CN114106202A - 一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物基因技术领域；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。本本发明的融合蛋白经过证实，在不影响芋螺毒素功效的前提下，胶原蛋白融合能够有效的降低芋螺毒素细胞毒性，提高原料生物安全性；同时在分子设计时添加了透皮肽，其除皱和保湿能力经过功效验证，证明了透皮肽的加入可以有效的增加融合蛋白透皮吸收能力，促进了芋螺毒素的透皮吸收。

Description

一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholinereceplors.nAChRs)是人们最早发现的一类受体。是介导突触间快速信号传递的配体门控离子通道蛋白、在中枢和外周神经系统及肌肉中广泛分布。nAChR分为肌肉型和神经型两种，是由5个亚基组成的跨膜五聚体，其中肌肉型nAChR普遍存在于脊椎动物骨骼肌细胞以及某些鱼的放电器官细胞的质膜上。受体与乙酰胆碱结合，引起Na+通道的开放，Na+流入靶细胞，使得质膜去极化并引起细胞的收缩。它分为神经型和肌肉型两大类。肌肉型nAChRs由5个亚基(2α、18、18和1y/ε)组成。
芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是海洋软体动物芋螺的毒管组织分泌的由10～50个氨基酸残基组成的小肽。芋螺毒素通过选择性靶向不同类型的神经递质受体或电压门控离子通道，通常被用作神经科学研究和药物开发的分子工具。根据芋螺毒素高度保守的信号肽序列，将芋螺毒素分为A、M、O、P、S、T、I、V、Y、J等14个超家族，根据其药理学作用靶点，又分为α、μ、の、K、8、V、σ、p、γ、加压素、惊厥剂和睡眠肽等亚家族。其中A-超家族芋螺毒素又可根据药理学作用靶点进一步分为α-、κA-、αA-家族。α-家族芋螺毒素具有典型的CC-C-C半胱氨酸框架，通常由12～19个氨基酸残基组成，主要作用靶点为烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)。α-芋螺毒素能与神经肌肉接头处突触后膜上nAChR的α亚基结合，从而竞争性地抑制乙酰胆碱与受体结合，阻断神经-肌肉兴奋信号的传递。有研究表明来源于α-芋螺毒素的多肽对于肌肉收缩的抑制作用，其中芋螺毒素Reg1对肌细胞和骨骼肌的收缩表现出了明显的抑制作用，同时也具有良好的安全性。它与来源于蛇毒的三肽化合物SYN-AKE蛋白质片段的化学物质，表现出了相似的生物活性。而SYN-AKE被广泛地应用到了抗皱类的化妆品中，说明α-家族芋螺毒素有望开发成为一种新的原料，应用于抗皱纹类化妆品中。
胶原蛋白作为一种纤维蛋白，其基本组成单位是原胶原分子。原胶原分子是由三股α-螺旋结构的肽链缠绕形成的纤维状蛋白，长度约为300nm，直径约1.5nm，分子量为300kDa。胶原中含有大量的甘氨酸，约占总氨基酸残基的1/3，其一级结构(肽链)均为(Gly-X-Y)n重复序列；其次是脯氨酸和羟脯氨酸，含量高达15％至30％，这两种氨基酸为胶原所特有，但色氨酸、酪氨酸及蛋氨酸等必需氨基酸含量低。
胶原蛋白能够保护皮肤，提高皮肤的弹性。胶原蛋白占皮肤成分的70％，皮肤有如一个大套子紧紧包住身体各处，表面积相当大，人体四肢活动时，皮肤中胶原蛋白发挥功能，使皮肤具有保护功能，又能适当增加弹性及坚硬度，使肌肉细胞互相连接，并使其富有弹性和光泽。由于胶原及其水解物与人皮肤胶原的结构相似，相容性好，可以扩散到皮肤的深层，对人的皮肤有很好的营养作用，且胶原蛋白分子外侧存在大量的羧基和羟基，同时存在大量的甘氨酸等天然保湿因子，能提高组织细胞的贮水能力，使皮肤保湿；许多种胶原蛋白多肽与皮肤细胞的生长、分化、分裂、增殖和迁移有关，能提供皮肤的养分，延缓皮肤衰老，促进皮肤创面修复；胶原蛋白溶液还有很强的抗辐射作用，因而广泛应用于化妆品行业。
但目前市售的芋螺毒素细胞毒性较高，导致其原料生物安全性较低，且芋螺毒素的除皱和保湿能力普遍较弱。
发明内容
为克服现有的技术缺陷，本发明目的在于提供一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，提供了一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。
优选地，所述融合蛋白由如下氨基酸肽段融合组成：
芋螺毒素肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
类人源胶原蛋白肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
连接肽肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
