CN117003857B - 一种具有透皮吸收性能的胶原蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种具有透皮吸收性能的胶原蛋白及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域。一种具有透皮吸收性能的胶原蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的胶原蛋白，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。经过体外细胞验证和透皮吸收实验，本申请所制备的具有透皮吸收性能的胶原蛋白具有明显的促细胞增殖和促细胞粘附活性，并具有较好的透皮吸收性能，可以被快速吸收，相比普通化工品类化妆品和激素类药物具有无副作用的巨大优势。

Description

一种具有透皮吸收性能的胶原蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，特别涉及一种具有透皮吸收性能的胶原蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
胶原蛋白（Collagen，COL）是细胞外基质的主要组成成分，是体内含量最多、分布最广的蛋白质之一。已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白分子。蛋白质分子中一级结构关键部位氨基酸的改变，会直接影响其功能，这个关键部位就是蛋白质分子的活性中心，胶原蛋白一级结构的特征是含有甘氨酸的三联体（Gly-X-Y）重复排列，通常由3条相互独立的胶原蛋白肽链依靠甘氨酸之间形成的氢键维系三股螺旋相互缠绕的结构。按照被发现的先后顺序，胶原蛋白被命名为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等，每种类型组成的3条肽链均存在区别。Ⅰ型胶原蛋白用于支撑皮肤硬度，使皮肤坚固，可以刺激重建胶原蛋白支架，有效改善皮肤凹陷、松弛、下垂；Ⅱ型胶原蛋白与皮肤损伤修复过程和修复质量紧密相关；III型胶原蛋白较细小，用于支撑皮肤柔嫩度，使皮肤细腻和富有弹性；修复纤维组织，改善皮肤粗糙、暗沉缺损等皮肤衰老问题。目前市场上的胶原蛋白主要分为天然提取和重组两大类，天然提取主要采用水解胶原蛋白法、酶解法等，但动物源天然提取的胶原蛋白变性温度是一般在39.5℃，在高于这个温度的情况下性能呈指数级下降，受到温度和酸碱变化而马上降解为明胶，失去生物学功效，且成分复杂，提纯较难，并且由于大部分天然提取物是由动物源制备，存在较高免疫原性，易致敏。重组胶原蛋白相对天然提取来说免疫原性低，变性温度高，纯度高，但现有原核表达系统存在容易形成包涵体、单一类型胶原蛋白功能单一、不利于快速吸收等缺陷。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种具有快速吸收功效的胶原蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的胶原蛋白透皮吸收性不佳的技术问题。
为实现上述目的，本申请提出了一种具有快速吸收功效的胶原蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的胶原蛋白，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq IDNO.2所示。
可选地，所述胶原蛋白的核苷酸序列是由Ⅰ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的核苷酸序列、Ⅱ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的核苷酸序列和Ⅲ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的核苷酸序列串联表达后进行人工设计所得。
可选地，所述具有快速吸收功效的胶原蛋白还包括对所述胶原蛋白进行修饰的脂质体。
可选地，所述胶原蛋白是经酿酒酵母表达系统异源表达所得。
可选地，所述胶原蛋白的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。
本申请还提出了一种具有快速吸收功效的胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL；
将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhCOL；
对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导产物；
将所述诱导产物纯化后，获得rhCOL蛋白原液；
对所述rhCOL蛋白原液进行脂质体修饰，获得具有快速吸收功效的胶原蛋白LIPO-rhCOL。
可选地，所述依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL的步骤，包括：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL。
可选地，所述将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhCOL的步骤，包括：
将重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在SC-U固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；
