外280nm波长处的吸光值，当其上升时，开始接样。待上样结束后，关闭接样，再以缓冲液A平衡阳离子层析介质，当280nm波长处的吸光值下降时，打开接样，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样。用缓冲液B(20mM NaH2PO4，1M的NaCl，pH 4.0)洗脱，收集洗脱液，透析后即得到重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白原液，经考马斯亮蓝法测得蛋白含量约为0.1mg/mL。
本发明中，选用酿酒酵母，利于纯化，生产工艺成熟、成本较低且无免疫原性。本发明人发现，目前常用的表达重组ⅩⅦ型人源化蛋白选用的载体为原核大肠杆菌或毕赤酵母，但原核大肠杆菌表达的胶原蛋白没有对蛋白质的翻译后修饰，无法有效形成天然胶原的三螺旋结构，纯化难度大，还有大量内毒素生成，难以去除。毕赤酵母不是一种食品微生物，发酵时又要添加甲醇，而且大量甲醇的堆放成为潜在风险源。相较于前两种，酿酒酵母在医药和食品工业中是公认的安全微生物体，其生化和遗传研究已经非常详细。选用酿酒酵母，可以对蛋白进行翻译后修饰，生产工艺成熟，利于纯化，成本较低且无免疫原性。
本发明中，通过将重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的基因片段插入pYES2/CT-MFα表达载体，转化酿酒酵母菌株，成功表达出稳定的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，且提高了重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的产量。本发明人发现，ⅩⅦ人源化胶原蛋白的结构十分复杂，ⅩⅦ人源化胶原蛋白结构特征是由3条肽链形成的三螺旋结构，即由3条α肽链以右手超螺旋方式形成蛋白质，这样的三股螺旋区域被称为胶原区域。每个α肽链在分子结构上都是由重复出现的Gly-X-Y(X、Y代表Gly之外的任何氨基酸残基，X往往是Pro，Y往往是Hyp)肽段构成左手螺旋，3条链在氨基酸残基的相互作用下，以同一轴为中心，以右手超螺旋方式形成稳定的三股螺旋结构。因此，ⅩⅦ人源化胶原蛋白的序列很难自发结合成为稳定的三螺旋结构发挥生物学功能。本发明选取了利用酿酒酵母系统，并采用特定的优化序列片段，进行组合优化，成功的表达出稳定的人源化ⅩⅦ型胶原蛋白，且工序简单，操作方便。
本发明第三方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的应用，应用于组织工程产品、化妆品、保健品、医疗器械或药物的制备。
优选的，所述化妆品为面霜、精华水、乳液、面膜、头皮精华液、洗发露。
优选的，所述医疗器械为创面敷料类产品。
有益效果
1、本发明中选创造性的取的人17型胶原蛋白螺旋区序列，组合形成A多肽序列和B多肽序列的串联后四次重复的DNA序列，能大量稳定的表达重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，具有较高的细胞粘附活性，促细胞增殖活性，促细胞迁移活性和优异的的促毛囊修复再生的生物学活性；同时，从人17型胶原蛋白的多个螺旋区序列中进行优化筛选，能减少致敏的危险，避免病毒感染。
2、本发明中，选用酿酒酵母，利于纯化，生产工艺成熟、成本较低且无免疫原性。
3、本发明中，通过将重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的基因片段插入pYES2/CT-MFα表达载体，转化酿酒酵母菌株，成功表达出稳定的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，且提高了重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的产量。
4、本发明中合成的ⅩⅦ人源化胶原蛋白比商品化的天然人胶原蛋白更具有优异的细胞粘附活性、细胞迁移活性等生物学活性。
5、本发明首次制备得到了一种新的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，无内毒素、成本交底且无免疫原性，可大批量制备，有效弥补市场空缺，丰富同类胶原产品。
附图说明
图1为实施例1中pYES2/CT-MFα-COL17a1载体图谱；
图2为实施例1～3中酿酒酵母上清中表达C17A、C17B、C17C的SDS-PAGE检测结果图；
图3为实施例1～3中C17A、C17B、C17C和BSA、商品化胶原蛋白的细胞贴壁状态观察图。
图4为实施例1～3中C17A、C17B、C17C和BSA、商品化胶原蛋白促细胞贴壁的效价的柱形图；
图5为实施例1～3中C17A、C17B、C17C和BSA、商品化胶原蛋白促细胞迁移的镜下观察的试验细胞结果图；
图6为实施例1～3中C17A、C17B、C17C和BSA、商品化胶原蛋白促细胞迁移的结果图；
图7为实施例3中C17C(实验组)、对照组(蛋白原液)、米诺地尔组中的小鼠在0天、7天、10天、14天、21天的背部毛发生长情况；从上至下分别为对照组、实验组、米诺地尔组的背部毛发生长情况。
图8为实施例3中C17C(实验组)、对照组(蛋白原液)、米诺地尔组中的小鼠在0天、7天、10天、14天、21天背部皮肤组织切片情况；从上至下分别为对照组、实验组、米诺地尔组的背部皮肤组织切片情况。
具体实施方式
实施例1
本实施例第一方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，为C17A胶原蛋白。
所述C17A胶原蛋白包括(A)8多肽序列，由A多肽序列重复八次形成，包括456个氨基酸；
所述A多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt：Q9UMD9：G567–623G，基础单元多肽序列为SEQ ID No.1。
所述(A)8多肽序列为SEQ ID No.4，理论分子量为43kDa。
所述(A)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.7，根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化，委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
本实施例第二方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1：将合成的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的DNA序列插入pYES2/CT-MFα表达载体，构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达载体；