透皮肽肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
本发明选取了一段α-家族芋螺毒素多肽序列与人源化胶原蛋白序列，进行了融合蛋白尝试，以期利用胶原蛋白在毕赤酵母中的高表达能力，促进芋螺毒素在毕赤酵母中的表达。已有文献报道成功实现大肠杆菌分泌表达体系的构建，通过改造pET22b(+)载体成功实现了芋螺毒素It7a在大肠杆菌中可溶表达，但表达量仅有6mg/L。本发明通过与胶原蛋白融合表达明显促进了芋螺毒素的表达，表达量达到1.2g/L。
本发明融合蛋白的功效优势
胶原蛋白能促进皮肤的生长和更新，促进肌肤胶原蛋白及弹性蛋白的生成，维护并修复皮肤的屏障功能，提升皮肤应对环境变化的能力；芋螺毒素可以对肌细胞和骨骼肌的收缩表现出了明显的抑制作用，可以缓解肌收缩，减少皱纹生成，并能有效改善；透皮肽可以改善蛋白透皮吸收能力，促进蛋白吸收。本发明中还对融合蛋白发酵液进行了功效性评价，表明其对保持皮肤湿度、除皱等方面有明显作用。该融合蛋白能够改善皮肤弹性、细纹、紧致、纹理、毛孔、面部轮廓等多方面的肌肤状况，是一种前景不错的护肤新原料。
第二方面，提供了一种如第一方面所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)基因的获得
人工设计并合成融合蛋白对应的核苷酸序列，如SEQ.ID.NO.6所示，在序列的两端直接加入酶切位点；
2)pPIC9k-CTX-HCY重组质粒的构建
利用XhoI和Not I限制性内切酶对人工合成的序列及毕赤酵母通用载体进行双酶切，酶切后回收对应的目的基因及载体，利用T4 DNA连接酶连接转化大肠杆菌，测序鉴定获得正确的pPIC9k-CTX-HCY重组质粒；
3)pPIC9k-CTX-HCY重组质粒转化GS115酵母感受态
pPIC9k-CTX-HCY重组质粒利用Sal I线性化后，对其进行纯化回收，然后对回收的200μL质粒置45℃烘箱中烘烤干燥浓缩质粒至10-20μL；之后利用电转化仪将pPIC9k-CTX-HCY重组质粒转化至毕赤酵母GS115，G418筛选高拷贝转化子；
4)重组酵母转化子的鉴定
采用冻融法提取转化子基因组DNA，PCR鉴定；
5)GS115/pPIC9k-CTX-HCY酵母转化子在摇瓶中的表达
利用BMGY和BMMY培养基对PCR鉴定正确的转化子进行摇瓶发酵表达，甲醇诱导发酵，SDS-PAGE电泳检测表达结果；
6)融合蛋白的纯化
利用CM-琼脂糖凝胶FF离子交换层析柱对融合蛋白的发酵液进行纯化，挂柱洗脱，收集洗脱液，最后将洗脱液透析脱盐冻干，获得融合蛋白。
第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码第一方面所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
第四方面，提供了一种载体，所述载体含有第三方面所述的核酸分子。
第五方面，提供了根据第一方面所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白、第三方面的核酸分子、第四方面所述的载体在化妆品或医美产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的融合蛋白经过证实，在不影响芋螺毒素功效的前提下，胶原蛋白融合能够有效的降低芋螺毒素细胞毒性，提高原料生物安全性；同时在分子设计时添加了透皮肽，其除皱和保湿能力经过功效验证，证明了透皮肽的加入可以有效的增加融合蛋白透皮吸收能力，促进了芋螺毒素的透皮吸收。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1为芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白分子SWISS-MODEL建模3D结构示意图；
图2为GS115/9K-CTX-HCY重组转化子PCR鉴定结果示意图；
图3为GS115/9K-CTX-HCY菌种摇瓶诱导表达鉴定结果示意图；
图4为融合蛋白纯化后冻干粉电泳结果示意图；
图5为Primos前额皮肤皱纹测试分析结果示意图；
图6为Primos外眼角皮肤皱纹测试分析结果示意图；
图7为Primos鼻唇沟皮肤皱纹测试分析结果示意图；
图8为VISIA-CR图像皱纹总面积分析结果示意图；
图9为VISIA图像分析结果示意图。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步介绍和说明；显然，以下所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书公开的内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。