经菌液PCR筛选阳性克隆，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhCOL。
可选地，所述对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导产物的步骤，包括：
挑取所述重组酵母工程菌单菌落接种于SC-U选择培养基中，在30ºC、220rpm的条件下振荡培养，测定OD600nm吸光值，再转接于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下诱导20h后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经0.22μm滤膜过滤，得到诱导产物。
可选地，所述将所述诱导产物纯化后，获得rhCOL蛋白原液的步骤，包括：
将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得rhCOL蛋白原液。
可选地，所述对所述rhCOL蛋白原液进行脂质体修饰，获得具有快速吸收功效的胶原蛋白LIPO-rhCOL的步骤，包括：
将所述rhCOL蛋白原液、卵磷脂、胆固醇和丙二醇加热溶解，得有机相；
将水加热，得水相；
将有机相搅拌注入水相中，混匀，再进行均质乳化，得到混悬胶原蛋白脂质体；
再将所述混悬胶原蛋白脂质体经0.22μm滤膜过滤，获得具有快速吸收功效的胶原蛋白LIPO-rhCOL。
本申请还提出了一种具有快速吸收功效的胶原蛋白在护肤品中的应用，采用上述具有快速吸收功效的胶原蛋白作为护肤品中的活性成分。
本发明的有益效果为：
本发明通过基因重组及生物工程技术直接生产出结构稳定、具有生物学功能的重组胶原蛋白，不仅解决了天然蛋白分子量过大，难以从动物组织中提取，加工性较差的缺点，而且能够减少排异反应，规避感染疾病的风险，同时保留了天然蛋白的优良生物学性能。其中，氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该胶原蛋白的核苷酸序列进行优化设计，核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。经过体外细胞验证和透皮吸收实验，该胶原蛋白具有明显的促细胞增殖和促细胞粘附活性，并具有较好的透皮吸收性能，可以被快速吸收，相比普通化工品类化妆品和激素类药物具有无副作用的巨大优势。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述的质粒双酶切的电泳结果图；
图2为本申请实施例所述的菌液PCR鉴定结果图；
图3为本申请实施例所述的诱导上清的SDS-PAGE电泳结果图；
图4为本申请实验例所述的72h样品孔镜下观察BALB/C 3T3细胞的结果图；
图5为本申请实验例所述的促细胞增殖实验中阴性对照的结果图；
图6为本申请实验例所述的细胞对照孔细胞黏附状态图；
图7为本申请实验例所述的LIPO-rhCOL胶原蛋白促细胞黏附状态图；
图8为本申请实验例所述的细胞迁移活性镜下观察结果图；
图9为本申请实验例所述的不同蛋白经皮累计渗透量与时间关系曲线图；
图10为本申请实验例所述的rhCOL的鼠皮免疫组化结果图；
图11为本申请实验例所述的LIPO-rhCOL胶原蛋白的鼠皮免疫组化结果图；
图12为本申请实验例所述的阴性对照组鼠皮免疫组化结果图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
序列表说明（序列表内容单独提供）：
Seq ID NO.1所示为本申请实施例中胶原蛋白的氨基酸序列；
Seq ID NO.2所示为本申请实施例中胶原蛋白的核苷酸序列；
Seq ID NO.3所示为本申请实施例中Ⅰ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的氨基酸序列；
Seq ID NO.4所示为本申请实施例中Ⅱ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的氨基酸序列；
Seq ID NO.5所示为本申请实施例中Ⅲ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的氨基酸序列；
Seq ID NO.6所示为本申请实施例中标签蛋白Trx氨基酸序列；
Seq ID NO.7所示为本申请实施例中6×His标签氨基酸序列；
Seq ID NO.8所示为本申请实施例中6×His标签核苷酸序列。
目前市场上的胶原蛋白主要分为天然提取和重组两大类，天然提取主要采用水解胶原蛋白法、酶解法等，但动物源天然提取的胶原蛋白变性温度是一般在39.5℃，在高于这个温度的情况下性能呈指数级下降，受到温度和酸碱变化而马上降解为明胶，失去生物学功效，且成分复杂，提纯较难，并且由于大部分天然提取物是由动物源制备，存在较高免疫原性，易致敏。重组胶原蛋白相对天然提取来说免疫原性低，变性温度高，纯度高，但现有原核表达系统存在容易形成包涵体、单一类型胶原蛋白功能单一、不利于快速吸收等缺陷。
针对上述现有的胶原蛋白所存在的技术问题，本申请的实施例提供了一种具有快速吸收功效的胶原蛋白，包括具有如Seq ID NO.1所示的氨基酸序列的胶原蛋白，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
