CN116003635A

CN116003635A - 一种长效纤连蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116003635A
Application number: CN202211719255.4A
Authority: CN
Inventors: 赵俊; 周炜; 李增; 刘家炉
Original assignee: Wuhu Yingtefeier Biological Products Industry Research Institute Co ltd
Current assignee: Wuhu Yingtefeier Biological Products Industry Research Institute Co ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明公开了一种长效纤连蛋白及其制备方法和应用，所述长效纤连蛋白通过串联重复的FNIII1C氨基酸序列得到，所述纤连蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示，本发明通过对FNIII1C的目的基因序列进行重复串联表达呈现了更多正向结合位点，提高了蛋白的生物学活性和分子量，使其更为长效，并通过PEG定点修饰大大降低了纤连蛋白的免疫原性，其可在护肤品或化妆品中的应用，本发明提供的长效纤连蛋白或PEG定点修饰的长效纤连蛋白作为护肤品或化妆品的原料具有淡斑、修复皮肤屏障损伤的作用。

Description

一种长效纤连蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种长效纤连蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

天然纤连蛋白(fibronectin,FN)是一种高分子量的糖蛋白，是胞外基质中最为主要的组分之一，广泛存在于血液、体液及各种组织中。在脊椎动物中，FN高度保守且具有相同的组织结构。FN以二聚体形式存在，由两条分子量约为250kDa的多肽链通过C端的二硫键结合组成。每条链包含一连串的重复单元：12个I型、2个II型和7个III型重复单元。这些重复单元组成与纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、细菌和细胞结合的功能域以发挥多种生物学功能，如调理作用、吞噬作用、血管生成、胚胎形成、组织结构和重新塑造等，还在许多病理过程起重要作用，如多发性关节炎和肿瘤。目前FN已经用于新兴生物医学领域，如肿瘤、创伤愈合、抑菌及组织工程材料等，也开始应用于美容护肤领域。

目前FN的获得主要通过两条途径：一是从生物的组织细胞或体液中提取；二是运用基因工程技术构建表达载体，利用宿主表达重组FN。天然提纯FN工艺复杂、成本高，且产品分子量大使其推广应用受到了限制。而利用基因工程技术表达外源基因已成为获取目的蛋白的高效途径之一，由于天然FN分子量大，全序列表达可行性低，现有的方法主要是选取FN不同功能的结构域进行表达或组合表达，以获得具有不同功能的重组FN，但是选取某段结构域表达相较天然蛋白结合位点减少，对蛋白的生物学活性存在一定影响。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种长效纤连蛋白及其制备方法和应用。本发明通过对FNIII1C的目的基因序列进行重复串联表达呈现了更多正向结合位点，提高了蛋白的生物学活性和分子量，使其更为长效，并通过PEG定点修饰大大降低了纤连蛋白的免疫原性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明提供了一种长效纤连蛋白，通过串联重复的FNIII1C氨基酸序列得到，所述纤连蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

本发明还提供了一种编码所述长效重组弹性蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

本发明还提供了含有所述的基因的表达载体。

进一步地，所述表达载体为酿酒酵母。

本发明还提供了一种PEG定点修饰的长效纤连蛋白，通过对本发明所述的纤连蛋白进行PEG定点修饰得到

所述PEG定点修饰的长效纤连蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)向长效纤连蛋白的MES缓冲液中加入EDC和胱胺，于4℃反应3小时；

(2)然后向步骤1)中加入TCEP进行还原反应，4℃反应2小时；

(3)最后加入甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺，4℃反应20小时；

(4)所得反应液纯化。

进一步地，所述甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的分子量范围为8-12KD。

所述纤连蛋白、EDC、胱胺的摩尔比为1：2：2；所述纤连蛋白、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比为1：4。

本发明还提供了所述长效纤连蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)根据pYES2/CT-MFα载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计FNIII1C基因序列，设计出的FNIII1C基因序列如Seq ID NO.1所示；