除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总质量计算的。本文术语“质量含量”可用符号“％”表示。
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由...组成”和“基本上由...组成”。本发明的组合物和方法/工艺可包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。
实施例
1.融合蛋白分子设计
1.1类胶原蛋白(Ⅲ型)、家族芋螺毒素蛋白质序列及基因序列的获得在NCBI网站上查找。
芋螺毒素氨基酸序列见SEQ.ID.NO.1；
类人源胶原蛋白氨基酸序列见SEQ.ID.NO.2；
透皮肽氨基酸序列见SEQ.ID.NO.3；
连接肽氨基酸序列见SEQ.ID.NO.4；
融合蛋白氨基酸序列见SEQ.ID.NO.5。
本实施例的融合蛋白分子的SWISS-MODEL建模3D结构如图1所示。
1.2按照毕赤酵母的密码子偏爱性，人工设计融合蛋白的核苷酸序列，在序列的两端直接加入酶切位点，化学合成之后就可直接插入到载体之中。最后确定的核苷酸序列见SEQ.ID.NO.6
1.3引物设计：
CTX-HCY-XF:5'-AGCCTCGAGAAAAGAGGCAGTCTGGGCTGCTGTTGGAAT-3'
CTX-HCY-NR:5'-GATGCGGCCGCTTAAGCTCTAGCTTGTCTAGCAGC-3'
1.4融合蛋白质理论性质：
蛋白质分子量为:25.05KDa
等电点:8.321
2.pPIC9k-CTX-HCY重组质粒的构建
2.1物料：
2×Taq PCR Mastermix(天根生化)，T4 DNA Ligase(Thermo)，DH5α感受态细胞(天根生化)，限制性内切酶Not I FastDigest(Thermo)，限制性内切酶XhoI FastDigest(Thermo)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化)，LB培养基。
2.2设备：
PCR仪(Bio-RAD)，水平电泳装置，离心机，摇床。
2.3方法：
2.3.1目的基因、载体的双酶切
为构建可用于连接的粘性末端，本实验使用XhoI和Not I限制性内切酶对全基因合成质粒T-CTX-HCY和pPIC9K载体进行双酶切，酶切体系分别如表2-1及表2-2，具体酶切步骤如下：
(1)在干净的PCR管中配制酶切反应体系，分别如表2-1及表2-2：
表2-1：全基因合成质粒T-CTX-HCY限制性酶切体系
组分 体积(μL)
T-CTX-HCY质粒 6.0
10×Buffer 2.0
Not I 1.0
XhoI 1.0
ddH<sub>2</sub>O 10.0
共20μL
表2-2：pPIC9k限制性酶切体系
组分 体积(μL)
pPIC9K载体 6.0
10×Buffer 2.0
Not I 1.0
XhoI 1.0
ddH<sub>2</sub>O 10.0
共20μL
(2)轻弹管壁，用混悬仪混匀溶液，瞬时离心将溶液集中于管底；
(3)将管放置于37℃水浴中，酶切15min。
(4)酶切步骤后，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并对其按照天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒要求，进行切胶回收。
(5)回收产物与预期片段大小一致，方可直接用于构建表达载体的连接反应。
2.3.2酶切产物的连接
为构建表达载体pPIC9K-CTX-HCY，本实验选用Thermo的T4 DNA连接酶，对酶切回收产物以及pPIC9K载体酶切产物进行连接，连接体系如表2-3，具体连接步骤如下：
(1)在干净的PCR管中配制连接反应体系，分别如表2-3：
表2-3：T4连接酶连接体系
组分 体积(μL)
pPIC9K(X+N) 2.0
CTX-HCY(X+N) 18.0
T4 DNA ligase 2.0
buffer 4.0
ddH<sub>2</sub>O 14.0
共40μL
(2)轻弹管壁，用混悬仪混匀溶液，瞬时离心将溶液集中于管底；
(3)将T4连接体系的EP管放置22℃恒温连接仪中，连接4小时；
(4)完成以上连接步骤后，连接产物可直接用于感受态细菌的转化。
2.3.3连接产物的转化
实验使用E.coli DH5α感受态细胞进行质粒转化，具体的试验步骤如下：
(1)取出1管保存在-80℃冰箱中的DH5α感受态细胞(90μL)，迅速插入冰盒中，待冻住的菌块融化后，于超净工作台中分别加入10μL前述的两种连接产物，用手指轻微拨打管底混匀后，将EP管放置冰盒上静置30min；
(2)将EP管放置于42℃水浴中热激90s，随后迅速放入冰盒中静置3min，此过程应小心操作，尽量避免剧烈晃动，否则影响转化效率；
(3)向EP管中分别加入600μL不含抗生素的无菌LB液体培养基，摇晃混匀后于37℃摇床中以180rpm的转速孵育45分钟；