本申请通过基因重组及生物工程技术直接生产出结构稳定、具有生物学功能的重组胶原蛋白，不仅解决了天然蛋白分子量过大，难以从动物组织中提取，加工性较差的缺点，而且能够减少排异反应，规避感染疾病的风险，同时保留了天然蛋白的优良生物学性能。其中，氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该胶原蛋白的核苷酸序列进行优化设计，核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。经过体外细胞验证和透皮吸收实验，该胶原蛋白具有明显的促细胞增殖和促细胞粘附活性，并具有较好的透皮吸收性能，可以被快速吸收，相比普通化工品类化妆品和激素类药物具有无副作用的巨大优势。
作为本申请的一种可实施方式，所述胶原蛋白的核苷酸序列是由Ⅰ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的核苷酸序列、Ⅱ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的核苷酸序列和Ⅲ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的核苷酸序列串联表达后进行人工设计所得。
在具体应用中，Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸序列参考：Uniprot P02452序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02452），Ⅱ型胶原蛋白序列参考：UniProt P02458序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02458），Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列参考：UniprotAGL34959.1序列（https://www.uniprot.org/uniprot/ AGL34959.1），由于天然胶原蛋白分子量大，全序列表达可行性低，因此本申请主要是选取胶原蛋白不同功能的结构域进行表达或组合表达，以获得具有不同功能的重组胶原蛋白。由于选取某段结构域表达较天然蛋白生物学活性存在一定影响，而对不同亚型在保守域上可共享的空间三螺旋结构的目的基因序列进行串联表达，可保证肽链形成胶原蛋白正确的三螺旋结构，有利于确保重组胶原蛋白具有生物学活性，因此，本申请将Ⅰ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的氨基酸序列、Ⅱ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的氨基酸序列和Ⅲ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的氨基酸序列进行串联表达，如Seq ID NO.1所示，使之具备天然胶原蛋白的生物学活性。
其中，所选择的Ⅰ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的氨基酸序列片段为GRPGERGPP，如Seq ID NO.3所示；所选择的Ⅱ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的氨基酸序列片段为GEAGAPGLV，如Seq ID NO.4所示；所选择的Ⅲ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的氨基酸序列片段为GRPGERGLP，如Seq ID NO.5所示。
具体的，所述胶原蛋白的氨基酸序列中还包括标签蛋白Trx氨基酸序列（如Seq IDNO.6所示）和6×His标签氨基酸序列（如Seq ID NO.7所示），可用于纯化结合填料。
即编码该胶原蛋白的基因的核苷酸序列则是将编码Ⅰ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的核苷酸序列、编码Ⅱ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的核苷酸序列与编码Ⅲ型胶原蛋白的α1链三螺旋结构区域的核苷酸序列进行串联表达后进行人工设计得到的，编码该胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
作为本申请的一种可实施方式，所述具有快速吸收功效的胶原蛋白还包括对所述胶原蛋白进行修饰的脂质体。
本申请为提高胶原蛋白的透皮吸收性能，通过脂质体对胶原蛋白进行修饰，脂质体是由皮肤中含有的生物成分卵磷脂等磷脂类物质组成的0.12μm-0.2μm的微囊，脂质体与细胞膜有很强的相似性，所以脂质体很容易和细胞融合，脂质体特殊的结构可以携带亲水亲油功效成分进入细胞发挥作用，让有效成分更容易渗透进皮肤细胞内，同时，脂质体是一种微小且空心的球状物质，它的直径非常小，一般不会超过千分之一毫米，可以轻易的穿透毛孔和角质层细胞的间隙，把有效成分送到真皮层和基底层。故本申请通过脂质体对胶原蛋白进行修饰，可以将有效成分封存在由卵磷脂等磷脂构成的非常小、构造独特的胶囊中，并将其传递给身体和皮肤。
作为本申请的一种可实施方式，所述胶原蛋白是经酿酒酵母表达系统异源表达所得。
在具体应用中，根据表达载体和宿主菌的不同，主要分为原核表达和真核表达，原核表达系统虽成本低廉，但该表达系统存在容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低等缺陷，而利用真核表达系统进行外源表达能够获得较高活性的目的蛋白。酿酒酵母表达系统为真核表达系统，其能够高水平表达蛋白质并分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性。相较于大肠杆菌原核表达系统，酿酒酵母更加安全有效，其主要以葡萄糖、半乳糖作为碳源和能源，较为安全，不会产生毒素。
