CN117886954A

CN117886954A - 一种elp-fgf21融合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117886954A
Application number: CN202410074085.1A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 叶贤龙; 熊凤敏; 于伟
Original assignee: Ganjiang Traditional Chinese Medicine Innovation Center
Current assignee: Ganjiang Traditional Chinese Medicine Innovation Center
Priority date: 2024-01-18
Filing date: 2024-01-18
Publication date: 2024-04-16

Abstract

本发明公开了一种ELP‑FGF21融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物制药、医疗器械领域，其序列组成为A‑B‑C结构，其中，A为类弹性蛋白，B为Linker，C为成纤维细胞生长因子21序列；可通过原核细胞表达，利用盐析沉淀或色谱纯化的方式，获得高纯度、高活性的FGF21融合蛋白。该蛋白能够有效提高小鼠胚胎成纤维细胞NIH‑3T3及人角质细胞HaCaT的迁移能力，促进小鼠的创面愈合水平，可应用于促进创伤愈合的药物或功能敷料的开发制备。本发明的ELP‑FGF21融合蛋白安全性好、促创伤愈合能力佳、纯化工艺简便、成本低。

Description

一种ELP-FGF21融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制药、医疗器械领域，具体涉及一种ELP-FGF21融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤创伤愈合是一个复杂的过程，其基本过程主要可以分为以下三个阶段：炎症、再上皮和组织重塑阶段。创伤愈合过程中涉及血小板、炎症细胞、上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞及多种活性分子与细胞间的相互作用，其中角质细胞及成纤维细胞的增殖、迁移能力在愈合过程扮演着十分重要的角色。细胞创伤愈合实验是常用的体外细胞迁移能力评价方法，通过在单层细胞上有意制造的模拟伤痕，边缘的细胞会逐渐进入该划痕区域，使“伤痕”愈合，用以模拟体外伤口愈合过程，广泛用于观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。

成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21，FGF21)是成纤维细胞生长因子家族中的成员，属于一种内分泌因子，在糖脂代谢、胰岛素敏感性和肥胖相关疾病治疗中起着关键作用。不仅如此，有研究表明在创伤愈合过程中，FGF21可以作用于角质细胞并促进细胞迁移，从而最终促进伤口的愈合。因此FGF21有潜力应用于创伤修复相关药物的开发。

类弹性蛋白(Elastin-like protein，ELP)作为一种序列高度重复的、仿照天然弹性蛋白氨基酸序列、人工设计合成的蛋白质，具有良好的生物相容性和温度敏感特性，以上特性使得ELP可作为蛋白质纯化标签、药物载体微粒实现药物靶向给药及药物储库的作用，或应用于组织工程领域。有研究指出ELP融合功能蛋白可以增加功能蛋白体内外稳定性、增强其体内外活性，表明蛋白融合ELP标签的形式可以获得更佳的疾病治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种ELP-FGF21融合蛋白及其制备方法和应用。

本发明的技术解决方案如下：

一种ELP-FGF21融合蛋白，其序列组成为A-B-C结构，其中，A为类弹性蛋白，B为Linker，C为成纤维细胞生长因子21序列；

所述类弹性蛋白的序列为A1-A4任一所示蛋白质：

A1为SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

A2为(VPGVG)*n，其中n＝20、40或60；

A3为：将(A1)氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A4与A1-A3中任一所限定的氨基酸序列具有≥90％同源性且具有相同功能的蛋白质，优选的95％以上、99％以上。