(4)于超净工作台中分别吸取出约200μL的孵育菌液，均匀涂布于含有60μg/mL氨苄抗生素的LB平板上；
(5)将LB平板倒置放于37℃恒温培养箱中，培养过夜。
2.3.4重组阳性转化子的鉴定
挑选长出的阳性转化子，进行菌液PCR鉴定，并对PCR鉴定正确的菌株，送北京擎科生物有限公司测序，具体的试验步骤如下：
(1)从含有60μg/mL氨苄抗生素的LB平板上挑取长出的阳性转化子，并将菌株编号，接种5mL含有60μg/mL氨苄抗生素的LB培养基中。
(2)放置摇床上，200rpm，37℃，培养过夜。
(3)第二天，以培养菌液为模板，设计引物CTX-HCY-XF，CTX-HCY-NR为引物，按表2-4反应体系配制，进行PCR。
表2-4：菌液PCR体系
Figure BDA0003375706030000091
Figure BDA0003375706030000101
(4)PCR程序设置：在PCR仪中设置如下程序
1)94℃，5min
2)94℃，30s(解链)
3)60℃，30s(退火)
4)72℃，1min(延伸)
5)步骤2至步骤4重复30个循环
6)72℃，5min
7)4℃，Forever
(5)将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果，初步确定阳性转化子，将其对应菌液，按菌液与50％甘油1:1比例，制备甘油管，-20℃保存。
(6)从甘油管种子中，分装100μL菌液，送北京擎科生物有限公司测序。测序结果与设计序列比对，将正确阳性转化子进行保存。
3、pPIC9k-CTX-HCY重组质粒转化GS115酵母感受态
3.1物料：
质粒小提中量试剂盒(天根生化)，通用型DNA纯化回收试剂盒(天根生化)，限制性内切酶Sal I FastDigest(Thermo)。
3.2设备：
水浴锅、电穿孔设备、生化培养箱。
3.3方法：
3.3.1重组质粒的中量提取
(1)吸取需电转质粒菌液10μL，接种于20mL含60μg/mL氨苄抗生素的LB培养基中。
(2)取15mL菌液，室温，12000rpm，离心1min收集菌体。
(3)按天根质粒小提中量试剂盒要求，提取pPIC9K-CTX-HCY质粒。最终用300μL灭菌ddH2O洗脱，-20℃保存。
3.3.2重组质粒线性化
对于中量提取的提取pPIC9k-CTX-HCY质粒进行线性化，用Sal I线性化，线性化反应体系如下表3-1：
表3-1：pPIC9k-CTX-HCY质粒线性化反应体系
组分 体积(μL)
pPIC9k-CTX-HCY质粒 280
10×FastDigest buffer 160
Sal I 20
ddH<sub>2</sub>O 1140
共1600μL
(1)取灭菌的2mL离心管，按表2-1配置反应体系，混匀，瞬时离心。
(2)将溶液按400μL/管分装4管，在37℃水浴锅酶切30分钟。
(3)1％琼脂糖凝胶电泳线性化质粒。
(4)用天根通用型DNA纯化回收试剂盒(DP214-02)要求，洗脱时每管用50μLddH2O回收线性化质粒。
(5)将4管质粒合并，共200μL，45℃烘烤干燥浓缩质粒至10-20μL，-20℃保存。
3.3.3GS115毕赤酵母感受态制备
(1)挑取毕赤酵母菌株GS115单菌落，接种于5mL无菌YPD培养基中，29℃，200rpm，8小时。
(2)8小时后，吸取400μL培养液，接种于100mL无菌YPD培养基中，29℃，200rpm，摇床培养过夜。
(3)次日，吸取培养液1mL，稀释至10mL，以ddH2O对照调零，利用分光度计测定OD600，OD600值在1.1-1.7之间时，即可用于感受态制备。
(4)取培养液50mL，4℃，3000rpm，5min离心弃上清。
(5)用30mL已灭菌的冰预冷的ddH2O，将细胞悬浮，4℃，3000rpm，5min，离心弃上清。
(6)重复步骤5两次。
(7)用30mL已灭菌的冰预冷的1M D-山梨醇，将细胞悬浮，4℃，3000rpm，5min，离心弃上清。
(8)重复步骤7两次。
(9)取400μL已灭菌的冰预冷的1M D-山梨醇重悬细胞，即为感受态细胞。
(10)按90μL/支EP管，分装感受态细胞。
3.3.4线性化质粒的电转化及筛选
(1)75％乙醇浸泡2mm规格电击杯30min。
(2)无水乙醇冲洗3遍，超净工作台晾干。
(3)10μL线性化质粒加入到90μL感受态细胞中，混匀，再将100μL混合物转至2mm规格电击杯中，冰上预冷10min。
(4)设置电击参数，酵母参数为：电压2000V，电容25uF，电阻200Ω。
(5)电击杯迅速擦干外部水分，放入电击槽，电击。
(6)电击完毕后，立即加入1.5mL1M冰预冷D-山梨醇，混匀后，吸出菌液至1.5mL无菌离心管中。
(7)涂MD平板筛选，每块平板200μL菌液，无菌涂布器轻轻涂开，29℃，倒置培养3-4天。
