CN100523172C - 高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100523172C CN100523172C CNB2004100185432A CN200410018543A CN100523172C CN 100523172 C CN100523172 C CN 100523172C CN B2004100185432 A CNB2004100185432 A CN B2004100185432A CN 200410018543 A CN200410018543 A CN 200410018543A CN 100523172 C CN100523172 C CN 100523172C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- zadaxin
- people
- gene
- genetic engineering
- engineering bacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。该基因工程菌为大肠杆菌DH5α或BLR(DE3)，其携带的质粒中含有n个表达人α1-胸腺肽的基因，其中，n为1到16的整数，质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac，如质粒pET系列。在DNA水平上，将含有人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联为多串体，构建成一系列表达载体，转化大肠杆菌，获得一系列高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌。用该基因工程菌可批量制备人α1-胸腺肽样品。本发明的优点在于，用本发明构建的基因工程菌生产人α1-胸腺肽样品，产量高，纯化工艺简单，生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
人α1-胸腺肽(α1-thymosin，Tα1)在体内主要存在于胸腺细胞、T-淋巴细胞以及胸腺组织中，在肝、肾、心、肺、脾等器官也有分布。成熟的人α1-胸腺肽由28个氨基酸组成，分子量3.108KD，其序列为：Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-ILe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-1ys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。体内由111个氨基酸组成的前体α1-胸腺肽原(prothymosin)经酶解加工产生。人α1-胸腺肽在人体血清中的正常浓度大约为540-670pg/mL，其主要生理功能为调节机体的免疫活性，包括刺激多能干细胞分化为胸腺细胞，促进T-细胞的分化和成熟，增强T细胞的功能，并使CD3+和CD4+等细胞的数量升高。人α1-胸腺肽可促进白介素α(IL-1α)、白介素2(IL-2)、白介素(IL-3)，干扰素α及γ(IFN-α，IFN-γ)以及迁移抑制因子(migratory inhibitory factor)的表达。淋巴细胞在受有丝分裂原或抗原刺激后，人α1-胸腺肽可使其产生的IL-2高亲和力受体数量增加。此外人α1-胸腺肽还与细胞周期的调控，血管生长，细胞迁移，组织修复以及精子的穿透能力等相关。
做为一种广谱免疫调节剂，人α1-胸腺肽可能临床用途有如下几个方面：(1)用于治疗乙型、丙型肝炎。(2)作为免疫辅助药物。(3)用于肿瘤治疗。(4)用于艾滋病治疗。(5)促进血管生长及组织修复和伤口愈合剂等。国内胸腺肽制备大多是从动物胸腺中提取，由于提取物为混合物，有效成分浓度低，疗效不够理想，且混合物中含动物蛋白，注射时可能会引起过敏反应。近年国外人α1-胸腺肽药品，采用化学合成方法制备，商品名为“日达仙”，治疗乙型、丙型肝炎以及肿瘤等疾病效果显著。但每支“日达仙”含量为1.6mg，价格为800元以上，一个疗程为5万多元，价格昂贵，普通病人难以承受。仅以乙型肝炎为例，全球约有20亿人曾经感染过乙型肝炎病毒，其中有3.5亿患者转化为乙型肝炎病人。中国为乙型肝炎高发病率国家之一，估计约有1.2亿乙型肝炎病人。要治疗这些病人，全靠进口人α1-胸腺肽药品，将会给国家和个人带来沉重的经济损失和精神负担。因此迫切需要研制国产化的高效低价的人α1-胸腺肽样品。
发明内容
为生产成本低的人α1-胸腺肽样品，首先得找到并构建一种高效表达人α1-胸腺肽，即能生产人α1-胸腺肽的基因工程菌。
本发明要解决的一个技术问题是提出一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌。该基因工程菌具有以下结构：该基因工程菌为大肠杆菌，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因。
本发明的进一步特征在于，大肠杆菌为DH5α或BLR(DE3)。
本发明的进一步特征在于，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因的个数为n，n为1到16的整数。
本发明的进一步特征在于，质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac。
本发明的进一步特征在于，大肠杆菌为DH5α或BLR(DE3)，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因的个数为n，n为1到16的整数，质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac，含此类启动子的质粒为质粒pET系列。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建方法。本发明通过采用以下技术方案解决以上技术问题，其特征在于，在DNA水平上，将含有人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联为多串体，构建成一系列表达载体，转化大肠杆菌，获得一系列高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌。
现详细说明本发明的技术方案。
一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
第一步 碱基序列合成