进一步地，所述Linker的序列为：(GGGGS)n，其中n＝0-5，n为整数。

进一步地，所述成纤维细胞生长因子21序列为C1-C3任一所示蛋白质：

C1为SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

C2为将C1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

C3与C1-C2中任一所限定的氨基酸序列具有≥90％同源性且具有相同功能的蛋白质，优选的95％以上、99％以上。

本发明还公开了一种如上任一所述ELP-FGF21融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

S1：将蛋白质A-B-C的编码序列克隆入原核表达载体，然后诱导表达所述ELP-FGF21融合蛋白；

S2：收集表达所述ELP-FGF21融合蛋白的菌体，进行盐析沉淀或/和色谱纯化，得到所述融合蛋白。

优选地，所述盐析沉的实现方式如下：1)取表达所述融合蛋白的菌体，超声破碎后分离上清及沉淀，向上清中加入一定浓度的硫酸铵，于一定温度充分相变沉淀；2)相变结束后离心分离上清和沉淀，将沉淀以合适的缓冲液充分复溶；3)向复溶上清中再次加入一定浓度的硫酸铵，进行第二次盐析沉淀；4)离心分离上清和沉淀，将沉淀复溶，得到ELP-FGF21融合蛋白。

所述色谱纯化的实现方式如下：1)取表达所述融合蛋白的菌体，超声破碎后分离上清及沉淀，上清使用AKTA pure仪器上样至预先平衡的镍柱，并充结合在层析柱上，使用含高浓度咪唑的缓冲液进行线性梯度洗脱，收集馏分；2)将上述馏分使用AKTA pure仪器上样至预先平衡好的阴离子交换柱，并充分结合在层析柱上，使用高盐缓冲液进行线性梯度洗脱，收集馏分，获得ELP-FGF21融合蛋白。

所述盐析沉淀和色谱纯化的实现方式如下：1)表达所述融合蛋白的菌体，超声破碎后分离上清及沉淀，向上清中加入一定浓度的硫酸铵，于一定温度充分相变沉淀；2)相变结束后离心分离上清和沉淀，将沉淀以合适的缓冲液充分复溶，复溶上清待用；3)将上述复溶上清使用AKTA pure仪器上样至预先平衡好的阴离子交换住，并充分结合在层析柱上，使用高盐缓冲液进行线性梯度洗脱，收集馏分；或将上述复溶上清进行第二次盐析沉淀，第二次复溶上清使用阴离子交换住层析，收集馏分，获得ELP-FGF21融合蛋白。步骤S1中，所述原核表达载体具体为pET30a载体。在本发明中，具体为将编码所述A-B-C蛋白质的基因克隆入pET30a载体的酶切位点NdeI和BamHI之间。本发明中，用于原核表达的宿主菌为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21(DE3)。更加具体的，诱导原核表达的条件为：IPTG终浓度为0.25mmol/L，30℃诱导5-6h。

本发明还公开了一种如上任一所述ELP-FGF21融合蛋白在制备创伤愈合药物或功能敷料中的应用。

作为本发明的优选方案，所述ELP-FGF21融合蛋白用于提高小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3和人角质细胞HaCaT的迁移能力。

作为本发明的优选方案，所述ELP-FGF21融合蛋白用于提高小鼠创面愈合速率。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过弹性蛋白ELP融合FGF21蛋白，显著提高了蛋白的稳定性，且融合蛋白的纯化工艺简便，收率高。

(2)本发明弹性蛋白和FGF21蛋白均具有促创伤愈合的作用，两者融合后，可起到增效的作用。即本发明制备的融合蛋白较单独蛋白表现出了更明显的愈合修复功效。

附图说明

图1为不同制备方法纯化的FGF21融合蛋白的SDS-PAGE纯度鉴定图；图中，1：FGF21融合蛋白-2次盐析沉淀；2：FGF21融合蛋白-1次盐析沉淀+Q柱；3：FGF21融合蛋白-2次盐析沉淀+Q柱；4：FGF21融合蛋白-Ni+Q柱；

图2为不同制备方法纯化的FGF21融合蛋白的SEC-HPLC分析图；

图3为FGF21融合蛋白(ELF)与FGF21的葡萄糖吸收实验检测结果；图中，ns表示差异不显著；****表示与Control组相比，差异极显著。

图4为FGF21融合蛋白(ELF)促进NIH-3T3细胞迁移结果；图中，**表示与Control组相比，差异极显著；***与Control组相比，差异极显著。

图5为FGF21融合蛋白(ELF)促进HaCaT细胞迁移结果；图中，**表示与Control相比，差异极显著；***表示与Control相比，差异极显著。

图6为FGF21融合蛋白(ELF)在小鼠伤口愈合上的药效结果；*表示与Vehicle组相比，差异显著；**表示与Vehicle组相比，差异极显著。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1、FGF21融合蛋白的制备方法