(8)配制4mg/mL的G418平板，将步骤(7)MD平板中生长的单菌落用无菌牙签全部挑菌至G418平板，29℃，倒置培养4-5天。
(9)配制YPD平板，将步骤(8)G418平板中生长的单菌落用无菌牙签全部挑菌至YPD平板，29℃，倒置培养1-2天。
4.重组酵母转化子的鉴定
4.1物料：
2×Taq PCR Mastermix(天根生化)。
4.2设备
PCR仪(Bio-RAD)，离心机，微波炉，-80℃冰箱。
4.3方法：
4.3.1转化子基因组DNA提取
(1)根据YPD平板中生长的转化子数量，取EP管置于离心管架上，加入50μL双蒸水。
(2)牙签挑取YPD平板中生长菌落于EP管中，混匀，室温，4000rpm离心1min，弃上清。
(3)微波炉，中火，加热5min。
(4)-80℃冰箱冷冻20min。
(5)微波炉，中火，加热5min。
(6)-80℃冰箱冷冻20min。
(7)微波炉，中火，加热5min。
(8)加入50μL双蒸水，混匀后，室温，4000rpm离心1min。
(9)吸取离心上清液(基因组DNA)于无菌离心管中，-20℃保存。
4.3.2转化子基因组PCR鉴定
以提取的基因组DNA为模板，以插入的目标基因片段引物进行PCR鉴定，扩增出目的片段的菌株为阳性克隆。PCR反应体系如下表4-1：
表4-1：GS115/pPIC9k-CTX-HCY基因组DNA PCR反应体系
Figure BDA0003375706030000131
Figure BDA0003375706030000141
(1)取灭菌的EP管，按表4-1配置反应体系，混匀，瞬时离心。
(2)PCR程序设置：在PCR仪中设置如下程序
1)94℃，5min
2)94℃，30s(解链)
3)60℃，30s(退火)
4)72℃，1min(延伸)
5)步骤2至步骤4重复30个循环
6)72℃，5min
7)4℃，Forever
(3)根据PCR结果(如图2所示)，初步确定阳性转化子，用其对应菌株，进行摇瓶表达。平板放至-4℃保存。
5.GS115/pPIC9k-CTX-HCY酵母转化子在摇瓶中的表达
5.1物料：
BMGY培养基，BMMY培养基
5.2设备：摇床
5.3方法：
(1)挑取阳性克隆单菌落，接种于含有30mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，29℃，225rpm，摇床培养60小时。
(2)50mL离心管编号，将BMGY培养液倒入离心管中，室温，3000rpm离心5min收集摇瓶菌体。
(3)加入30mL灭菌双蒸水，重悬菌体。室温，3000rpm离心5min收菌体。
(4)重复步骤3两次。
(5)室温，3000rpm离心5min收菌体，加入30mL BMMY培养基重悬菌体，将30mL混匀的BMMY培养液倒入250mL三角瓶中，29℃，225rpm摇床培养。
(6)24小时时补充甲醇300μL。
(7)48小时时补充甲醇300μL。
(8)72小时时补充甲醇300μL。
(9)96小时时，收集摇瓶上清，-20℃储存。
(10)SDS-PAGE电泳检测摇瓶结果(如图3所示)，初步确认目标蛋白表达结果。
6.融合蛋白的纯化
6.1物料：
一水合柠檬酸(国药)、二水合柠檬酸三钠(国药)、氯化钠(国药)、CM-SepharoseFF。
6.2设备：
层析纯化系统。
6.3方法
利用CM-琼脂糖凝胶FF(CM-Sepharose FF)离子交换层析柱对融合蛋白的发酵液进行纯化，A相为pH为6.0的10mmol/L柠檬酸缓冲液，B相为A相+1MNaCl，3倍柱体积的A相平衡层析柱，上样，然后用A相+5％B相冲柱洗杂，再用10倍柱体积的A相+10％B相洗脱，收集洗脱液，最后将洗脱液透析脱盐冻干，获得融合蛋白纯品。
6.4结果
最终制备获得20g融合蛋白冻干粉，冻干粉检测电泳结果详见图4。
7.融合蛋白功效评估
7.1物料：
纯化水、甘油。
7.2设备：
Primos人体皮肤快速光学成像系统，面部图像分析系统VISIA。
7.3方法：
(1)供试品配制，取融合蛋白0.05％，甘油5％，纯化水补足至100％。
(2)选择两组，每组5人，分为对照组(纯化水、甘油制备)，样品组进行为期28天的实验。本发明将含有芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白的发酵组合物制备成为供试品，研究其在护肤品中的表现情况，通过功效评估，Primos、VISIA-CR图像采集分析皮肤皱纹和皮肤纹理，评估测试样品是否具有改善面部皱纹和纹理的效果，记录测试期间受试者满意度。
7.4结果：
7.4.1Primos数据分析
(1)Primos前额皮肤皱纹测试
由图5可知，供试品组7天，14天和28天，皮肤皱纹分析值逐渐减少，说明前额皮肤皱纹有所改善。对照组数值从使用前的7.54，降低到D28天的7.10，变化不明显。对比显示该供试品对前额皮肤皱纹的减轻有显著统计学差异，P均小于0.05。
