CN117603365A - 一种重组胶原蛋白ⅰ型、ⅲ型、ⅵ型的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组胶原蛋白I型、III型、VI型的制备及其应用，所述重组胶原蛋白I型、III型、VI型是利用DNA重组技术将I型、III型、VI型进行串联，相比于单纯组分的重组胶原蛋白而言，重组胶原蛋白I型、III型、VI型更具备技术优势，其不仅可以融合各种胶原蛋白的优势，同时其具备良好的技术效果，促进上皮细胞及成纤维细胞增长，增加皮肤紧密度，令皮肤紧致，赋予弹性嫩滑，改善肌肤微环境。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白技术领域，更具体地，涉及一种重组胶原蛋白I型、III型、VI型的制备及应用。
背景技术
胶原蛋白最主要的基本结构单位是原胶原，是由三条相互缠绕的a链的多肽链组成的三重螺旋结构，长度大约为1000个氨基酸残基，该结构是所有胶原蛋白的典型特征结构，胶原蛋白含有包括人体生长所必须的七种氨基酸在内的二十多种氨基酸。胶原蛋白因其具有独特的结构特征，良好的物理性能、生物降解性和生物相容性，在医药、食品、化妆品、组织工程和材料工程等领域有广泛应用。
生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱或酶来处理动物组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮/鳞等)，从中提取胶原蛋白。这些方法虽然成本低廉、回收率较高，但是制取的胶原蛋白均为分子量很小且长度不等的混合胶原蛋白肽段，俗称明胶，很难起到保湿、滋养的效果；提取工艺简单粗放，产物纯度不佳，常有异味；动物来源，无法摆脱生物安全隐患，极大的限制了传统胶原在化妆品、食品、药品等各类产品中的广泛应用；加工提取时产生巨量废水严重伤害环境；技术门椹低，原料来源不易控制，造成皮鞋奶、毒胶囊横行，食品、药品安全隐患严重。为了解释传统动物胶原的一系列问题，许多学者开始着手应用生物技术来生产重组胶原，因微生物培养的种种便利，利用重组微生物生产胶原逐渐成为主流。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了重组胶原蛋白I型、III型、VI型的制备及应用。所述重组胶原蛋白I型、III型、VI型是利用DNA重组技术将I型、III型、VI型进行串联，相比于单纯组分的重组胶原蛋白而言，重组胶原蛋白I型、III型、VI型更具备技术优势，其不仅可以融合各种胶原蛋白的优势，同时其具备良好的技术效果，促进上皮细胞及成纤维细胞增长，增加皮肤紧密度，令皮肤紧致，赋予弹性嫩滑，改善肌肤微环境。
具体而言，本发明提供了一种重组胶原蛋白I型、III型、VI型，其特征在于，编码胶原蛋白I型的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，编码胶原蛋白III型的核苷酸序列如SEQ IDNO.2，编码胶原蛋白VI型的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
本发明还提供了一种重组胶原蛋白I型、III型、VI型的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1)成纤维细胞基因组DNA提取；
2)根据胶原蛋白I型、III型、VI型的核苷酸序列，利用引物设计软件获得重叠引物；
3)利用overlap PCR将胶原蛋白I型、III型、VI型进行重组连接，对对重组连接的PCR扩增产物进行胶回收备用。
优选地，步骤1)是采用通用型基因组DNA提取试剂盒提取成纤维细胞的基因组DNA，-20℃保存备用。
优选地，步骤2)中的重叠引物序列分别为SEQ ID NO.4-9所示。
优选地，步骤3)的具体步骤包括：
3.1)分别利用F1/R1、F2/R2、F3/R3进行第一次PCR扩增，PCR反应体系为50μL，包括20μL 10×PCR Buffer、15μL dNTP，上下游引物各3μL、5μL基因组DNA，4μL Taq DNA聚合酶；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃延伸30s，共计35个循环；72℃延伸10min；扩增产物进行胶回收备用；
3.2)将胶原蛋白I型、III型PCR扩增产物进行混合作为PCR扩增模板，利用F1/R2为进行第二次PCR扩增，PCR反应体系为50μL，包括20μL 10×PCR Buffer、15μL dNTP，上下游引物各3μL、5μL基因组DNA，4μL Taq DNA聚合酶；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃30s，57℃30s，72℃延伸30s，共计40个循环；72℃延伸10min；
