CN105463006A

CN105463006A - 重组人表皮生长因子的新型制备方法

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Publication number: CN105463006A
Application number: CN201410462110.XA
Authority: CN
Inventors: 尹成凯
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-09-12
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2016-04-06

Abstract

人表皮生长因子（hEGF）是一种小分子多肽。主要利用其促进表皮细胞的增殖与生长，起到抗衰老和护肤保健等功能。所以，EGF添加于护肤品中有抗衰老、增加弹性等功能，对受损伤的皮肤，能自动地进行护理和修复。本发明提供工程菌株RoEGF-1和用其制备EGF的方法。包括根据大肠杆菌偏爱密码子合成hEGF基因；构建表达质粒pET27-S-EGF，能表达hEGF与标签S的融合蛋白；用表达质粒pET27-S-EGF转化宿主菌并筛选得到工程菌株RoEGF-1；将工程菌RoEGF-1在培养基中诱导表达rhEGF。该方法能够高效稳定表达可溶性高活性rhEGF且没有额外的氨基酸残基残留，可用于化妆品的应用。

Description

重组人表皮生长因子的新型制备方法

技术领域

该发明涉及生物化学领域中对人表皮生长因子的克隆表达，具体包括利用DNA重组以及发酵技术获得高产量和高活性的重组人表皮生长因子。

背景技术

人表皮生长因子（EGF）是一种由53个氨基酸残基组成的分子量为6kDa的小分子多肽。广泛存在于许多组织器官和体液中，可促进上皮细胞生长增殖，能够对皮肤起到保护作用。其主要是利用其促进皮肤组织细胞的增殖与生长，使年轻新生的细胞替代衰老的细胞，从而起到抗衰老和护肤保健等功能。所以，EGF添加于护肤品中有抗衰老、增加弹性等功能，对受损伤的皮肤，能自动地进行护理，调养和修复。本发明提供工程菌株RoEGF-1和用其制备EGF的方法。包括利用大肠杆菌偏爱密码子合成hEGF基因；构建表达质粒pET27-S-EGF，能够表达hEGF与蛋白标签S的融合蛋白；用表达质粒pET27-S-EGF转化宿主菌并筛选得到工程菌株RoEGF-1；将工程菌RoEGF-1在大肠杆菌培养基中用IPTG诱导表达rhEGF。该方法能够高效稳定表达可溶状态的rhEGF蛋白，没有包涵体沉淀且没有额外的氨基酸残基残留。

发明内容

本发明提供了：1）经过人工改良的更适合于大肠杆菌表达的人EGF基因序列；2）利用S标签与传统表达载体pET-27b(+)相结合，提高rhEGF蛋白的产量与活性，克服大肠杆菌原核表达所带来的包涵体不可溶性和不正确折叠引起的低活性等缺点。

工程菌株的构建：

天然人EGF由53个氨基酸残基组成，由159个碱基对组成的DNA进行编码。天然的人EGF的DNA序列在编码的密码子中有一些密码子并不是大肠杆菌所偏爱的编码，因此，基因序列的改良能够在一定程度上提高大肠杆菌表达人EGF蛋白的产量。

大肠杆菌表达蛋白有以下两个比较严重的缺陷，1是T7启动子比较强力，诱导表达蛋白的速度过快容易形成没有活性且不可溶的包涵体蛋白；2是由于原核生物体内没有糖基化系统，且体内环境与真核生物不同，不能有效地正确折叠形成正确的二硫键，从而造成蛋白有时虽可溶但没有或者很少有活性。为了克服这几个比较严重的缺陷，本发明在合成基因的同时加入了标签蛋白，S标签能够有效地增加蛋白在大肠杆菌中的表达产量，并且同时能够大幅度地帮助蛋白进行正确折叠，而且蛋白经过特殊蛋白酶切割后能够不残留多余的氨基酸残基。在融合蛋白的N端加入NcoI，C端加入BamHI的酶切位点，经过优化的DNA序列见图1与图2。将该序列与pET-27b(+)均用NcoI与BamHI酶切后进行连接并转化至DH5α菌种中进行扩增（具体见图3）。