将人α1-胸腺肽基因根据大肠杆菌基因翻译的偏爱密码子进行改造，然后按照：SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子的碱基序列进行化学合成，将该片段克隆至大肠杆菌pMD18-T载体中，所述的纯化标签为His·Tag或GST，所述的蛋白酶为肠激酶(EK)或凝血酶(thrombin)或Xa因子(Factor Xa)；
第二步构建含单个人α1-胸腺肽基因的DNA序列的基因工程菌
将含人α1-胸腺肽基因的DNA序列克隆到合适的大肠杆菌质粒载体上，得到含有单串人α1-胸腺肽基因的DNA序列的质粒，所述的基因工程菌为大肠杆菌DH5α或BLR(DE3)，所述的质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac。
第三步构建多串表达人α1-胸腺肽的基因工程菌
利用同尾酶的特性或限制性内切酶粘末端补平后与限制性内切酶平末端相连接的方法，将单串含α1-胸腺肽基因的DNA序列定向克隆为多聚体，至此，构建成了表达人α1-胸腺肽的基因工程菌，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的数目为1到16的整数，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位是：SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子。
本发明的技术方案的进一步特征在于，在上述第三步中所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位是：启动子-SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子。
本发明的技术方案的进一步特征在于，在上述第三步中所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位是：SD序列—纯化标签—硫氧还蛋白—蛋白酶切位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子。
本发明的技术方案的进一步特征在于，在上述第三步中所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位是：启动子-SD序列—纯化标签—硫氧还蛋白—蛋白酶切位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子。
在上述的构建过程中，所有质粒、大肠杆菌均可从市场购得。
本发明要解决的另一个技术问题是提出表达人α1-胸腺肽的基因工程菌生产人α1-胸腺肽样品的用途。
本发明通过以下的技术方案解决上述技术问题。其特征在于，具体操作步骤如下：
第一步液体培养
将上述构建好的表达人α1-胸腺肽的基因工程菌在液体培养基中培养至0D600nm＝0.4—0.8时，加入终浓度为0.4—1mM的IPTG进行诱导表达3—5小时，产生和积累可溶性表达的人α1-胸腺肽蛋白，所述的基因工程菌为大肠杆菌BLR(DE3)，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的数目为1到16的整数；
第二步纯化制备人α1-胸腺肽蛋白
离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人α1-胸腺肽融合蛋白组分，用截留分子量为1KD-5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2mg/mL以上；
第三步制备人α1-胸腺肽样品
用蛋白酶或化学试剂裂解人α1-胸腺肽融合蛋白，在4-37℃裂解2—16小时，终止反应，然后再次进行亲和层析，收集吸收峰，冷冻干燥，得到人α1-胸腺肽样品，所述的蛋白酶为肠激酶EK、凝血酶、Xa因子。
通过本发明所制备的人α1-胸腺肽按文献(“合成胸腺素α1的生物活性研究”，药物生物技术，1998，5(2)：103或按文献“牛胸腺肽的提取及活性检测”，动物医学进展，2002，23(5)：66-69)进行活性测定，与化学合成的α1-胸腺肽具有相同的生物学活力。
本发明的优点在于：(1)通过基因工程技术的方法生产人α1-胸腺肽，比化学合成方法成本低；(2)通过基因工程技术的方法构建含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的基因工程菌，大大提高了人α1-胸腺肽的表达量；(3)通过在人α1-胸腺肽基因的DNA序列的N端加入纯化标签，只要进行一次亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的人α1-胸腺肽融合蛋白，纯化步骤简便，比传统技术的多次层析更易于操作。(4)通过在人α1-胸腺肽基因的DNA序列的N端加入蛋白酶酶切位点，C端加入终止密码子，只要进行一次酶解便能得到人α1-胸腺肽样品，纯化极为简便，得率高。
因而用本发明提供的基因工程菌及利用该菌生产人α1-胸腺肽，产量高，纯化工艺简化，生产成本较低。
附图说明
下面的附图用于说明本发明的具体实施方案。
图1质粒pET-32a-Tα1-2c的构建，其中该质粒含n＝2个人α1-胸腺肽基因。
图2质粒pET-32a-Tα1-8c的构建，其中该质粒含n＝8个人α1-胸腺肽基因。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步详述本发明。说明书及以下实施例中所用质粒、菌体等，以及未注明具体条件的实验方法，可按常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。
实施例1 构建一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌：含有1-16个SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联单位的基因工程菌。下述的pET32a(+)质粒购自Novagen公司。
第一步碱基序列合成
按人α1-胸腺肽的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，合成以下长度为206bp的片断：
XbaISD-Sequence
5’-CCtctagaAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCTGGA
Met Ser Gly
His·Tag KpnI
TCAGGTCATCATCATCATCATCATTCTTCTggtaccGATGACGACGACAAG
Ser Gly His His His His His His Ser Ser Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys
EK
AGCGATGCCGCCGTGGATACCAGCAGCGAAATTACCACCAAAGATCTGAAA
Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys
SpeI EcoRI
GAAAAAAAAGAAGTGGTGGAAGAAGCCGAAAACTAAGactagt gaattcAC—3’
Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn End
将该片段克隆至大肠杆菌pMD18-T载体中(上海博雅生物技术有限公司合成)。该片断含有SD序列、纯化标签His·Tag、肠激酶EK位点、人α1-胸腺肽(Tα1)基因、终止密码子TAA以及限制性内切酶XbaI、KpnI、SpeI和EcoRI位点，其中XbaI、SpeI是一对同尾酶。
第二步构建含单个SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA DNA序列的基因工程菌
提取pMD18-T质粒，用XbaI/EcoRI双酶切后纯化回收小片断；同时将质粒pET-32a(+)用XbaI/EcoRI双酶切，回收大片段。连接上述回收产物并转化到大肠杆菌DH5α中扩增。得到含有单串SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的质粒pET-32a-Tα1-1c(1c代表融合基因单体，2c代表融合基因的双体，以此类推)。
第三步构建多串高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌
利用XbalI和SpeI同尾酶，将质粒pET-32a-Tα1-1c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的二聚体质粒pET-32a-Tα1-2c(图1)。将pET-32a-Tα1-2c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到Tα1基因的四聚体质粒pET-32a-Tα1-4c。重复上述步骤，可以得到SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的八聚体质粒pET-32a-Tα1-8c(图2)。将质粒pET-32a-Tα1-8c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的十六聚体质粒pET-32a-Tα1-16c。将构建好的质粒转化至大肠杆菌BLR(DE3)中，-70℃保藏。
以上第二步所述的质粒也可以用质粒pET41a(+)代替，得到相同的结果。
实施例2构建一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌：含有1-16个P—SD—His·Tag—EK—Tα1—TAA串联单位的基因工程菌。所述的P为启动子(Promotor，P)。
第一步碱基序列合成
同实施例1。
第二步构建含单个P-SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA DNA序列的基因工程菌
提取pMD18-T质粒，用XbaI/EcoRI双酶切后纯化回收小片断；同时将质粒pET-32a(+)用XbaI/EcoRI双酶切，回收大片段。连接上述回收产物并转化到大肠杆菌DH5α中扩增。得到含有单串P-SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的质粒pET-32a-Tα1-1c(1c代表融合基因单体，2c代表融合基因的双体，以此类推)。
第三步构建多串高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌
利用质粒pET-32a(+)上的T7启动子前的限制性内切酶ClaI以及多克隆位点上的限制性内切酶Hind III和Sal I完成。将质粒pET-32a-Tα1-1c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用Hind III酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-Tα1-1c用Sal I/Hind III双酶切，回收大片段。ClaI酶切后补平的平末端和SalI酶切的平末端可以连接，从而得到P—SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的二聚体质粒pET-32a-P-Tα1-2c。将质粒pET-32a-P-Tα1-2c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用Hind III酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-P-Tα1-2c用SalI/Hind III双酶切，回收大片段。将两段回收产物连接后转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到P—SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联基因的四聚体质粒pET-32a-P-Tα1-4c。重复上述步骤，可以得到P—SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的八聚体质粒pET-32a-P-Tα1-8c。将质粒pET-32a-P-Tα1-8c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用Hind III酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-P-Tα1-8c用Sal I/Hind III双酶切，回收大片段。将两段回收产物连接后转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到P—SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联基因的十六聚体质粒pET-32a-P-Tα1-16c。将构建好的质粒转化至大肠杆菌BLR(DE3)中，-70℃保藏。
以上第二步所述的质粒也可以用质粒pET41a(+)代替，得到相同的结果。
实施例3构建一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌：含有1-16个SD—TrxA—His·Tag—EK—Tα1—TAA串联单位的基因工程菌。所述的TrxA为硫氧还蛋白。