2)根据FNIII1C基因序列设计扩增引物，进行PCR扩增，然后构建重组载体；

3)将重组载体加入到酿酒酵母INVScl感受态细胞中，进行电击转化，获得工程菌；

4)对工程菌进行诱导表达；

5)将诱导表达后的上清液经微孔滤膜过滤后，经镍离子螯合亲和层析柱纯化，即可得到纤连蛋白，其氨基酸序列如Seq ID NO.2所示；

6)将步骤5)得到的纤连蛋白进行PEG定点修饰，即可得到所述长效纤连蛋白。

步骤4)中，诱导时间为20h，至初始OD_600nm达到0.4。

步骤6)具体包括以下步骤：

本发明最后还提供了所述长效纤连蛋白或所述PEG定点修饰的长效纤连蛋白在护肤品或化妆品中的应用。所述长效纤连蛋白或所述PEG定点修饰的长效纤连蛋白作为护肤品或化妆品的原料具有淡斑、修复皮肤屏障损伤的作用。

本发明提供的长效纤连蛋白，通过串联重复的FNIII1C氨基酸序列得到，它们由三段重复的序列组成，呈现了更多的正向结合位点，有利于提高纤连蛋白的生物学活性；同时通过重复串联表达提高纤连蛋白的分子量，使纤连蛋白更为长效。本发明利用酿酒酵母分泌表达系统，将纤连蛋白通过基因重组分泌表达，酿酒酵母在医药和食品工业中是公认的安全微生物体，其为真核表达系统，能够高水平表达蛋白质分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性；

本发明提供的PEG定点修饰的长效纤连蛋白(PEG-rFN)，通过PEG定点修饰长效纤连蛋白显著改善纤连蛋白的半衰期，有效的提高了重组蛋白的稳定性。

PEG修饰又分为随机修饰和定点修饰，目前FDA批准的已经上市的PEG化新药多数为随机修饰的产物，随机修饰蛋白质多以赖氨酸的ε-NH2或α-NH2为修饰目标，由于赖氨酸在蛋白质内通常数量较多，这种修饰引起蛋白质中多个赖氨酸被修饰，得到的产物是聚乙二醇化修饰异构体的混合物。本发明选择修饰纤连蛋白C端羧基的修饰方法对融合蛋白FNIII1C进行PEG修饰，是在随机修饰的基础上发展起来的第二代PEG修饰技术，通过对修饰方式、PEG修饰剂的选择和反应条件的优化选择，实现定点修饰，这种修饰所得的产物为均一产物，异构体少，活性保留较好，免疫原性大大降低。

体外试验证明本发明提供的PEG-rFN能显著促进细胞黏附及迁徙。动物临床试验数据可知，在基础治疗方案前提下，使用PEG-rFN可促进创面愈合并减少瘢痕形成。使用PEG-rFN配制的化妆品在人体皮肤上的功效学评价结果显示，对面部皮肤屏障损伤具有修复作用，并且由于FN属于生物蛋白，具有易分解无残留的优点，相比普通化工品类化妆品和激素类药物具有无副作用的巨大优势。

附图说明

图1为pYES2/CT-MFα载体图谱；

图2为质粒pUC57-FNIII1C的酶切结果，M：DL2000 DNA Marker；1-2：pUC57-FNIII1C质粒双酶切；3，阴性对照；

图3为pYES2/CT-MFα-FNIII1C载体的菌液PCR鉴定结果，M：DL2000 DNA Marker；1-4：菌液PCR结果；

图4为INVSc1/pYES2/CT-MFα-FNIII1C诱导表达的上清液的PCR鉴定结果，M：Marker；1：诱导上清；2：质粒空载诱导上清；

图5为PEG定点修饰长效rFN并纯化后的PCR鉴定结果，M：Marker；1：纯化后PEG-rFN；

图6为PEG-rFN(a)、rhFN(b)、阴性对照(c)的促细胞贴壁结果；

图7为rhFN(a)、PEG-rFN(b的促细胞贴壁结果计算数据的拟合结果；

图8为细胞划痕实验18h结果图；

图9为实验组家兔术后第10天创面愈合情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种长效纤连蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)根据pYES2/CT-MFα载体的性质(如图1所示)和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计FNIII1C基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，具体为：