将扩增出的表达载体质粒用化学转化的方式转化至Rosetta表达菌株中。利用该工程菌进行蛋白表达（具体见图4）。

该工艺是在现有的成熟的基因工程技术的基础上进行的改进发明，其中对于EGF基因DNA序列的优化是现今其他人所没有的；同时将标签的高表达性、辅助折叠特性与pET27载体的可靠性、高表达性相结合，表达出具有活性的EGF蛋白，该技术产量高活性好，基本没有蛋白包涵体沉淀，表达出的蛋白全部可溶；表达条件简单，仅为基础培养基，没有过多复杂的操作步骤与配方，成本低廉。另外，由于蛋白上有His组氨酸标签，所以在分离纯化上十分简便，回收蛋白纯度95%以上，实验证明带有His+S标签的蛋白也具有生物活性，如果对蛋白的要求不高可以不去除标签，这样的纯化方式更加简洁，如果对蛋白要求高，可以采用专用蛋白酶进行切割，去掉His+S标签，可以达到不残留氨基酸残基的水平。

实施例1：pET27b(+)-S-EGF重组载体质粒的构建

1、按照图1中所示的序列进行DNA合成。

2、将含有合成的基因（连接在克隆载体上）的细菌（XL10gold）穿刺培养物进行扩大培养，利用质粒提取试剂盒提取出含有S-EGF的质粒（操作按照试剂盒说明书进行）。

3、对提取出的质粒与pET27b(+)载体分别进行酶切。

酶切反应系统（100μl）组成为：

序号	名称	规格	单位	数量
					1	10 x NEB 3.1 buffer		微升	10
2	BamHI	20,000U/ml	微升	5
					3	NcoI	10,000U/ml	微升	5
4	S-EGF（质粒）	10μg	微升	5
					5	去离子水		微升	75

序号	名称	规格	单位	数量
					1	10 x NEB 3.1 buffer		微升	10
2	BamHI	20,000U/ml	微升	5
					3	NcoI	10,000U/ml	微升	5
4	pET27b(+)载体	10μg	微升	5
					5	去离子水		微升	75

将上述两个体系分别37度酶切孵育过夜。酶切后使用Qiagen胶回收试剂盒进行胶回收操作，获得S-EGF片段与线性pET27b(+)载体，测定浓度后备用。

4、将回收的片段与线性载体连接，体系组成（10μl）为：

序号	名称	规格	单位	数量
					1	pET27b(+)载体	10ng	微升	1
2	S-EGF片段	30ng	微升	3
					3	T4 Ligase（NEB）	400,000 U/ml	微升	0.5
4	10×T4 Ligation Buffer		微升	1
					5	去离子水		微升	4.5

上述体系混匀后，16度连接过夜。

将连接产物转化至DH5α感受态细胞中：

取连接产物3μl加入到一管感受态菌中，另一管不加任何物质作为阴性对照。冰浴30min，42℃水浴热激50sec，快速将其移入冰浴中，放置2min。加入400μl灭菌的LB液体培养基，37℃摇床中温和摇动1h后将加入连接产物的DH5α涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12~16h。挑选阳性菌落做DNA抽提，纯化出质粒DNA，即pET27-EGF，用于转化Rosetta表达菌宿主。

例2：Rosetta表达菌宿主的转化

将纯化后的pET27-EGF质粒DNA转化至Rosetta中，方法与转化DH5α感受态细胞的方法相同。

例3：EGF蛋白发酵表达与纯化

挑取含有表达载体pET27-EGF的Rosetta单菌落，接种于含有30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。次日取上述过夜培养物以1%的比例接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养2h，当OD600值至0.2时，加IPTG至终浓度0.25mmol/L，37℃继续培养，诱导5h。取出培养物于4℃以3000r/min离心20min，收集菌体。重悬Ni-NTA树脂，吸取20ml树脂于纯化柱中，先用LysingBuffer（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，10mmol/Limidazole）平衡层析柱。菌体用20mlLysingBuffer重悬并加溶菌酶至终浓度为1g/L，冰上放置30min，在冰上高强度超声破碎4次，每次破碎持续10sec，每次破碎间隔10sec。10000g4℃离心30min，收上清。将上清液加入层析柱中，与Ni-NTAAgarose颗粒4℃孵育1h，用WashingBuffer（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/Limidazole）洗涤5倍柱床体积以洗去杂蛋白，然后用2倍柱床体积的ElutionBuffer（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，250mmol/Limidazole）洗脱蛋白。洗脱蛋白可以用脱盐柱或者透析的方法进行脱盐，脱盐后的蛋白用于切割标签。