(2)Primos外眼角皮肤皱纹测试
由图6可知，供试品组7天，14天和28天，皮肤皱纹分析值逐渐减少，说明皮肤外眼角皱纹有所改善。对照组数值从使用前的6.23，降低到D28天的6.10，变化不明显。对比显示该供试品对外眼角皱纹的减轻有显著统计学差异，P均小于0.05。
(3)Primos鼻唇沟皮肤皱纹测试
由图7可知，供试品组7天，14天和28天，皮肤皱纹分析值逐渐减少，说明鼻唇沟皮肤皱纹有所改善。对照组数值从使用前的5.48，降低到D28天的5.33，变化不明显。对比显示该供试品对鼻唇沟皱纹的减轻有显著统计学差异，P均小于0.05。
7.4.2VISIA图像采集分析
(1)VISIA-CR图像皱纹总面积分析
由图8可知，在使用样前，皮肤皱纹总面积2.24，在使用供试品8天后，测试区的皮肤皱纹总面积值2.05，皱纹面积显著减少；使用样品14天后，测试区域皮肤皱纹值1.88，，28天后，测试区域皮肤皱纹值1.57。对照组皮肤皱纹总面积从使用前的2.33，降低到了D28时的2.16，变化不明显。对比显示该供试品对脸部总体皱纹的减轻有显著统计学差异，P均小于0.05。
(2)VISIA图像分析
由VISIA图片脸颊纹理分析图9可知，在未使用时可以看到面部毛孔粗大，且密集度较高，在使用含供试品的护肤品14天后，面部的毛孔纹理开始减少，皮肤开始变细腻，使用含供试品的护肤品28天后，面部的毛孔明显变小，皮肤纹理进一步减少。说明该融合蛋白有细化毛孔，紧致肌肤的功效。
7.4.3受试者主观评价
受试者主观评价内容包含受试者皮肤弹性、细纹、紧致、纹理、毛孔、面部轮廓等方面的改善情况。在使用供试品28天后，88％的受试者认为肌肤感觉更有弹性，82％的受试者认为细纹看上去较不明显了，75％的受试者认为肌肤看起来更加紧致，83％的受试者认为肌肤纹理看起来更细腻，60％的受试者认为肌肤毛孔看起来有减小，55％的受试者认为面部轮廓更清晰了，78％的受试者认为机肤看起来更显年轻，90％的受试者认为皮肤更柔韧了，83％的受试者认为皮肤感觉更饱满了，85％的受试者认为皮肤更柔软了，82％的受试者认为皮肤看起来更平滑了。
8.细胞毒性检测
8.1物料
市售芋螺毒素、细胞培养液(中乔新舟)、MTT(克拉马尔)、纤维细胞L929(上海泽叶生物)
8.2设备
DP-SM3全自动酶标仪
8.3方法
样品制备：取融合蛋白及市售芋螺毒素，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液配制相同浓度0.1％，0.22μm过滤除菌。
用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液将培养的成纤维细胞L929(小鼠成纤维细胞)稀释配成6×103/mL的单细胞悬液；96孔培养板每孔接种100μL的细胞悬浮液，置含体积分数5％CO2培养箱中，37℃培养24h；弃去原培养液，每孔加入100μL融合蛋白组配制溶液、市售芋螺毒素组配制溶液、阴性对照组(单纯细胞培养液)和阳性对照组(4％DMSO)，每组8孔；将培养板移入37℃、体积分数5％CO2培养箱中，于接种后48h取出培养板，每孔再加入MTT(噻唑蓝)50μL，继续在37℃条件下培养2h，吸弃原培养液，立即加入二甲基亚砜，每孔150μL，室温放置并轻轻震荡10～15min；选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(A)，并计算细胞相对增殖率RGR(％)＝(实验组吸收值/阴性对照组吸收值)×100％。
细胞毒性反应分级标准(表7-1)
细胞相对增殖率(RGR) 反应分级
≥100 0级
80-99 1级
50-79 2级
30-49 3级
1-29 4级
0 5级
8.4结果
测试结果如表7-2所示。
表7-2
样品编号 融合蛋白组 市售芋螺毒素组
细胞增殖率RGR(％) 95.32％ 77.51％
根据表7-1和7-2的数据可得，融合蛋白细胞毒性为1级，而市售芋螺毒素的细胞毒性为2级，说明融合蛋白的生物安全性高于市售芋螺毒素，通过胶原蛋白融合表达，可以有效的降低芋螺毒素的细胞毒性；同时在分子设计时添加了透皮肽，其除皱和保湿能力经过功效验证，证明了透皮肽的加入可以有效的增加融合蛋白透皮吸收能力，促进了芋螺毒素的透皮吸收。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 西安德诺海思医疗科技有限公司
<120> 一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用
<141> 2021-11-25