第一步碱基序列合成
同实施例1。
第二步构建含单个SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA DNA序列的基因工程菌
提取pMD18-T质粒，用KpnI/EcoRI双酶切后纯化回收小片断；同时将质粒pET-32a(+)用KpnI/EcoRI双酶切，回收大片段。连接上述回收产物并转化到大肠杆菌DH5α中扩增。由于质粒pET-32a(+)为一硫氧还蛋白融合蛋白表达系统，故可得到含有单串SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的质粒pET-32a-TrxA-Tα1-1c(1c代表融合基因单体，2c代表融合基因的双体，以此类推)。
第三步构建多串高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌
利用XbalI和SpeI是同尾酶，将质粒pET-32a-TrxA-Tα1-1c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的二聚体质粒pET-32a-TrxA-Tα1-2c。将pET-32a-TrxA-Tα1-2c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的四聚体质粒pET-32a-TrxA-Tα1-4c。重复上述步骤，可以得到SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的八聚体质粒pET-32a-TrxA-Tα1-8c。将质粒pET-32a-TrxA-Tα1-8c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的十六聚体质粒pET-32a-TrxA—Tα1-16c。将构建好的质粒转化至大肠杆菌BLR(DE3)中，-70℃保藏。
以上第二步所述的质粒也可以用质粒pET41a(+)代替，得到相同的结果。
实施例4构建一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌：含有1-16个P—SD—TrxA—His·Tag—EK—Tα1—TAA串联单位的基因工程菌。
第一步碱基序列合成
同实施例1。
第二步构建含单个P-SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA序列的基因工程菌
提取pMD18-T质粒，用KpnI/EcoRI双酶切后纯化回收小片断；同时将质粒pET-32a(+)用KpnI/EcoRI双酶切，回收大片段。连接上述回收产物并转化到大肠杆菌DH5α中扩增。得到含有单串P-SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的质粒pET-32a-TrxA-Tα1-1c(1c代表融合基因单体，2c代表融合基因的双体，以此类推)。
第三步构建多串高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌
将质粒pET-32a-TrxA-Tα1-1c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用Hind III酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-TrxA-Tα1-1c用SalI/Hind III双酶切，回收大片段。将两段回收产物连接后转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到P—SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联基因的二聚体质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-2c。将质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-2c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用Hind III酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-2c用SalI/Hind III双酶切，回收大片段。将两段回收产物连接后转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到P—SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的四聚体质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-4c。重复上述步骤，可以得到P—SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的八聚体基因质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-8c。将质粒pET-32a-P-TrxA—Tα1-8c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用Hind III酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-8c用SalI/Hind III双酶切，回收大片段。将两段回收产物连接后转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到P—SD-TrxA—His·Tag-EK--Tα1-TAA基因的十六聚体质粒pET-32a-P-TrxA—Tα1-16c。将构建好的质粒转化至大肠杆菌BLR(DE3)中，-70℃保藏。
以上第二步所述的质粒也可以用质粒pET41a(+)代替，得到相同的结果。
实施例5一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的应用，即用所述的基因工程菌生产人α1-胸腺肽样品。下述的亲和层析介质为NTAO树脂，购自Novagen公司，下述的肠激酶EK，购自NEB公司。
第一步液体培养
将构建好的实施例1中含有1-16串SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因多聚体的基因工程菌在LB液体培养基中培养至0D600nm＝0.4—0.8时，加入终浓度为0.4—1mM的IPTG进行诱导表达3—5小时，产生和积累可溶性表达的人α1-胸腺肽融合蛋白。
第二步纯化制备人α1-胸腺肽融合蛋白
