CN117624342B - 一种水解胶原的制备方法及其在皮肤上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种水解胶原的制备方法及其在皮肤上的应用。本发明首次利用基因工程方法实现了水解胶原的制备，并且经验证，本发明制备方法得到的水解胶原富含RGD系列片段，GER系列片段等氨基酸片段的功能，具有很好的修护皮肤的作用。本发明的水解胶原可高效率地促进成纤维细胞进行增殖，并分泌大量的I型和III型胶原用于皮肤组织修复。
Description
技术领域
本发明涉及皮肤修复技术领域，更具体地，涉及一种水解胶原的制备方法及其在皮肤上的应用。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。胶原蛋白含有包括人体生长所必须的七种氨基酸在内的二十多种氨基酸。胶原蛋白因其具有独特的结构特征，良好的物理性能、生物降解性和生物相容性，在医药、食品、化妆品、组织工程和材料工程等领域有广泛应用。
水解胶原蛋白是胶原蛋白水解的产物，水解使胶原蛋白的多肽键被打断,从而使溶解度差、不易被机体吸收的大分子胶原蛋白转化为水溶性好、易于被机体吸收的小分子多肽(相对分子质量约3000Da)，水解胶原蛋白的蛋白质含量高达92％以上,富含人体所需要的18种氨基酸和多种微量元素，现有水解胶原蛋白复合物合成工序较为复杂，产品稳定性差，导致水解蛋白质合成不稳定，且操作过程也需要简化，从而适合大面积进行推广使用。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种水解胶原的制备方法及其在皮肤上的应用。本发明制备方法得到的水解胶原富含RGD系列片段，GER系列片段等氨基酸片段的功能，具有很好的修护皮肤的作用。本发明的水解胶原可高效率地促进成纤维细胞进行增殖，并分泌大量的I型和III型胶原用于皮肤组织修复。
具体而言，本发明首先是提供了一种水解胶原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)构建含胶原蛋白的重组质粒；
2)构建含有水解酶的重组质粒；
3)将步骤1)和2)的重组质粒共同转入宿主细胞，进行高温发酵培养；
4)收集步骤3)发酵液，离心取上清备用；
5)分离纯化步骤4)中的上清液，即可得到水解胶原。
优选地，所述步骤1)中的胶原蛋白的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述步骤2)中的水解酶包括中性蛋白酶、胰酶、动物胶原酶。
优选地，所述中性蛋白酶的编码序列如SEQ ID NO.2所示，胰酶的编码序列如SEQID NO.3所示，动物胶原酶的编码序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述质粒选自pUC、pAC、pBluescript中的一种或几种。
优选地，所述步骤3)中的转入方法包括但不限于电转导、显微注射和基因枪。
优选地，步骤3)中的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌。
优选地，步骤3)中的高温发酵培养条件为将重组宿主细胞接种于发酵培养液中，维持发酵温度为65-85℃，pH在4.5-6.5之间进行发酵培养。
优选地，步骤4)中的离心条件为5000g 10-16h。
另一方面，本发明还提供了所述方法制备得到的水解胶原在制备修护皮肤产品中的用途，其特征在于，所述水解胶原富含RGD系列片段，GER系列片段。
本发明的优点如下：本发明首次利用基因工程方法实现了水解胶原的制备，并且经验证，本发明制备方法得到的水解胶原富含RGD系列片段，GER系列片段等氨基酸片段的功能，具有很好的修护皮肤的作用。本发明的水解胶原可高效率地促进成纤维细胞进行增殖，并分泌大量的I型和III型胶原用于皮肤组织修复。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
实施例1
一种水解胶原的制备方法，包括如下步骤：
1)构建含胶原蛋白的重组质粒：合成编码胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列通过酶切连接方式与pUC质粒进行重组。
2)构建含有水解酶的重组质粒：分别合成编码中性蛋白酶、胰酶和动物胶原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示，该所述编码序列分别通过酶切连接方式与pUC质粒进行重组。
3)将步骤1)和2)的重组质粒共同转入大肠杆菌BL21(DE3)中，进行高温发酵培养；其中所述高温发酵的条件为：将重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB发酵培养液中，37℃200rpm摇瓶培养，维持发酵温度为65℃，pH在4.5之间进行发酵培养。
4)收集步骤3)发酵液，离心取上清备用，离心条件为5000g 10h。
5)分离纯化步骤4)中的上清液，分离纯化是通过亲和柱层析进行，经洗脱和超滤浓缩即可得到水解胶原，经测定分析所述水解胶原富含RGD系列片段，GER系列片段。
实施例2
一种水解胶原的制备方法，包括如下步骤：
1)构建含胶原蛋白的重组质粒：合成编码胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列通过酶切连接方式与pAC质粒进行重组。
2)构建含有水解酶的重组质粒：分别合成编码中性蛋白酶、胰酶和动物胶原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示，该所述编码序列分别通过酶切连接方式与pUC质粒进行重组。