作为本申请的一种可实施方式，所述胶原蛋白的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列。
具体的，核苷酸序列如Seq ID NO.2所示，其中，Not I酶切位点的核苷酸序列为GCGGCCGC；
Xba I酶切位点的核苷酸序列为TCTAGA；
起始密码子的核苷酸序列为ATG；
终止密码子的核苷酸序列为TAA；
6×His标签核苷酸序列为：CATCACCACCATCACCAC，如Seq ID NO.8所示。
本申请的实施例还提供了一种具有快速吸收功效的胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S10、依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL。
在具体应用中，委托通用生物（安徽）股份有限公司依据如Seq ID NO.2所示的优化后的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL。
具体的，在这一步中，同时合成检测引物：
T7：5' TAATACGACTCACTATAGGG 3'；
CYC1 Terminator：5' GTGACATAACTAATTACATGATG 3'；
将酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα和人工合成的重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL分别用Not I和Xba I进行双酶切，酶切体系（50μL）包括QuickCut HindⅢ、QuickCut EcoRI和10×QuickCut Green Buffer各5μL、pYES2或PCR产物35μL。在37℃金属浴中酶切3 h，酶切后以1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，如图1所示（其中，泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1-2：pYES2/CT-MFα-rhCOL重组质粒双酶切结果；3：阴性对照）；再胶回收双酶切的PCR产物和pYES2/CT-MFα质粒；
将双酶切回收的PCR产物与pYES2/CT-MFα质粒用T4 DNA连接酶在16℃中连接1h-5h，连接体系（10μL）包括目的基因5μL、载体片段3μL、T4 DNA 连接酶1μL和10×连接酶缓冲液1μL，将重组质粒转化到E. coliDH5α感受态细胞中，经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养，菌液PCR鉴定结果如图2所示（其中，泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1-4：菌液PCR产物），PCR鉴定后送公司进行测序，测序结果无误，重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL构建成功。
S20、将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhCOL。
在具体实施过程中，取10μL的重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL加入80μL酿酒酵母INVScl感受态细胞中，混匀后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min；Bio-Rad电转化仪调至真菌档，将电击杯置于Bio-Rad电转化仪上进行电击转化；电击结束后迅速向电击杯中加入500μL预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U固体平板，经30 ℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；
挑取SC-U固体平板上生长的单克隆菌落，并接种到SC-U液体培养基中，在30 °C、200 rpm的条件下恒温培养，以菌液为模板进行PCR反应，鉴定筛选阳性克隆，选取鉴定无误的阳性克隆进行下一步试验，由此获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhCOL。
具体的，在这一步中，SC-U液体培养基的配方包括：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；在121 °C下高压灭菌20 min，冷却至60 °C以下，在超净台中加入无菌100ml 10×葡萄糖。
S30、对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导产物。
在具体实施过程中，挑取所述重组酵母工程菌单菌落接种于20ml SC-U选择培养基，经30°C、220rpm振荡培养过夜，测定其OD600nm吸光值，计算相应体积的菌液并转接至100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD600nm达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下诱导20h后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经0.22μm滤膜过滤，得到诱导产物。