1、构建FGF21融合蛋白的表达菌株

在本实施例中，以原核体系下大肠杆菌为例，将设计的序列(见SEQ ID NO.3)根据密码子偏好性进行优化，合成相应的基因，并连入pET30a(+)载体构建重组质粒，通过DNA测序确认质粒成功合成；将质粒转化至大肠杆菌BL21-DE3菌株获得FGF21融合蛋白表达菌株，将转化成功的菌株加入甘油后，保存于-80℃冰箱；

2、FGF21融合蛋白的制备与纯化

在本实施例中，所述的FGF21融合蛋白的制备与纯化方法，所述方法包括：

(1)蛋白表达：挑取重组质粒转化大肠杆菌BL21后涂布平板的单菌落于20mL含100μg/mL Kan的LB培养基中，37℃、180rpm培养过夜，按1％的比例接种于500mL含100μg/mLKan的LB培养基中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀值为0.4-0.8后加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L进行诱导，30℃、90rpm培养5-6h。4700rpm 4℃离心20min收集菌体。

(2)菌体破碎处理：取(1)中菌体1管用40ml含有500mM NaCl的缓冲液重悬，加溶菌酶(Solarbio，L8120-50g终浓度1mg/mL)，冰上超声破碎(300W功率，破2s停3s，4min)，破碎3次。破碎后样品12000rpm4℃离心5min。

(3)盐析沉淀前处理：1)第一次盐析沉淀处理：取(2)中离心上清(40mL)加入适量的3M硫酸铵溶液使反应体系中硫酸铵终浓度为0.25M，混匀，30℃相变2h后，12000rpm 4℃离心5min，沉淀用40mL 0.5M尿素+20mM Tris缓冲液复溶，随后于4℃孵育1h，取出离心；2)第二次盐析沉淀处理，具体为向上述复溶上清中加入终浓度为0.5M的硫酸铵，剩余以相同条件处理。

(4)镍亲和色谱层析：使用AKTA avant 150蛋白纯化仪，选择镍亲和层析色谱柱(5mL)；流动相A相为Binding buffer(20mM Na₃PO₄+20mM咪唑+500mM NaCl，pH＝7.4)，B相为Washing buffer(20mM Na₃PO₄+40mM咪唑+500mM NaCl，pH＝7.4)，C相为Elution buffer(20mM Na₃PO₄+500mM咪唑+500mM NaCl，pH＝7.4)；检测波长为280nm和215nm；流速设定为3mL/min；样品为破碎上清(样品用0.45μm的滤膜过滤)，实验方法如下：a)平衡：使用2倍柱体积流动相A平衡至响应值稳定，调零，保持基线平行；b)上样：泵上样；c)淋洗：2倍柱体积流动相A冲洗，紫外曲线冲洗至稳定的基线；d)除杂：100％流动相B等度洗脱除杂；e)洗脱：100％流动相C线性梯度洗脱，收集紫外峰。

(5)阴离子交换色谱层析：使用AKTA Avant蛋白纯化仪，选择阴离子交换色谱柱(5mL)；流动相A相为Buffer A(20mM Tris，pH＝8.0)，B相为Buffer B(20mM Tris+1M NaCl，pH＝8.0)；检测波长为215nm；流速设定为3mL/min；样品为镍亲和层析馏分或上一步复溶样品(样品用0.45μm的滤膜过滤)，实验方法如下：a)平衡：使用2倍柱体积流动相A平衡至响应值稳定，调零，保持基线平行；b)上样：泵上样；c)淋洗：2倍柱体积流动相A冲洗，紫外曲线冲洗至稳定的基线；d)洗脱：100％流动相B线性梯度洗脱，收集紫外峰。