S2：将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株INVScl(购自Invitrogen，C81000)，构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达菌株；
S3：培养表达菌株，分离纯化重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白。
所述S1中的具体步骤为：使用质粒提试剂盒，按照说明书提取pYES2/CT-MFα空载质粒；使用QuickCut NotⅠ和QuickCut XbaⅠ对目的基因和pYES2/CT-MFα空载质粒进行双酶切酶切，酶切条件为37℃，2h，酶切体系(50μL)为：QuickCut NotⅠ、QuickCut XbaⅠ和10×QuickCut Green Buffer各5μL、pYES2/CT-MFα空载质粒或目的基因35μL。在37℃金属浴中酶切2h。酶切后以1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，并分别切胶回收酶切后的空载质粒和目的基因片段。将回收后的产物通过T4 DNA Ligase连接，连接体系(10μL)为：目的基因5μL、载体片段3μL、T4 DNA ligase和10×Ligase buffer各1μL。将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养，PCR鉴定后送公司进行测序。测序无误即获得新的表达载体pYES2/CT-MFα-COL17a1(C17A)，载体图谱见图1。
所述S2中将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株的具体步骤，包括以下步骤：
M1：将10μL构建成功的表达质粒加入到80μL酿酒酵母INVScl感受态细胞，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰上静置3～7min；
M2：将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，将M1中的电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化；
M3：电击结束后，迅速向电击转化完成的电击杯中加入500μL预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，30℃孵育1h，得到混合溶液；
M4：将混合溶液离心后弃去400μL上清，吹匀后涂布在SC-U固体平板；
M5：将涂布完成的SC-U固体平板倒置于30℃恒温培养，直至长出单克隆菌落；
所述S3中的具体步骤包括：挑取上述的单菌落接种于20mL的SC-U选择培养基，经30℃、220rpm振荡培养过夜；测定其OD600吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100mL的SC-U诱导培养基中，使得初始OD600为0.4继续培养，每24h向培养基中添加半乳糖至终质量浓度为2.0％；诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品，离心收集表达上清；经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。结果见图2。
所述S3中的具体步骤还包括：离心收集诱导了96h后的菌液上清，用0.22μm滤膜过滤后备用；使用Akta蛋白纯化仪，以缓冲液A(20mM NaH2PO4，pH 4.0)平衡阳离子交换介质(千纯生物SP Purose 6Fast Flow填料)至280nm波长处的吸光值和电导率值都保持不变后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6mL/min。监测紫外280nm波长处的吸光值，当其上升时，开始接样。待上样结束后，关闭接样，再以缓冲液A平衡阳离子层析介质，当280nm波长处的吸光值下降时，打开接样，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样。用缓冲液B(20mM NaH2PO4，1M的NaCl，pH 4.0)洗脱，收集洗脱液，透析后(透析液为PBS，pH7.4)即得到重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白原液，即COL17a1(C17A)蛋白原液，经考马斯亮蓝法测得蛋白含量为0.1mg/mL。
本实施例第三方面提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的应用，应用于化妆品的制备。所述的化妆品为头皮精华液。
实施例2
实施例2的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，为C17B胶原蛋白。
所述C17B胶原蛋白包括(B)8多肽序列，由B多肽序列重复八次形成，包括360个氨基酸。
所述B多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt：Q9UMD9：G1438–1482V，基础单元多肽序列为SEQ ID No.2。
所述(B)8多肽序列为SEQ ID No.5，理论分子量为34.5kDa。
所述(B)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.8，根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化，委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
本实施例提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的应用，应用于化妆品的制备。所述的化妆品为洗发露。
实施例3
实施例3的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，为C17C胶原蛋白。
所述C17C胶原蛋白包括(AB)4多肽序列，由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联重复四次形成，包括408个氨基酸。
所述A多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt：Q9UMD9：G567–623G，基础单元多肽序列为SEQ ID No.1。