3.3)将第二次PCR扩增产物与胶原蛋白VI型PCR扩增产物进行混合作为PCR扩增模板，利用F1/R3为进行第三次PCR扩增，，PCR反应体系为50μL，包括50μL，包括20μL 10×PCRBuffer、15μL dNTP，上下游引物各3μL、5μL基因组DNA，4μL Taq DNA聚合酶；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃延伸30s，共计45个循环；72℃延伸10min；
3.4)对第三次PCR扩增产物进行胶回收备用。
本发明的另一方面还提供了上述重组胶原蛋白I型、III型、VI型的发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备重组质粒
分别胶原蛋白I型、III型、VI型PCR扩增产物对模板，以pPIC9K载体，分解采用SaII限制性内切酶对上述模板和载体进行单酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取重组质粒；
(2)毕赤酵母电转化
采用EcoRI内切酶将步骤(1)得到的重组质粒进行线性化处理，将线性化重组质粒与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；
(3)转化子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到含有0.5g/LG418的YPD平板上培养72-96h，筛选获得转化子；
(4)重组胶原蛋白I型、III型、VI型的发酵
将筛选到的转化子接种于YPD液体培养基中，振荡培养24-36小时；作为一级种子转接于装有BMGY培养基的发酵罐中，pH值为5.0培养24-36小时；作为二级种子转接入装有FBS培养基的大罐发酵，生长温度30℃，pH值为5.0，溶氧控制在20％-30％，诱导发酵24-36小时；
(5)重组胶原蛋白I型、III型、VI型的纯化
将步骤(4)发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.1-0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为8-10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CM Sepharose FF进行离子交换层析，获得纯度＞98％的重组胶原蛋白I型、III型、VI型。
进一步地，本发明还提供了一种包含所述的重组胶原蛋白I型、III型、VI型编码基因的重组表达载体。
进一步地，本发明还提供了一种包含所述的重组胶原蛋白I型、III型、VI型编码基因的重组菌株。
另一方面，本发明还提供了上述重组胶原蛋白I型、III型、VI型在制备皮肤抗皱、紧致、修复、保湿产品中的用途。
优选地，所述产品包括化妆品。
本发明的优点如下：本发明首次提供了一种重组胶原蛋白I型、III型、VI型，所述重组胶原蛋白I型、III型、VI型是利用DNA重组技术将I型、III型、VI型进行串联，相比于单纯组分的重组胶原蛋白而言，重组胶原蛋白I型、III型、VI型更具备技术优势，其不仅可以融合各种胶原蛋白的优势，同时其具备良好的技术效果，促进上皮细胞及成纤维细胞增长，增加皮肤紧密度，令皮肤紧致，赋予弹性嫩滑，改善肌肤微环境。
附图说明
图1是本发明所述类人胶原蛋白对成纤维细胞的增殖分析；
图2是本发明所述类人胶原蛋白对成纤维细胞Elastin含量分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1一种重组胶原蛋白I型、III型、VI型的制备
一种重组胶原蛋白I型、III型、VI型的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)成纤维细胞基因组DNA提取：采用通用型基因组DNA提取试剂盒(货号YB790777，购自于上海钰博生物科技有限公司)提取成纤维细胞的基因组DNA，-20℃保存备用；
2)重叠引物设计：分别GenBenk中收录的胶原蛋白I型、III型、VI型为对象，利用引物设计软件获得重叠引物，具体序列如下表1所示：
3)利用overlap PCR将胶原蛋白I型、III型、VI型进行重组连接
3.1)分别利用F1/R1、F2/R2、F3/R3进行第一次PCR扩增，PCR反应体系为50μL，包括20μL 10×PCR Buffer、15μL dNTP，上下游引物各3μL、5μL基因组DNA，4μL Taq DNA聚合酶；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃延伸30s，共计35个循环；72℃延伸10min；扩增产物进行胶回收备用。
3.2)将胶原蛋白I型、III型PCR扩增产物进行混合作为PCR扩增模板，利用F1/R2为进行第二次PCR扩增，PCR反应体系为50μL，包括20μL 10×PCR Buffer、15μL dNTP，上下游引物各3μL、5μL基因组DNA，4μL Taq DNA聚合酶；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃30s，57℃30s，72℃延伸30s，共计40个循环；72℃延伸10min。