具体的，在这一步中，SC-U选择培养基的配置包括：YNB无氨基酸氮源6.7g/L，0.01%氨基酸混合物Ⅰ（精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤）1g/L，0.005%氨基酸混合物Ⅱ（天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸）0.5g/L，葡萄糖20g/L，并含有2％的琼脂；
SC-U诱导培养基的配置包括：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，并含有2％的琼脂。
在具体应用中，对诱导上清进行鉴定，将诱导上清经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，可观察到50kDa左右有明显的特异性条带出现，如图3所示（其中，泳道M：蛋白Marker；1：诱导上清；2：质粒空载诱导上清），与预测分子量基本一致，表明目的蛋白成功表达并分泌到胞外，而含有pYES2/CT-MFα空载质粒的酿酒酵母菌株的诱导表达上清液则无特异性条带。
S40、将所述诱导产物纯化后，获得rhCOL蛋白原液。
在具体实施过程中，将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得rhCOL蛋白原液。
具体的，在这一步中，将诱导产物用以上样；并使用GE Healthcare公司ChelatingSepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料，用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用PBS缓冲液平衡2-3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5mL/min；再用PBS缓冲液过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD280nm稳定；再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，梯度洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到rhCOL蛋白原液。
其中，PBS缓冲液的配置包括：将NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g加纯化水溶解，调pH至8.0，定容至1 L；
500mM咪唑PBS缓冲液的配置包括：将NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g和咪唑34.04g加纯化水溶解，调pH至8.0，定容至1 L。
S50、对所述rhCOL蛋白原液进行脂质体修饰，获得具有快速吸收功效的胶原蛋白LIPO-rhCOL。
在具体实施过程中，将所述rhCOL蛋白原液（rhCOL蛋白含量200mg）、卵磷脂4g、胆固醇1g和丙二醇4g在37℃下加热溶解，得有机相；
将注射用水180g加热至37℃，得水相；
将有机相在搅拌的条件下注入水相中，混匀，再通过高压均质机进行均质乳化，结束后，恒速泄压，得到混悬胶原蛋白脂质体；
再将所述混悬胶原蛋白脂质体经0.22μm滤膜过滤，获得具有快速吸收功效的胶原蛋白LIPO-rhCOL。
在具体应用中，观察得到的LIPO-rhCOL的外观呈乳白色的混悬液，粒子呈类球形且均一，通过电镜照片进行粒径检测可知，粒径可控，为50nm-300nm，选择使用透析法进行包封率的测定，通过测定脂质体中游离胶原蛋白的含量来计算包封率，测得的结果为，包封率大于75％，载药量不低于8％。
本申请的实施例还提供了一种具有快速吸收功效的胶原蛋白在护肤品中的应用，采用上述具有快速吸收功效的胶原蛋白作为护肤品中的活性成分。
下面结合具体实施例对本申请上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种rhCOL蛋白原液的制备方法，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL；
将重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在SC-U固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；
经菌液PCR筛选阳性克隆，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhCOL；
挑取所述重组酵母工程菌单菌落接种于SC-U选择培养基中，在30ºC、220rpm的条件下振荡培养，测定OD600nm吸光值，再转接于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下诱导20h后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经0.22μm滤膜过滤，得到诱导产物；
将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得rhCOL蛋白原液。
实施例2
一种具有快速吸收功效的胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
将实施例1制备的rhCOL蛋白原液、卵磷脂、胆固醇和丙二醇加热溶解，得有机相，并将水加热，得水相；
将有机相搅拌注入水相中，混匀，再进行均质乳化，得到混悬胶原蛋白脂质体；