所述B多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt：Q9UMD9：G1438–1482V，基础单元多肽序列为SEQ ID No.2。
所述AB多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.3。
所述(AB)4多肽序列为SEQ ID No.6，理论分子量为39kDa。
所述(AB)4多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.9，根据酿酒酵母宿主密码子偏爱性进行优化，委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因片段合成。
本实施例提供了一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的应用，应用于医疗器械的制备。所述的医疗器械为创面敷料。
实施例中序列见表1。
表1
重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白效果测试结果
1、重组胶原蛋白细胞粘附活性检测
1.1试验材料
完全细胞培养液：量取胎牛血清10mL，双抗1mL，加入DMEM培养液90mL，4℃保存。
无血清培养基：量取双抗1mL，加入1640培养液99mL，4℃保存。
消化液：0.25％胰蛋白酶。
PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000mL，经121℃、15分钟高压灭菌。
Balb/c 3T3细胞在完全细胞培养液中呈单层、贴壁生长，每4～5天传代一次，1︰2消化传代，于完全培养液中生长繁殖。
样品：实施例1～3中制备得到的C17A、C17B和C17C原液，BSA(牛血清白蛋白，购自Solarbio，A8020)，商品化胶原蛋白(即ⅩⅦ型胶原对照，购自Sigma，C7661)。
1.2试验操作
1.2.1样品稀释及孵育
将C17A、C17B和C17C原液分别用PBS预稀释至0.5μg/mL，预稀释完成后在96孔板中进行2倍梯度稀释，共做10个稀释度，每孔50μL不同稀释度的样本，并设立阴性对照，加入50μL PBS作为对照，4℃过夜孵育。
1.2.2促细胞贴壁试验
孵育完成后弃去板中液体，每孔加入100μL 30g/L BSA封闭，置于37℃温箱孵育1h，取出弃去板中液体，加入3T3细胞悬液(用无血清培养基重悬)，细胞接种密度为1.0×105个/mL，每孔接种100μL，温箱孵育5h。
1.3试验结果
将孵育完成的细胞板用PBS洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况，结果见图3；选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果使用四参数拟合曲线得出效价。结果见表2、图4。
表2
2.促细胞迁移试验
2.1试验原理
当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过比较图像以确定细胞迁移速率。
2.2试验步骤
2.2.1先用marker笔在6孔板背后，用直尺对齐，均匀得划横线，每隔0.5cm一道，横穿过孔。
2.2.2向6孔板孔中加入浓度为5×105个/mL的3T3细胞悬液2mL。
2.2.3第二天观察到6孔板内细胞均长满单层，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道。
2.2.4用PBS洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞。
2.2.5根据分组往孔中加入1.8mL无血清培养液，之后分别加入200μL的实施例1～3中制备得到的C17A、C17B和C17C原液，BSA，商品化胶原蛋白(即ⅩⅦ型胶原对照，购自Sigma，C7661)，细胞对照孔加入等量的PBS溶液。
2.2.6放入37度5％ CO2培养箱，培养。0时拍照，记录每孔内拍照位置。后续观察时对固定位置进行观察、拍照。
2.3试验结果
根据拍摄的照片，计算细胞的迁移率，结果见表3，图5，图6。
表3
3.促细胞生长活性测定
3.1包括以下步骤：
(1)将小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/c 3T3细胞)用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1mL含1.0×105～5.0×105个细胞，传代后24-36h用于生物学活性测定；
(2)弃去步骤(1)培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1mL含5.0×104～8.0×104个细胞的细胞悬液，接种于96孔板中，接种过程中不停摇匀，保持每孔接种数相同，每孔100μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养；
(3)步骤(2)中完全培养液培养24h后，换成维持培养液，置37℃、5％二氧化碳培养24h；
(4)待步骤(3)培养24h后，将制备的细胞培养板弃去维持液，分别加入实施例1～3中制备得到的C17A、C17B和C17C原液，BSA，商品化胶原蛋白(即ⅩⅦ型胶原对照，购自Sigma，C7661)，每孔100μL，置37℃、5％二氧化碳培养64h；
(5)采用MTT比色法检测结果：每孔加入MTT溶液20μL，于37℃、5％二氧化碳培养5h。
以上操作均在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100μL，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，记录测定结果。
3.2试验结果
采用MTT法检测不同蛋白组对Balb/c 3T3细胞的促细胞生长效果，结果见下表4。
表4
4、小鼠毛发生长实验
4.1实验目的
在本实验中，通过创建小鼠雄性脱发模型，使用含有蛋白的水溶液，观察各组小鼠毛发的生长情况。
4.2试验材料与方法
4.2.1实验动物
选择健康的成年黑色雌性C57BL/6小鼠24只，按照清洁级环境饲养，给予充分饲料和水自由喂养，每天喂料喂水，检查动物生理活动情况。
4.2.2试验试剂
蛋白原液(由芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司生产制备，蛋白含量为1mg/瓶)，实施例3中制备得到的C17C原液；米诺地尔酊2％(购自山西振东安欣生物制药有限公司)，脱毛膏(购自利洁时家化(中国)有限公司)；10％福尔马林(购自南昌雨露实验器材有限公司)。
4.2.3试验仪器
荧光显微镜(迈时迪(东莞)科技有限公司，型号MSD530)
4.3实验方法