洗脱后的融合蛋白为S-rhEGF，带有S标签与6×His，用标签专用蛋白酶对融合蛋白进行特异性切割，可以无任何氨基酸残基残留（见图5）。

将脱盐后的融合蛋白加入DTT（至终浓度为2mmol/L）与蛋白酶（带有6×HisTag），蛋白：蛋白酶=10：1，4℃切割过夜。

由于切割下的标签、未被切割的剩余融合蛋白与蛋白酶均带有6×HisTag，而切下的EGF蛋白不带有任何多余氨基酸残基，因此可利用Ni-NTAAgarose去除切割后的杂蛋白。将切割产物与Ni-NTAAgarose充分混合后于4℃结合2h，收集流出的液体，用PBS（pH7.4）将非特异性吸附的EGF洗脱，收集上清后与之前的流出物合并即为去掉标签的EGF。蛋白在滤菌并检测浓度后即可用于细胞增殖培养实验。

通过SDS-PAGE与WB实验可以鉴定出EGF有效表达（见图6、7）。

例4：蛋白活性检测比较

Balb/c3T3细胞株用完全培养液于37度、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0x10⁵~5.0x10⁵个细胞，传代后24~36小时用于生物学活性测定。

弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0x10⁴~8.0x10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100ul，于37度、5%二氧化碳条件下培养。24小时后观察贴壁后换成维持培养液，于37度、5%二氧化碳条件下培养24小时。弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100ul，于37度、5%二氧化碳条件下培养64~72小时。每孔加入10ulCCK-8，置于培养箱中3小时，用酶标仪在450nm处检测吸光值。

完全培养液：10%FBS的DMEM

维持培养液：0.4%FBS的DMEM

标准品：用维持培养液稀释至每1ml含50IU。在96孔板中做倍数稀释，共3个稀释度，每个浓度做2孔。

供试品溶液的制备：将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每1ml约含50IU。在96孔板中做倍数稀释，共3个稀释度，每个浓度做2孔。

通过活性检测，通过该技术表达的融合蛋白有高于国家标准的增殖活性。实验结果见附图8。

附图说明：

图1

合成基因序列，斜体+下划线为酶切位点；下划线为优化后rhEGF基因序列；未划线为标签序列

图-2

优化后的人EGF基因序列以及翻译成蛋白质的序列。

图3

重组人EGF表达质粒构建示意图。

图4

表达载体表达蛋白示意图

图5

蛋白纯化切割示意图

图6

Lane1：未诱导菌体

Lane2-6：诱导时间1h-5h

Lane7：Ni-NTA纯化后融合蛋白

Lane8：蛋白酶切割后

Lane9：去除蛋白酶与标签的EGF蛋白

图7

Lane1-5：重组人EGF蛋白WB检测

图8

重组人EGF蛋白的生物学活性与标准品活性结果比较。

5'AATTCAGATTCTGAATGCCCGCTGTCTCACGACGGTTACTGCCTTCACGATGGTGTTTGCATGTATATCGAAGCTCTGGACAAATACGCGTGCAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAACGTTGCCAGTACCGTGATCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAA3’。

Claims

1.重组人表皮生长因子的制备方法，包括以下步骤：

用大肠杆菌偏爱的密码子构建和克隆合成的S-hEGF融合蛋白基因；

构建表达质粒pSE-1；

用表达质粒pSE-1转化宿主菌并筛选得到工程菌株RoEGF-1。

2.如权利要求1所述的方法，其中利用大肠杆菌偏爱密码子编码的人EGF序列为：

3.在Rosetta宿主菌中利用pET-27b(+)载体与His-SUMO标签相结合用来表达优化后的人EGF基因的方法。

4.利用该方法生产的重组人EGF蛋白应用于化妆品。