再将所述混悬胶原蛋白脂质体经0.22μm滤膜过滤，获得具有快速吸收功效的胶原蛋白LIPO-rhCOL。
实验例1
对本申请实施例制备的胶原蛋白LIPO-rhCOL进行促细胞增殖实验。参考《中国药典》2020版（三部）附录“3528”。依据胶原蛋白LIPO-rhCOL对小鼠胚胎成纤维细胞（BALB/c3T3 细胞）的生长具有刺激作用，BALB/c 3T3细胞的生长状况因胶原蛋白LIPO-rhCOL生物学活性的差异，以此检测体外促细胞增殖的生物学活性。
1.1实验材料
供试品：实施例2制备的胶原蛋白LIPO-rhCOL；
细胞株：Balb/c 3T3细胞，20代，冻存批号20211106，购自美国ATCC。
其他试剂（细胞营养液、无血清培养基、PBS缓冲液、0.25%胰蛋白酶）和其他物品（96孔细胞培养板、TIP头和微量移液器）为实验室常规，实验前进行灭菌或过滤除菌处理，无菌检测合格。
1.2具体实施方法
将BALB/c 3T3细胞株用完全细胞培养液于37℃、5%二氧化碳的条件下培养，控制细胞浓度为1.0×105cells/ml-5.0×105cells/ml，传代后24h-36h用于生物学活性测定；
弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全细胞培养液配成5.0×105cells/ml- 8.0×105cells/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5%二氧化碳的条件下培养；
24h后换成PBS缓冲液，于37C、5%二氧化碳条件下培养24h；
制备的细胞培养板弃去PBS缓冲液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μL，于37℃、5%二氧化碳条件下培养64h-72h，除样品组外，还设置阴性对照（只接种细胞），每组各2个重复孔；
每孔加入MTT溶液20μL，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5h，以上操作在无菌条件下进行，弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100μL，充分溶解混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，记录测定结果；
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。
1.3结果计算
在72h样品孔镜下观察BALB/c 3T3细胞（100倍镜）的状态如图4所示，阴性对照如图5所示，数据处理结果如下表1所示。
表1
由图5可以看出，阴性对照孔细胞仅有极少数细胞存活，阴性对照实验成立；由图4和表1可以看出，根据体外细胞学功效模型实验结果表明胶原蛋白LIPO-rhCOL有促进成纤维细胞增殖效果。
实验例2
对本申请实施例制备的胶原蛋白LIPO-rhCOL进行促细胞粘附试验。通过促牛肾细胞（MDBK细胞）的黏附（贴壁）试验，统计不同浓度下各孔内细胞数，经四参数拟合得出胶原蛋白LIPO-rhCOL的促黏附活性效价。
2.1实验原理
为研究胶原蛋白LIPO-rhCOL对细胞的黏附作用影响，可通过离心法定量测定胶原蛋白LIPO-rhCOL与细胞形成黏附后分离所需的力，将细胞悬液在涂有胶原蛋白LIPO-rhCOL的培养皿中培养一定时间，以最佳相对离心力洗脱未黏附的细胞，测定离心前后细胞分离百分比，评价待测胶原蛋白LIPO-rhCOL样品的相对促细胞黏附性。
2.2实验材料
供试品：实施例2制备的胶原蛋白LIPO-rhCOL；
细胞株：MDBK细胞，23代，冻存批号20200502，购自美国ATCC。
其他试剂（细胞营养液、无血清培养基、PBS缓冲液、0.25%胰蛋白酶）和其他物品（96孔细胞培养板、TIP头和微量移液器）为实验室常规，实验前进行灭菌或过滤除菌处理，无菌检测合格。
2.3具体实施方法
将胶原蛋白LIPO-rhCOL用PBS缓冲液在96孔细胞培养板中进行2倍梯度稀释，共做10个稀释度，每孔50μL不同稀释度的胶原蛋白LIPO-rhCOL，并设立阴性对照（加入50μL的PBS缓冲液作为对照），4℃过夜孵育；
孵育完成后，弃去细胞培养板中液体，每孔加入100μL的30μg/μL BSA，置于37℃温箱孵育1h；
取出96孔细胞培养板，弃去细胞培养板中液体，再加入MDBK重悬细胞（用无血清培养基重悬），细胞接种密度为1.0×105cells/ml，每孔接种100uL，温箱孵育3h-5h；
将孵育完成的细胞培养板用PBS缓冲液洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况。选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果拟合曲线得出效价。
2.4实验结果
细胞对照孔促细胞黏附状态如图6所示，胶原蛋白LIPO-rhCOL促细胞黏附状态如图7所示。经计算，胶原蛋白LIPO-rhCOL促细胞黏附活性为571 U/mL，比活性为295 U/mg，因此，胶原蛋白LIPO-rhCOL具有促细胞黏附活性。
实验例3
对本申请实施例制备的胶原蛋白LIPO-rhCOL进行细胞划痕实验。胶原蛋白体外功效模型中，成纤维细胞迁移或移行实验属于较成熟有效的体外评测手段。基于体外细胞划痕修复实验模型，检测胶原蛋白LIPO-rhCOL是否有利于细胞的识别、移行，从而起到组织修复和重建的功效。
3.1实验原理
当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过比较图像以确定细胞迁移速率。
3.2实验材料