3.3)将第二次PCR扩增产物与胶原蛋白VI型PCR扩增产物进行混合作为PCR扩增模板，利用F1/R3为进行第三次PCR扩增，，PCR反应体系为50μL，包括50μL，包括20μL 10×PCRBuffer、15μL dNTP，上下游引物各3μL、5μL基因组DNA，4μL Taq DNA聚合酶；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃延伸30s，共计45个循环；72℃延伸10min。
3.4)对第三次PCR扩增产物进行胶回收备用。
表1重叠引物
其中，斜线部分表示限制性内切酶识别位点。
实施例2重组胶原蛋白I型、III型、VI型的发酵
(1)制备重组质粒
分别以实施例1制备得到的重组胶原蛋白I型、III型、VI型PCR扩增产物对模板，以pPlC9K载体，分解采用SaII限制性内切酶对上述模板和载体进行单酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取重组质粒；
(2)毕赤酵母电转化
采用EcoRI内切酶将步骤(1)得到的重组质粒进行线性化处理，将线性化重组质粒与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；
(3)转化子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到含有0.5g/LG418的YPD平板上培养72-96h，筛选获得转化子；
(4)重组胶原蛋白I型、III型、VI型的发酵
将筛选到的转化子接种于YPD液体培养基中，振荡培养24-36小时；作为一级种子转接于装有BMGY培养基的发酵罐中，pH值为5.0培养24-36小时；作为二级种子转接入装有FBS培养基的大罐发酵，生长温度30℃，pH值为5.0，溶氧控制在20％-30％，诱导发酵24-36小时；
(5)重组胶原蛋白I型、III型、VI型的纯化
将步骤(4)发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.1-0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为8-10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CM Sepharose FF进行离子交换层析，获得纯度＞98％的重组胶原蛋白I型、III型、VI型。
实施例3重组胶原蛋白I型、III型、VI型的皮肤抗皱测试
采用MTT细胞增殖检测试剂盒(型号M1020，购自北京百奥创新科技有限公司)检测实施例2制备得到的重组胶原蛋白I型、III型、VI型对成纤维细胞HFF-1的增殖影响。具体检测步骤可根据试剂盒说明书进行常规调整，其中，空白组为DMEM完全培养基，实验组1-3分别含有5、10、20ng/mL实施例2重组胶原蛋白I型、III型、VI型的DMEM完全培养基，对照组1-3分比为含有10ng/mL胶原蛋白I型或III型或VI型的DMEM完全培养基，阳性对照组为100ng/mL TGF-β1的DMEM完全培养基。各组中的细胞用量均在1×104个。
检测结果如图1所示，5ng/mL重组胶原蛋白I型、III型、VI型可以有效促进成纤维细胞的增殖，且存在剂量效应，剂量越大对成纤维细胞的促增长越显著。而对照组1-3的促增殖效果不如实施例2，证实本发明的重组胶原蛋白I型、III型、VI型具备润滑角质层，修护砖墙结构，促进上皮细胞及成纤维细胞增长。
实施例4重组胶原蛋白I型、III型、VI型的皮肤紧致测试
采用Elastin ELISA试剂盒(Human Elastin ELISA Kit，Abcam公司)操作说明书进行检测分析实施例2制备得到的重组胶原蛋白I型、III型、VI型对成纤维细胞HFF-1的Elastin含量影响，Elastin含量结果表示为Mean±SD。具体检测步骤可根据试剂盒说明书进行常规调整，其中，空白组为DMEM完全培养基，实验组含有10ng/mL实施例2类人胶原蛋白的DMEM完全培养基，阳性对照组为100ng/mL TGF-β1的DMEM完全培养基。各组中的细胞用量均在1×104个。
由图2可知，与空白组相比，经类人胶原蛋白作用后，成纤维细胞Elastin含量提高至1590.78±45pg/mL。说明类人胶原蛋白能够很好的促进成纤维细胞生成Elastin，增加皮肤紧密度，令皮肤紧致，赋予弹性嫩滑。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组胶原蛋白I型、III型、VI型，其特征在于，编码胶原蛋白I型的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，编码胶原蛋白III型的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，编码胶原蛋白VI型的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