TCAGATAAAATTATCCATCTTACAGATGATTCATTTGACACGGACGTACTAAAAAACGCCCCCCAGCCCAGCCACATCAGCAAGTAC ATCCTGAGGTGGAGGCCCAAGAACAGCGTGGGCAGGTGGAAGGAGGCCACCATCCCCGGCCACCTGAACAGCTACA CCATCAAGGGCCTGAAGCCCGGCGTGGTGTACGAGGGCCAGCTGATCAGCATCCAGCAGTACGGCCACCAGGAGGT GACCAGGTTCGACTTCACCACCACCAGCACCAGCACCCCC

AACGCCCCCCAGCCCAGCCACATCAGCAAGTACATCCTGAGGTGGAGGCCCAAGAA CAGCGTGGGCAGGTGGAAGGAGGCCACCATCCCCGGCCACCTGAACAGCTACACCATCAAGGGCCTGAAGCCCGGC GTGGTGTACGAGGGCCAGCTGATCAGCATCCAGCAGTACGGCCACCAGGAGGTGACCAGGTTCGACTTCACCACCA CCAGCACCAGCACCCCCCACCATCATCATCACCAC。

上述基因所编码的FNIII1C蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示，具体为：

RRRSDKIIHLTDDSFDTDVLKNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSTP

NAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEG QLISIQQYGH QEVTRFDFTT TSTSTPHHHHHH；

其中，

NAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSTP为重复的FNIII1C氨基酸序列，即目的基因氨基酸序列。

2)将优化后FNIII1C蛋白基因序列发送通用生物公司进行人工合成pUC57-FNIII1C，同时合成检测引物：

T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，如Seq ID NO.3所示；

CYC1 Terminator：5′-GTGACATAACTAATTACATGATG-3′，Seq ID NO.4所示。

3)提取DH5α/pYES2/CT-Mfα质粒

将质粒pYES2/CT-Mfα和人工合成pUC57-FNIII1C质粒分别用Not I和Xba I进行双酶切。酶切体系(50μl)：QuickCut HindⅢ、QuickCut EcoR I和10×QuickCut GreenBuffer各5μL、pYES2或PCR产物35μL。在37℃金属浴中酶切3h。酶切后以1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，如图2所示，并胶回收双酶切的PCR产物和质粒。

将双酶切回收的目的基因产物与pYES2/CT-MFα质粒用T4 DNA连接酶在16℃中连接1-5h。连接体系(10μl)：目的基因5μl、载体片段3μl、T4 DNA ligase和10×ligasebuffer各1μl。将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养，菌液PCR鉴定结果如图3所示，PCR鉴定后送公司进行测序，测序结果无误，则pYES2/CT-MFα-FNIII1C载体构建成功。

4)pYES2/CT-MFα-FNIII1C电转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞

将10μl pYES2/CT-MFα-FNIII1C质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中。冰浴5min，擦干电击杯外壁。将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击。迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U固体平板。30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。挑取转化子接种到SC-U液体培养基中，30℃、200rpm恒温培养。以菌液为模板进行PCR反应，鉴定筛选阳性克隆。选取鉴定无误的转化子进行下一步试验，由此获得工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-FNIII1C。

5)INVSc1/pYES2/CT-MFα-FNIII1C工程菌的诱导表达

挑取INVSc1/pYES2/CT-MFα-FNIII1C单菌落接种于20ml SC-U选择培养基，经30℃、220rpm振荡培养过夜。测定其OD_600nm吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD_600nm达到0.4，诱导时间为20h。

INVSc1/pYES2/CT-MFα-FNIII1C诱导表达的上清液经SDS-PAGE电泳可观察到28kDa左右的特异性条带，而含有pYES2/CT-MFα空载质粒的酿酒酵母菌株的诱导表达上清液则无特异性条带，如图4所示。

6)rFN纯化

离心收集培养液上清，用0.22μm滤膜过滤用以上样。使用GE Healthcare公司Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni²⁺螯合亲和层析柱，再用PBS平衡2-3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6ml/min。再用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD_280nm稳定。再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，梯度洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到长效纤连(长效rFN)蛋白原液。

实施例2

一种PEG定点修饰的长效纤连蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将实施例1制备得到的蛋白原液加入到0.05mo1/L pH 5.5的MES缓冲液中，然后加入蛋白原液2倍浓度的EDC和胱胺于4℃反应3小时，其中EDC和胱胺的摩尔比为1:1；