供试品：实施例2制备的胶原蛋白LIPO-rhCOL；
细胞株：HaCaT角质化细胞，20代，冻存批号20181106，购自美国ATCC。
其他试剂（细胞营养液、无血清培养基、PBS缓冲液、0.25%胰蛋白酶）和其他物品（96孔细胞培养板、TIP头和微量移液器）为实验室常规，实验前进行灭菌或过滤除菌处理，无菌检测合格。
3.3具体实施方法
用黑色记号笔在6孔细胞培养板背后，用直尺对齐，均匀划横线，大约每隔0.5cm-1cm一道，横穿过孔；向上述6孔细胞板中加入浓度为5×105/mL的HaCaT角质化细胞悬液2mL，放置37℃、5%二氧化碳培养箱培养24h，待细胞长满单层，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道横线，用PBS缓冲液洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞，然后向6孔内加入1.8ml无血清DMEM培养液，最后向孔内添加200μL胶原蛋白LIPO-rhCOL，同时细胞对照孔加入等量的PBS缓冲液。将上述6孔细胞板放置37℃、5%二氧化碳培养箱培养24h，培养。0时拍照，记录每孔内拍照位置。HaCaT角质化细胞培养24h后，对固定位置进行观察、拍照。
3.4实验结果
细胞对照孔与样品孔0h与24h观察结果（40倍镜）如图8所示，计算迁移率，迁移率=（0h划痕宽度-培养后划痕宽度）/0h划痕宽度×100%。计算结果如下表2所示。
表2
根据图8和表2可以看出，胶原蛋白LIPO-rhCOL的促细胞迁移率明显较细胞对照组高，说明胶原蛋白LIPO-rhCOL具有明显的促细胞迁移效果。
实验例4
对本申请实施例制备的rhCOL蛋白原液和胶原蛋白LIPO-rhCOL进行透皮吸收实验。
4.1实验原理
将蛋白溶液在直立式Franz扩散池中进行透皮吸收试验，扩散池置于药物透皮扩散试验仪中，于37℃恒温循环水浴中保温。
4.2实验材料与仪器
供试品：实施例1制备的rhCOL蛋白原液，蛋白浓度4.4mg/mL；实施例2制备的胶原蛋白LIPO-rhCOL，蛋白浓度1.7mg/mL；
无菌生理盐水；
COL单抗（全序列鼠源单抗，购自R&D公司）；
SPF级ICR小鼠；
透皮仪（接受池最大容量20mL，有效透皮面积1.36cm2）。
4.3实验步骤
2.1离体皮肤制备
小鼠麻醉后颈椎脱臼法处死，刮除腹部皮肤发毛后，剥离无毛的腹部皮肤，去除皮下脂肪，用生理盐水洗净后，于生理盐水中4℃保存，24h内使用。
2.2体外透皮试验预试验
2.2.1鼠皮安装
在直立式Franz扩散池中进行透皮吸收试验，扩散池置于药物透皮扩散试验仪中；将处理好的小鼠离体皮肤固定在供给池和接收池中间，角质层部分朝向供给池，真皮层面朝向接受室；调整水浴系统温度为37℃，搅拌速度为100 r/min，在接受室中加入预温 37℃的生理盐水，排尽气泡；为降低干扰，在不给药的情况下，先将鼠皮内层表面与接受液接触，再将不同组分溶液5mL注入供给室紧贴于鼠皮肤上。
2.2.2采样
分别于实验开始后第1h、2h、4h、6h、8h、12h和24 h用注射器抽取1mL接受液作为样品液；同时，将接受室补满等量生理盐水溶液；最后，将收集的各时间段的样品液进行检测。
2.2.3实验分组
将不同样品液分别使用生理盐水稀释至0.1mg/ml，同时设置阴性对照（供给池中为生理盐水）进行实验。
3样本检测
3.1蛋白浓度检测
将取出的接收液样品采用考马斯亮蓝法测定接受液中蛋白含量，并用对24h后鼠皮进行免疫组化检测。
3.2免疫组化切片制备
将各组实验24h后的鼠皮取透皮部分进行固定，制备免疫组化切片；
切片放入干燥箱66℃烤片20min-30min；
依次过3道二甲苯，每道5min；
依次过3道（100%-95%-80%）乙醇，每道3min；
将切片放入烧杯中，流水缓慢冲洗，洗去乙醇，直到切片干净透明；
抗原高压修复：在高压锅内配制2000ml PH为6.0的柠檬酸盐修复液，电磁炉加热至沸腾，放入切片盖上锅盖，喷气后计时2min，然后停止加热，流水缓慢冲洗高压锅盖直至冷却；
阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%H2O2中室温孵育，蒸馏水洗3次，画疏水圈，PBS-T冲洗3次；
甩去切片上多余的液体，滴加一抗（COL单抗），加盖置于37℃培养箱孵育60min。取出切片，PBS-T冲洗3次；
甩去切片上多余的液体，滴加二抗，加盖置于37℃培养箱孵育30min。取出切片，PBS-T冲洗3次；
甩去切片上多余的液体，滴加DAB显色剂，显微镜下控制显色时间，有阳性终止显色，蒸馏水冲洗干净；
苏木素衬染2-5min，水洗干净；1%盐酸酒精分化数秒，水洗干净；
碳酸锂溶液蓝化30s，水洗干净；
常规脱水，二甲苯透明；
中性树胶封片，显微镜观察结果，棕色为阳性反应。
4实验结果
4.1各时间段样本蛋白浓度
采用考马斯亮蓝法对各时间段收集的样品进行蛋白浓度检测，并计算累积渗透量（Q），结果见下表3所示；
累积渗透量（Q）根据下列公式计算：
其中，Cn表示第n次取样样品浓度，Ci表示第i次取样样品浓度，V表示接收池体积，Vi表示取样体积，S表示透皮面积。
表3
采用Excel 2019软件以Q对时间t作图，并进行线性回归，得动力学拟合方程。该方程的斜率即为稳态透过速率[µg/（h·cm2）]，表明药物的透皮吸收速度，两组蛋白的累计渗透量与时间线性曲线如图9所示，两组的动力学拟合方程及渗透参数如下表4所示。
表4
从表4可以看出，LIPO-rhCOL胶原蛋白的稳态透过速率远高于rhCOL蛋白原液，说明经过脂质体修饰，可明显提高胶原蛋白的稳态透过速率。
4.2鼠皮免疫组化结果