2.权利要求1所述的重组胶原蛋白I型、III型、VI型的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1)成纤维细胞基因组DNA提取；
2)根据胶原蛋白I型、III型、VI型的核苷酸序列，利用引物设计软件获得重叠引物；
3)利用overlap PCR将胶原蛋白I型、III型、VI型进行重组连接，对对重组连接的PCR扩增产物进行胶回收备用。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)是采用通用型基因组DNA提取试剂盒提取成纤维细胞的基因组DNA，-20℃保存备用。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中的重叠引物序列分别为SEQ IDNO.4-9所示。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)的具体步骤包括：
3.1)分别利用F1/R1、F2/R2、F3/R3进行第一次PCR扩增，PCR反应体系为50μL，包括20μL10×PCR Buffer、15μL dNTP，上下游引物各3μL、5μL基因组DNA，4μL Taq DNA聚合酶；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃延伸30s，共计35个循环；72℃延伸1Omin；扩增产物进行胶回收备用；
3.2)将胶原蛋白I型、III型PCR扩增产物进行混合作为PCR扩增模板，利用F1/R2为进行第二次PCR扩增，PCR反应体系为50μL，包括20μL 10×PCR Buffer、15μL dNTP，上下游引物各3μL、5μL基因组DNA，4μL Taq DNA聚合酶；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃30s，57℃30s，72℃延伸30s，共计40个循环；72℃延伸10min；
3.3)将第二次PCR扩增产物与胶原蛋白VI型PCR扩增产物进行混合作为PCR扩增模板，利用F1/R3为进行第三次PCR扩增，，PCR反应体系为50μL，包括50μL，包括20μL 10×PCRBuffer、15μL dNTP，上下游引物各3μL、5μL基因组DNA，4μL Taq DNA聚合酶；PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃延伸30s，共计45个循环；72℃延伸1Omin；
3.4)对第三次PCR扩增产物进行胶回收备用。
6.权利要求1所述的重组胶原蛋白I型、III型、VI型的发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备重组质粒
分别权利要求2所述的胶原蛋白I型、III型、VI型PCR扩增产物对模板，以pPIC9K载体，分解采用Sall限制性内切酶对上述模板和载体进行单酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取重组质粒；
(2)毕赤酵母电转化
采用EcoRI内切酶将步骤(1)得到的重组质粒进行线性化处理，将线性化重组质粒与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；
(3)转化子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到含有0.5g/LG418的YPD平板上培养72-96h，筛选获得转化子；
(4)重组胶原蛋白I型、III型、VI型的发酵
将筛选到的转化子接种于YPD液体培养基中，振荡培养24-36小时；作为一级种子转接于装有BMGY培养基的发酵罐中，pH值为5.0培养24-36小时；作为二级种子转接入装有FBS培养基的大罐发酵，生长温度30℃，pH值为5.0，溶氧控制在20％-30％，诱导发酵24-36小时；
(5)重组胶原蛋白I型、III型、VI型的纯化
将步骤(4)发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用孔径为0.1-0.22μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，再用截留分子量为8-10KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后用CM Sepharose FF进行离子交换层析，获得纯度>98％的重组胶原蛋白I型、III型、VI型。
7.一种包含权利要求1所述的重组胶原蛋白I型、III型、VI型编码基因的重组表达载体。
8.一种包含权利要求1所述的重组胶原蛋白I型、III型、VI型编码基因的重组菌株。
9.权利要求1所述的重组胶原蛋白I型、III型、VI型在制备皮肤抗皱、紧致、修复、保湿产品中的用途。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品包括化妆品。
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