(2)接着加入50mM/L的TCEP进行还原反应，TCEP与胱胺摩尔比1:1，4℃反应2小时；

(3)最后将分子量为10kD的mPEG2-MAL加入到反应体系中，mPEG2-MAL与rFN蛋白(以蛋白含量计)的摩尔比为4:1，于4℃反应20小时。即在纤连蛋白的C-末端羧基上定点修饰上了mPEG；

(4)采用DEAE Sepharose FF层析介质分离步骤(3)中的修饰产物。修饰反应液用pH 6.5、10mmol/L磷酸盐缓冲液稀释5倍后上样，平衡液同样为磷酸盐缓冲液，0.1-0.3mol/L NaCl线性梯度洗脱5CV，流速为5.0ml/min，检测波长为280nm。收集洗脱峰，超滤脱盐浓缩后获得修饰后的PEG-rFN蛋白。采用SDS-PAGE检测样品纯度，检测结果见图5。修饰反应中所用PEG修饰剂的分子量为10kD，长效rFN蛋白分子量为28kD，则由此可以推断新出现的约38kD的条带即为PEG化长效重组人纤连蛋白，且是一个重组纤连蛋白分子连接一条PEG链，说明mPEG仅修饰在了纤连蛋白的C-末端羧基上。

实施例3

长效纤连蛋白的药代动力学研究

1)试验样品

(1)rhFN：重组纤连蛋白溶液，参照申请人的CN114557908A专利中方法生产；

(2)长效rFN：实施例1制备；

(3)PEG-rFN：实施例2制备。

2)试验结果

使用家兔给予肌肉注射相同剂量rhFN、长效rFN和PEG-rFN，进行药代动力学研究。实验结果发现三种重组纤连蛋白肌肉注射药动学特征均符合一室开放模型，呈一级动力学消除，结果如表1。结果显示，实施例1中目的基因序列重复串联表达后，重组纤连蛋白半衰期延长，实施例2中长效rFN经过PEG修饰后，半衰期继续显著延长。

表1三种重组纤连蛋白药代动力学结果

实施例4

长效纤连蛋白的稳定性试验

异源表达后获得长效重组纤连蛋白，但长效重组弹性蛋白热稳定性差的弊端，在使用和产品推广中受到阻碍，因此通过PEG修饰改造长效rFN，增强热稳定性，并且生物活性不受影响。

将实施例2得到的PEG-rFN和实施例1得到的长效rFN用20mM PBS均稀释至1mg/ml，分装至5ml西林瓶中，每瓶2ml，将其放置55℃恒温恒湿培养箱中进行加速破坏试验，分别放置第4h、8h、12h、24h、3d、5d、15d和30d取出样品，检测其促MDBK细胞粘附活性，检测方法见实施例5。

结果：如表2所示，在55℃加速破坏试验中，非长效的rhFN在2h以内活性基本降解，未经PEG修饰的长效rFN，加热第4h，促细胞粘附活性降低超过30倍，加热第8h，促细胞粘附活性消失；而PEG-rFN在55℃加热30天，促细胞粘附活性下降低于20％，这说明PEG定点修饰长效rFN比未修饰长效rFN生物学活性更高。

表2PEG定点修饰长效rhFN热稳定性试验结果(单位：U/mg)

实施例5

长效纤连蛋白的促细胞贴壁的作用效果试验

1)实验原理

纤连蛋白(Fibronectin，FN)重要作用是促进细胞的黏连和粘附，可提高细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强及蛋白质合成速度显著提高。而细胞的黏连和粘附是细胞修复、细胞生长完成的必要条件，因此纤连蛋白具有促细胞修复的功效。本实验通过促牛肾细胞(MDBK细胞)的粘附(贴壁)试验，统计不同FN浓度下各孔内细胞数，经四参数拟合得出纤连蛋白的促黏附活性效价。