(6)浓缩及缓冲液置换：根据电泳结果合并馏分，选择10KDa膜包(科百特)进行浓缩及缓冲液置换，即得目的蛋白。

不同制备方法纯化的ELP-FGF21融合蛋白溶液的聚丙烯凝胶电泳图见图1，结果显示主条带分子量大小与目标蛋白的理论分子量大小相近。

图2为不同制备方法纯化的ELP-FGF21融合蛋白溶液的SEC-HPLC分析图，结果表明采用不同的制备方法均能实现蛋白的纯化，且终产品可达到较高的纯度，其中优选2次盐析沉淀及1次Q柱层析的制备方法。

实施例2、FGF21融合蛋白的促葡萄糖吸收能力检测

采用实施例1优化的2次盐析沉淀及1次Q柱层析制备的FGF21融合蛋白，进行Huh-7细胞的葡萄糖吸收实验。

(1)取对数生长期的Huh-7细胞，在96孔板中接种20000个细胞，100μL/孔，每组3个重复。于37℃，5％CO₂孵箱中孵育24h。

(2)弃去培养基，换为无血清的DMEM培养基饥饿培养24h；

(3)设置阳性和空白对照孔，于37℃，5％CO₂孵箱中孵育24h。其中实验组加100μL终浓度为10μmol/L待测蛋白，阳性组加100μL终浓度为10μmol/L的FGF21蛋白刺激，空白对照孔加100μL培养基。

(4)实验结束后用GOD-POD法检测培养基中残留的葡萄糖含量。根据葡萄糖检测试剂盒取培养基上清用PBS稀释样品5倍后，各取20μL加入到96孔板中，后加入180μL葡萄糖检测工作液，每组做3个复孔，37℃反应20min后，测OD₄₉₂ nm值。根据标准曲线计算葡萄糖浓度，计算葡萄糖消耗率，并运用统计学分析实验结果。细胞葡萄糖消耗率的计算公式如下：细胞葡萄糖消耗率(％)＝[(C空白葡萄糖-C给药葡萄糖)/C空白葡萄糖]×100％。

如图3所示，所述FGF21融合蛋白具有促进Huh-7细胞的葡萄糖消耗的作用，该结果与FGF21蛋白一致，表明FGF21融合蛋白成功保留了FGF21促进细胞葡萄糖吸收的活性。

实施例3、FGF21融合蛋白促进细胞迁移能力评价

(1)NIH-3T3细胞的迁移实验

a)培养板划线标记：用marker笔在12孔板背后画横线标记。

b)细胞铺板：取对数生长期的NIH/3T3细胞，胰酶消化成单细胞后，加入含血清的培养基终止反应，1000rpm离心5min收集细胞沉淀，重悬细胞并计数，取适量细胞悬液均匀接种于12孔板中(2.5×10⁵个/孔)，加入培养基至每孔1mL，于37℃、5％的CO₂培养箱中过夜培养。

c)待细胞长成单层细胞时，弃去培养基并使用1mL枪头划痕；

d)洗细胞：划线完成后，使用无菌PBS轻轻洗涤细胞2-3次，尽可能洗去划下的细胞，然后更换1mL 0.1％血清培养基。并向培养基中加入终浓度为4μM蛋白溶液，溶剂对照组只加0.1％FBSDMEM培养基及PBS，拍取0h细胞划痕照片。

e)细胞培养与观察：将细胞放入37℃，5％CO₂培养箱中培养。24小时后取出细胞，在显微镜下观察并拍取与0h相同位置的照片。

f)数据分析：使用Image J软件打开图片后，测定划痕面积。

结果如图4所示，所述FGF21融合蛋白显著促进NIH-3T3细胞的迁移。

(2)HaCaT细胞的迁移实验

a)培养板划线标记：用marker笔在12孔板背后画横线标记。

b)细胞铺板：取对数生长期的HaCaT细胞，胰酶消化成单细胞后，加入含血清的培养基终止反应，1000rpm离心5min收集细胞沉淀，重悬细胞并计数，取适量细胞悬液均匀接种于12孔板中(3×10⁵个/孔)，加入培养基至每孔1mL，于37℃、5％的CO₂培养箱中过夜培养。