4.3.1试验分组
将24只C57BL/6雌性小鼠(5周龄)随机分为3组，每组8只小鼠，分别为实验组(实施例3中制备得到的C17C原液)，对照组(蛋白原液)，米诺地尔组。
4.3.2建立小鼠模型及干预方案
在试验前将脱毛膏大面积涂于小鼠背部，15min后，擦去脱毛膏，从而达到拔毛的效果。实验组涂抹蛋白原液，对照组涂抹蒸馏水，米诺地尔组涂抹2％米诺地尔酊。每日定时给药1次，连续给药21天。
4.3.3毛发生长的观察
实验组分别在第0d、7d、10d、14d、21d观察小鼠毛发的生长情况，每日在固定光源下拍照。
4.3.4组织学检查
分别在第0d、7d、10d、14d、21d处死1只小鼠，取背部皮肤切取皮肤表本，进行组织学观察。10％福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色,光学显微镜下观察毛囊的周期性变化。
4.4实验结果
通过毛发生长观察结果图7及组织切片观察结果图8，可以得出蛋白原液可促进小鼠静止期毛囊提前进入生长期，促进毛发生长的结论。

Claims (10)

1.一种重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，其特征在于，包括C17A或C17B或C17C；所述C17A包括(A)n多肽序列，由A多肽序列重复n次形成；C17B包括(B)n多肽序列，由B多肽序列重复n次形成；C17C包括(AB)n多肽序列，由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联重复n次形成；其中n为4～8的整数；所述A多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.1；所述B多肽序列的基础单元多肽序列为SEQ ID No.2。
2.根据权利要求1所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，其特征在于，所述C17A包括(A)8多肽序列，由A多肽序列重复八次形成，包括456个氨基酸；所述C17B包括(B)8多肽序列，由B多肽序列重复八次形成，包括360个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，其特征在于，所述C17C包括(AB)4多肽序列，由A多肽序列和B多肽序列通过肽键串联重复四次形成，包括408个氨基酸。
4.根据权利要求1所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，其特征在于，所述A多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt：Q9UMD9：G567–623G。
5.根据权利要求1所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，其特征在于，所述B多肽序列的DNA序列位于人源序列UniProt：Q9UMD9：G1438–1482V。
6.根据权利要求2所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白，其特征在于，所述(A)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.7；所述(B)8多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.8；所述(AB)4多肽序列的DNA序列为SEQ ID No.9。
7.一种根据权利要求1～6任一项所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将合成的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的DNA序列插入pYES2/CT-MFα表达载体，构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达载体；
S2：将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株INVScl，构建重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的表达菌株；
S3：培养表达菌株，分离纯化重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白。
8.根据权利要求7所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S2中将构建成功的表达载体转入酿酒酵母菌株的具体步骤，包括以下步骤：
M1：将构建成功的表达质粒加入到酿酒酵母INVScl感受态细胞，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰上静置3～7min；
M2：将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，将M1中的电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化；
M3：电击结束后，迅速向电击转化完成的电击杯中加入预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，孵育，得到混合溶液；
M4：将混合溶液离心后弃去400-500μL上清，吹匀后涂布在SC-U固体平板；
M5：将涂布完成的SC-U固体平板倒置于28～32℃恒温培养，直至长出单克隆菌落。
9.根据权利要求7所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S3中的具体步骤包括：挑取单菌落接种于SC-U选择培养基，振荡培养过夜；测定其OD600吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于SC-U诱导培养基中，使得初始OD600＝0.4±0.1继续培养，每24h向培养基中添加半乳糖至终质量浓度为2.0％；诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品，离心收集表达上清；经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
10.一种根据权利要求1～6任一项所述的重组ⅩⅦ人源化胶原蛋白的应用，其特征在于，应用于组织工程产品、化妆品、保健品、医疗器械或药物的制备；所述化妆品为面霜、精华水、乳液、面膜、头皮精华液、洗发露；所述医疗器械为创面敷料类产品。
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