2)试验材料

2.1主要仪器超净工作台、细胞培养箱。

2.2试剂配制

完全细胞培养液：量取胎牛血清10ml，双抗1ml，加入DMEM培养液90ml，4℃保存。

无血清培养基：量取双抗1ml，加入1640培养液99ml，4℃保存。

消化液：0.25％胰蛋白酶。

PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌。

2.3细胞

MDBK细胞在完全细胞培养液中呈单层、贴壁生长，每4～5天传代一次，1︰2消化传代，于完全培养液中生长繁殖。

2.4供试品：实施例2制备的PEG-rFN。

2.5阳性对照：重组纤连蛋白溶液(rhFN)，参照申请人的CN114557908A专利中方法生产。

2.6阴性对照：PBS。

3)试验操作

3.1样品稀释及孵育

将PEG-rFN用PBS预稀释至0.5μg/ml，预稀释完成后在96孔板中进行2倍梯度稀释，共做10个稀释度，每孔50μl不同稀释度的PEG-rFN样本，设置梯度稀释的阳性对照孔以及阴性对照(不加PEG-rFN)，加入50μl PBS作为对照，4℃过夜孵育。

3.2促细胞粘附试验

孵育完成后弃去板中液体，每孔加入100μl 30g/L BSA封闭，置于37℃温箱孵育1h；取出弃去板中液体，加入MDBK细胞悬液(用无血清培养基重悬)，细胞接种密度为1.0×10⁵个/ml，每孔接种100μl，温箱孵育5h。

3.3结果观察及计算

将孵育完成的细胞板用PBS洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况，如图6所示，选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果使用四参数拟合曲线得出效价。

结果计算举例如下，拟合结果如图7所示：

表3孔板内各孔五点细胞数

样品种类	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											rhFN	1060	1060	1020	810	650	470	260	190	170	180
PEG-rFN	1080	1060	1050	1040	920	720	360	260	200	180

表4效价统计结果

样品种类	蛋白浓度(mg/ml)	工作效价(U/ml)	比活性(U/mg)
				rhFN	0.239	36.91	154.44
PEG-rFN	0.128	74.02	578.28

根据图6及表4结果显示，PEG-rFN促细胞黏附(贴壁)的比活性显著高于rhFN。

实施例6

长效纤连蛋白的细胞划痕实验

1)实验原理

当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过比较图像以确定细胞迁移速率。

2)实验材料

2.1主要仪器超净工作台、细胞培养箱。

2.2MDBK细胞；无血清细胞培养液

2.3样品：实施例2制备的PEG-rFN。

2.4阳性对照：重组纤连蛋白溶液(rhFN)，参照申请人的CN114557908A专利中方法生产，批号2021003。

3)实验步骤

3.1先用marker笔在6孔板背后，用直尺对齐，均匀得划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。

3.2向6孔板孔中加入浓度为5×10⁵个/ml的MDBK细胞悬液2ml。

3.3第二天观察到6孔板内细胞均长满单层，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道。

3.4用PBS洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞。

3.5根据分组往孔中加入1.8ml无血清培养液，之后分别加入200μl的PEG-rFN和阳性对照rhFN，细胞对照孔加入等量的PBS溶液。

3.6放入37度5％ CO₂培养箱，培养。0时拍照，记录每孔内拍照位置。后续观察时对固定位置进行观察、拍照。

4)实验结果

细胞对照孔与样品孔0h与18h观察结果如图8所示(图中箭头表示划痕距离)。

图8及表5结果表明，PBS对照孔内细胞加样后18h细胞状态正常，且划痕区域缩小，缩小比例为40.34％；rhFN阳性对照加样后18h同样细胞状态正常，且划痕区域缩小，缩小比例为62.67％；PEG-rFN样品加样后18h细胞状态正常，且划痕区域缩小，缩小比例为82.89％，缩小比例明显高于PBS对照组和rhFN阳性对照组。

表5细胞迁移速率结果

样品	0h划痕距离	18h划痕距离	细胞迁移速率
				PEG-rFN	1217.35	208.31	82.89％
rhFN	1059.63	395.56	62.67％
				PBS	710.55	423.91	40.34％

实施例7

PEG定点修饰的长效纤连蛋白的家兔创面修复实验

使用实验家兔，在其背部制造皮肤破损模型后，使用PEG-rFN蛋白进行涂抹，从而验证PEG-rFN对创面的修复功能。

1)实验材料

1.1实验动物普通级新西兰兔6只，3-4月龄，2.0～2.5kg，购自安徽医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(皖)2011-007。