3)将步骤1)和2)的重组质粒共同转入大肠杆菌BL21(DE3)中，进行高温发酵培养；其中所述高温发酵的条件为：将重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB发酵培养液中，37℃200rpm摇瓶培养，维持发酵温度为75℃，pH在5.0之间进行发酵培养。
4)收集步骤3)发酵液，离心取上清备用，离心条件为5000g 14h。
5)分离纯化步骤4)中的上清液，分离纯化是通过亲和柱层析进行，经洗脱和超滤浓缩即可得到水解胶原，经测定分析所述水解胶原富含RGD系列片段，GER系列片段。
实施例3
一种水解胶原的制备方法，包括如下步骤：
1)构建含胶原蛋白的重组质粒：合成编码胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列通过酶切连接方式与pBluescript质粒进行重组。
2)构建含有水解酶的重组质粒：分别合成编码中性蛋白酶、胰酶和动物胶原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示，该所述编码序列分别通过酶切连接方式与pUC质粒进行重组。
3)将步骤1)和2)的重组质粒共同转入大肠杆菌BL21(DE3)中，进行高温发酵培养；其中所述高温发酵的条件为：将重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB发酵培养液中，37℃200rpm摇瓶培养，维持发酵温度为85℃，pH在6.5之间进行发酵培养。
4)收集步骤3)发酵液，离心取上清备用，离心条件为5000g 16h。
5)分离纯化步骤4)中的上清液，分离纯化是通过亲和柱层析进行，经洗脱和超滤浓缩即可得到水解胶原，经测定分析所述水解胶原富含RGD系列片段，GER系列片段。
实施例4
水解胶原对成纤维细胞增殖的影响：采用MTT细胞增殖检测试剂盒(型号22768，购自艾维缔科技怀来有限公司)检测实施例1-3任一项所述水解胶原对成纤维细胞HFF-1(货号ZB063，购自上海致备生物科技有限公司)的增殖影响。具体检测步骤可根据试剂盒说明书进行常规调整，其中，空白组为DMEM完全培养基，实验组1-3分别对应含有所述实施例1-3制备得到的水解胶原的DMEM完全培养基，对照组含有未经本发明所述方法进行水解的胶原蛋白的DMEM完全培养基，实验组和对照组中的细胞用量均在6×103个。
表1对成纤维细胞增殖分析
| 组别 | OD值 |
| 空白组 | 0.218±0.015 |
| 实验组1 | 0.689±0.057 |
| 实验组2 | 0.712±0.025 |
| 实验组3 | 0.752±0.039 |
| 对照组 | 0.326±0.026 |
检测结果如下表1所示：空白组不能促进成纤维细胞的增殖，而采用本发明实验组1-3任一项得到的水解胶原均可高效率地促进成纤维细胞进行增殖，且其促增殖效果明显优于对照组(P＜0.05)，归其原因是通过开放式高温发酵工艺发酵得到的水解胶原具有分子量小、肽的种类多，尤其是富含RGD系列片段，GER系列片段等氨基酸片段的功能，具有很好的修护皮肤的作用。
实施例5
水解胶原对成纤维细胞胶原蛋白分泌的影响：分别将不同处理组得到的成纤维细胞HFF-1进行24h培养，收集细胞，通过ELISA试剂盒(货号EH7533/EH2866,购自武汉菲恩生物科技有限公司)检测I型和III型胶原分泌情况。结果如表2所示。
| 组别 | I型胶原(ng/mL) | III型胶原(ng/mL) |
| 空白组 | 101±1.657 | 1.32±0.048 |
| 实验组1 | 482±4.351 | 7.89±0.112 |
| 实验组2 | 501±3.256 | 8.21±0.089 |
| 实验组3 | 556±2.987 | 8.95±0.054 |
| 对照组 | 165±1.986 | 3.26±0.042 |
从表2的结果可以看出，采用本发明实验组可以高效率地促进成纤维细胞分泌I型和III型胶原，该效果明显优于对照组(P＜0.05)，差异显著，具有统计学意义。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种水解胶原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)构建含胶原蛋白的重组质粒；其中，胶原蛋白的编码序列如SEQ ID NO.1所示；
2)构建含有水解酶的重组质粒；其中，水解酶包括中性蛋白酶、胰酶、动物胶原酶；所述中性蛋白酶的编码序列如SEQ ID NO.2所示，胰酶的编码序列如SEQ ID NO.3所示，动物胶原酶的编码序列如SEQ ID NO.4所示；
3)将步骤1)和2)的重组质粒共同转入宿主细胞，进行高温发酵培养；所述高温发酵培养条件为将重组宿主细胞接种于发酵培养液中，维持发酵温度为65-85℃，pH在4.5-6.5之间进行发酵培养；
4)收集步骤3)发酵液，离心取上清备用；
5)分离纯化步骤4)中的上清液，即可得到水解胶原。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒选自pUC、pAC、pBluescript中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的转入方法包括但不限于电转导、显微注射和基因枪。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中的离心条件为5000g 10-16h。
6.权利要求1-5任一项所述方法制备得到的水解胶原在制备修护皮肤产品中的用途，其特征在于，所述水解胶原富含RGD系列片段，GER系列片段。
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