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ser Leu Gly Cys Cys Trp Asn Pro Ala Cys Val Lys Asn Arg Cys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly Ser Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Ser Asn Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Gln Gly Ser Asn Gly Asn Pro Gly Pro Ala Gly Asn Gln
35 40 45
Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly
50 55 60
Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly Glu Pro Gly Ser Gln Gly Asn
65 70 75 80
Gln
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ser Leu Gly Cys Cys Trp Asn Pro Ala Cys Val Lys Asn Arg Cys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly
20 25 30
Lys Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Ser Asn Gly Glu Pro Gly Pro
35 40 45
Ala Gly Ser Pro Gly Glu Lys Gly Ser Gln Gly Ser Asn Gly Asn Pro
50 55 60
Gly Pro Ala Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly
65 70 75 80
Asn Pro Gly Lys Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly Glu
85 90 95
Pro Gly Ser Gln Gly Asn Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Asn Pro
100 105 110
Gly Lys Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Ser Asn Gly Glu Pro Gly
115 120 125
Pro Ala Gly Ser Pro Gly Glu Lys Gly Ser Gln Gly Ser Asn Gly Asn
130 135 140
Pro Gly Pro Ala Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro
145 150 155 160
Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly
165 170 175
Glu Pro Gly Ser Gln Gly Asn Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Asn
180 185 190
Pro Gly Lys Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Ser Asn Gly Glu Pro
195 200 205
Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Glu Lys Gly Ser Gln Gly Ser Asn Gly
210 215 220
Asn Pro Gly Pro Ala Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser
225 230 235 240
Pro Gly Asn Pro Gly Lys Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln
245 250 255
Gly Glu Pro Gly Ser Gln Gly Asn Gln Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg
260 265 270
Gln Ala Arg Ala
275
<210> 6
<211> 851
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcgagaaaa gaggcagtct gggctgctgt tggaatccag cctgcgtaaa gaaccgctgt 60
ggtggatctg gaggtagtgg tcctcccggc gaaccaggta atcctggtaa acctggttct 120