1.2样品PEG-rFN，使用量0.1mg/kg，每3日使用1次

2)实验方法

2.1皮肤破损模型建立

为验证PEG-rFN对创面愈合的促进作用，需建立皮肤破损模型，参考2014年5月13日颁布的《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》附录“3.皮肤刺激性实验”中对皮肤破损程度的描述，即“破损皮肤试验中皮肤破损程度以损伤表皮层为限”，故本实验中选择使用砂纸打磨法。

家兔乙醚麻醉后，使用宠物电推剪先将背部毛尽量剔除干净。将6只家兔分为2组，每组2只，将砂纸包裹在木棒上，然后在家兔皮肤表面轻轻摩擦，直至皮肤表面变为浅红，从而建立家兔背部皮肤破损模型。

2.2治疗

两组家兔分为实验组和对照组，分别使用样品和生理盐水涂抹创伤表面，其中生理盐水用量为2ml/只。每3日消毒清洁创面后涂抹相应药品，再使用无菌纱布覆盖包扎。每日观察创面愈合情况。

3)实验结果

实验组动物在10天时创面已全部愈合，如图9所示，平均愈合天数为9.7天，参见表4，愈合过程未见创面感染及水肿，愈合初期伴有轻微红肿，愈合后创伤部位无明显瘢痕形成。对照组动物在10天时仍有2只动物未全部愈合，愈合过程为未见创面感染，愈合初期伴有较明显红肿及轻微水肿，后期局部创面出现结痂及明显瘢痕。

表6创面平均愈合时间表

实施例8

PEG定点修饰的长效纤连蛋白的人体皮肤功效学评价

1)通过委托第三方实验室对实施例2中制备的PEG-rFN产品配制的化妆品进行检测，斑贴试验显示实施例2中制备的PEG-rFN产品无任何皮肤不良反应。

1.1斑试方法：选用合格的斑试器，以封闭式斑贴试验方法，将样品0.020～0.025ml涂于斑试器内，24小时后去除受试物，分别于去除后0.5、24、48小时观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)中皮肤反应分级标准记录其结果，如表7所示。

表7皮肤封闭斑贴试验皮肤反应分级标准

1.2试验结果

表8化妆品人体皮肤斑贴试验结果

2)在人体皮肤上进行功效评价，实施例2制备的PEG-rFN产品配制的化妆品对于脸部皮肤屏障损伤具有修复作用。

2.1测试目的

亚洲成年受试者再正常情况下连续28天使用测试样品(含有PEG-rFN成分)，通过仪器探头测量皮肤角质层水分含量和皮肤经表皮水分流失TEWL值，评估测试样品的保湿和修护功效。

2.2测试结果

表9

2.3测试结论

33名年龄24至54岁的亚洲成年受试者，在正常情况下连续28天使用测试样品(含有PEG-rFN成分)，通过仪器探头测量皮肤角质层水分含量和皮肤经表皮水分流失TEWL值，结果显示该测试样品在使用样品28天后具有保湿和修护的功效。

上述参照实施例对一种长效纤连蛋白及其制备方法和应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种长效纤连蛋白，其特征在于，通过串联重复的FNIII1C氨基酸序列得到，所述长效纤连蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

2.编码如权利要求1所述的长效重组弹性蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

3.含有如权利要求2所述的基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为酿酒酵母。

5.一种PEG定点修饰的长效纤连蛋白，其特征在于，通过对权利要求1所述的纤连蛋白进行PEG定点修饰得到。

6.如权利要求1所述的长效纤连蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

4)对工程菌进行诱导表达；

5)将诱导表达后的上清液经微孔滤膜过滤后，经镍离子螯合亲和层析柱纯化，即可得到长效纤连蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，诱导时间为20h，至初始OD_600nm达到0.4。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述长效纤连蛋白的分子量为28kD。

9.如权利要求1所述的长效纤连蛋白或如权利要求5所述的PEG定点修饰的长效纤连蛋白在护肤品或化妆品中的应用。