c)待细胞长成单层细胞时，弃去培养基并使用1mL枪头划痕；

d)洗细胞：划线完成后，使用无菌PBS轻轻洗涤细胞2-3次，尽可能洗去划下的细胞，然后更换1mL不含血清培养基。并向培养基中加入终浓度为4μM蛋白溶液，溶剂对照组只加不含血清的MEM培养基及PBS，拍取0h细胞划痕照片。

f)数据分析：使用Image J软件打开图片后，测定划痕面积。

结果如图5所示，所述FGF21融合蛋白显著促进HaCaT细胞的迁移。

实施例4、FGF21融合蛋白促进创伤愈合能力评价

将实施例1中优化的2次盐析沉淀及1次Q柱层析制备的FGF21融合蛋白进行动物促创伤愈合功效评价，具体实施方案如下：

a)分组：24只昆明小鼠随机分成三组，每组8只小鼠：Control组(伤口未覆盖蛋白膜片)，FGF21融合蛋白组(覆盖FGF21融合蛋白膜片)，FGF21组(覆盖FGF21蛋白膜片)。

b)脱毛：将配制好的浓度为8％的硫化钠涂抹于所有小鼠的背部进行脱毛处理，需要保证脱毛干净且不灼伤皮肤，用双蒸水洗净小鼠背部脱毛剂。

c)麻醉：使用异氟烷对小鼠进行吸入麻醉。

d)制造皮肤缺损模型：用剪刀在小鼠背部皮肤中央剪出一个直径为1.0cm的圆形创面。

e)给药：将蛋白膜片放在剪好的皮肤创伤口上方，并进行伤口包扎。

f)拍照并计算：创面在第0、4、11天用摄像机记录创面变化并进行定量。ImageJ用于测量伤口面积并计算伤口愈合率。

结果如图6所示，所述的FGF21融合蛋白显著促进小鼠的创面愈合速率。

以上实验结果表明，本发明制备的成纤维细胞生长因子21融合蛋白具有促进细胞葡萄糖吸收的能力，并显著促进小鼠胚胎成纤维细胞和人角质细胞的迁移，在小鼠创伤愈合过程中表现出促进创面愈合速率的效果，具有促进创口愈合的作用。本发明通过基因工程菌表达制备一种FGF21融合蛋白，工艺简单方便、易于实现工业化生产；本发明制备的高生物活性FGF21融合蛋白，可广泛应用于组织工程、医疗器械、生物医药等领域。

以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种ELP-FGF21融合蛋白，其特征在于，其序列组成为A-B-C结构，其中，A为类弹性蛋白，B为Linker，C为成纤维细胞生长因子21序列；

所述类弹性蛋白的序列为A1-A4任一所示蛋白质：

A1为SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

A2为(VPGVG)*n，其中n＝20、40或60；

A4与A1-A3中任一所限定的氨基酸序列具有≥90％同源性且具有相同功能的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的ELP-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述Linker的序列为：(GGGGS)n，其中n＝0-5，n为整数。

3.根据权利要求1所述的ELP-FGF21融合蛋白，其特征在于，所述成纤维细胞生长因子21序列为C1-C3任一所示蛋白质：

C1为SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

C3与C1-C2中任一所限定的氨基酸序列具有≥90％同源性且具有相同功能的蛋白质。

4.一种如权利要求1-3任一所述ELP-FGF21融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.一种如权利要求1-3任一所述ELP-FGF21融合蛋白在制备创伤愈合药物或功能敷料中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述ELP-FGF21融合蛋白用于提高小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3和人角质细胞HaCaT的迁移能力。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述ELP-FGF21融合蛋白用于提高小鼠创面愈合速率。