cccggcccag ctggttccaa cggggagccg ggtcctgccg gctcacccgg agaaaagggg 180
tcgcaaggta gtaatggcaa cccaggaccg gcagggaatc agggtcaacc tggcaacaaa 240
ggaagccccg ggaatccagg taagccgggc gagcctggat ctaacgggcc ccagggtgaa 300
ccaggctccc aaggaaatca aggtcctccc ggcgaaccag gtaatcctgg taaacctggt 360
tctcccggcc cagctggttc caacggggag ccgggtcctg ccggctcacc cggagaaaag 420
gggtcgcaag gtagtaatgg caacccagga ccggcaggga atcagggtca acctggcaac 480
aaaggaagcc ccgggaatcc aggtaagccg ggcgagcctg gatctaacgg gccccagggt 540
gaaccaggct cccaaggaaa tcaaggtcct cccggcgaac caggtaatcc tggtaaacct 600
ggttctcccg gcccagctgg ttccaacggg gagccgggtc ctgccggctc acccggagaa 660
aaggggtcgc aaggtagtaa tggcaaccca ggaccggcag ggaatcaggg tcaacctggc 720
aacaaaggaa gccccgggaa tccaggtaag ccgggcgagc ctggatctaa cgggccccag 780
ggtgaaccag gctcccaagg aaatcaatac gctagagctg ctgctagaca agctagagct 840
taagcggccg c 851

Claims (7)

1.一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由如下氨基酸肽段融合组成:
芋螺毒素肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
类人源胶原蛋白肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
连接肽肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
透皮肽肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
3.一种如权利要求1或2所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)基因的获得
人工设计并合成融合蛋白对应的核苷酸序列，如SEQ.ID.NO.6所示，在序列的两端直接加入酶切位点；
2)pPIC9k-CTX-HCY重组质粒的构建
利用XhoI和Not I限制性内切酶对人工合成的序列及毕赤酵母通用载体进行双酶切，酶切后回收对应的目的基因及载体，利用T4 DNA连接酶连接转化大肠杆菌，测序鉴定获得正确的pPIC9k-CTX-HCY重组质粒；
3)pPIC9k-CTX-HCY重组质粒转化GS115酵母感受态
pPIC9k-CTX-HCY重组质粒利用Sal I线性化后，对其进行纯化回收，然后对回收的200μL质粒置45℃烘箱中烘烤干燥浓缩质粒至10-20μL；之后利用电转化仪将pPIC9k-CTX-HCY重组质粒转化至毕赤酵母GS115，G418筛选高拷贝转化子；
4)重组酵母转化子的鉴定
采用冻融法提取转化子基因组DNA，PCR鉴定；
5)GS115/pPIC9k-CTX-HCY酵母转化子在摇瓶中的表达
利用BMGY和BMMY培养基对PCR鉴定正确的转化子进行摇瓶发酵表达，甲醇诱导发酵，SDS-PAGE电泳检测表达结果；
6)融合蛋白的纯化
利用CM-琼脂糖凝胶FF离子交换层析柱对融合蛋白的发酵液进行纯化，挂柱洗脱，收集洗脱液，最后将洗脱液透析脱盐冻干，获得融合蛋白。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1或2所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4或5所述的核酸分子。
7.根据权利要求1或2所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白、权利要求4或5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体在化妆品或医美产品中的应用。
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