对实验24h后的鼠皮进行免疫组化检测，以确定各组蛋白是否透过鼠皮。rhCOL蛋白透过鼠皮的结果示意图如图10所示，LIPO-rhCOL胶原蛋白透过鼠皮的结果示意图如图11所示，阴性对照组透过鼠皮的结果示意图如图12所示。
对比图10-图12可以看出，正常鼠皮在生理盐水浸泡24h后，仅皮肤表皮残留自身胶原蛋白（棕色阳性反应），真皮层内已基本无胶原蛋白；图10中rhCOL通过毛囊进入皮肤（图10中箭头所指），24h内真皮层内零星存在部分透过的rhCOL；而图11中LIPO-rhCOL经过透皮试验可见皮肤真皮层中存在大量阳性反应区域（图11中箭头所指），因此可确认实验中的LIPO-rhCOL可以被快速吸收，经皮肤透过效果优于rhCOL，说明经过脂质体修饰可以明显改善胶原蛋白的透皮吸收效果。
以上所述仅为本申请的可选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种具有透皮吸收性能的胶原蛋白，其特征在于，编码所述胶原蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。
2.一种如权利要求1所述的具有透皮吸收性能的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL；
将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhCOL；
对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导产物；
将所述诱导产物纯化后，获得rhCOL蛋白原液；
对所述rhCOL蛋白原液进行脂质体修饰，获得具有透皮吸收性能的胶原蛋白LIPO-rhCOL。
3.根据权利要求2所述的具有透皮吸收性能的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列和酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα，构建重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL的步骤，包括：
依据如Seq ID NO.2所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-MFα上的酶切位点Not I和Xba I之间，获得重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL。
4.根据权利要求2所述的具有透皮吸收性能的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL转化入酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养、PCR扩增、筛选，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhCOL的步骤，包括：
将重组质粒pYES2/CT-MFα-rhCOL加入酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，进行电击转化，再加入山梨醇溶液，混匀后，孵育，离心后弃去上清，涂布在SC-U固体平板，经30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；
经菌液PCR筛选阳性克隆，获得重组酵母工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rhCOL。
5.根据权利要求2所述的具有透皮吸收性能的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述对所述重组酵母工程菌进行诱导表达，并收集诱导产物的步骤，包括：
挑取所述重组酵母工程菌单菌落接种于SC-U选择培养基中，在30ºC、220rpm的条件下振荡培养，测定OD600nm吸光值，再转接于SC-U诱导培养基中，使初始OD600nm吸光值达到0.4；
在30ºC、220rpm的条件下诱导20h后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经0.22μm滤膜过滤，得到诱导产物。
6.根据权利要求2所述的具有透皮吸收性能的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述诱导产物纯化后，获得rhCOL蛋白原液的步骤，包括：
将所述诱导产物经过镍离子螯合亲和层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得rhCOL蛋白原液。
7.根据权利要求2所述的具有透皮吸收性能的胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述对所述rhCOL蛋白原液进行脂质体修饰，获得具有透皮吸收性能的胶原蛋白LIPO-rhCOL的步骤，包括：
将所述rhCOL蛋白原液、卵磷脂、胆固醇和丙二醇加热溶解，得有机相；
将水加热，得水相；
将有机相搅拌注入水相中，混匀，再进行均质乳化，得到混悬胶原蛋白脂质体；
再将所述混悬胶原蛋白脂质体经0.22μm滤膜过滤，获得具有透皮吸收性能的胶原蛋白LIPO-rhCOL。
8.一种具有透皮吸收性能的胶原蛋白在制备护肤品中的应用，其特征在于，采用如权利要求1所述的具有透皮吸收性能的胶原蛋白制备护肤品中的活性成分。
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