离心收集菌体，用NTAO缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行NTAO树脂亲和层析，收集α1-胸腺肽融合蛋白组分，用截留分子量为1KD-5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2mg/mL以上；
第三步制备人α1-胸腺肽样品
用肠激酶酶解解人α1-胸腺肽融合蛋白，在4-37℃裂解2—16小时，终止反应，然后再次进行NTAO树脂亲和层析，收集吸收峰，冷冻干燥，得到人α1-胸腺肽样品。
以上第二步所述的NTA亲和层析介质，也可以用Glutathione-Sepharose4B亲和层析介质代替，得到相同的结果。Glutathione-Sepharose4B可购自Novagen公司。
以上第三步所述的肠激酶也可用凝血酶、Xa因子代替，得到相同的结果。若采用凝血酶，实施例1-4中第一步的DNA序列GACGACGACGACAAG，可换为CTGGTGCCACGCGGTAGT；若采用Xa因子，实施例1-4中第一步的DNA序列GACGACGACGACAAG，可换为ATCGAAGGTCGT；经过这样的变动，可以得到相似的结果。
凝血酶、Xa因子可购自Novagen公司。
以上描述的具体实施方式旨在阐述本发明的最佳实施方式而不是以任何形式限制本发明。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本发明专利申请权利要求的范围内。
thymosin.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>华东师范大学
<120>高效表达人a1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用
<130>说明书、权利要求书
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>206
<212>DNA
<213>人(human sapiens)
<400>1
<210>2
<211>48
<212>PRT
<213>人(human sapiens)
<400>2
Claims (6)
1.一种表达人α1-胸腺肽的基因工程菌，具有以下结构：该基因工程菌为大肠杆菌，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因，其特征在于，大肠杆菌为DH5α或BLR(DE3)，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因的个数为n，n为1到16的整数，质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac。
2.权利要求1所述的表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
第一步碱基序列合成
将人α1-胸腺肽基因根据大肠杆菌基因翻译的偏爱密码子进行改造，然后按照：SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子的碱基序列进行化学合成，将该片段克隆至大肠杆菌pMD18-T载体中，所述的纯化标签为His·Tag或GST，所述的蛋白酶为肠激酶(EK)或凝血酶(thrombin)或Xa因子(Factor Xa)；
第二步构建含单个人α1-胸腺肽基因的DNA序列的基因工程菌
将含人α1-胸腺肽基因的DNA序列克隆到合适的大肠杆菌质粒载体上，得到含有单串人α1-胸腺肽基因的DNA序列的质粒，所述的基因工程菌为大肠杆菌DH5α或BLR(DE3)，所述的质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac；
第三步构建多串表达人α1-胸腺肽的基因工程菌
利用同尾酶的特性或限制性内切酶粘末端补平后与限制性内切酶平末端相连接的方法，将单串含α1-胸腺肽基因的DNA序列定向克隆为多聚体，所述的基因工程菌为大肠杆菌DH5α或BLR(DE3)，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位是：SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的数目为1到16的整数，至此，构建成了表达人α1-胸腺肽的基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建方法，其特征在于，在第三步中所述的含α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位为：启动子-SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点—α1-胸腺肽基因—终止密码子。
4.根据权利要求2所述的表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建方法，其特征在于，在第三步中所述的含α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位为：SD序列—纯化标签—硫氧还蛋白—蛋白酶切位点—α1-胸腺肽基因-终止密码子。
5.根据权利要求2所述的表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建方法，其特征在于，在第三步中所述的含α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位为：启动子-SD序列—纯化标签—硫氧还蛋白—蛋白酶切位点—α1-胸腺肽基因—终止密码子。
6.权利要求1所述的表达人α1-胸腺肽的基因工程菌生产人α1-胸腺肽样品的用途，其特征在于，具体操作步骤如下：
第一步液体培养
将构建好的权利要求1所述的基因工程菌在液体培养基中培养至0D600nm＝0.4—0.8时，加入终浓度为0.4—1mM的IPTG进行诱导表达3—5小时，产生和积累可溶性表达的人α1-胸腺肽蛋白，所述的基因工程菌为大肠杆菌BLR(DE3)，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的数目为1到16的整数；
第二步纯化制备人α1-胸腺肽蛋白
离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人α1-胸腺肽蛋白组分，用截留分子量为1KD-5KD的Millipore AmiconUltra-15超滤管将蛋白浓缩至2mg/mL以上；
第三步制备人α1-胸腺肽样品
用蛋白酶裂解人α1-胸腺肽蛋白，在4-37℃裂解2—16小时，终止反应，然后再次进行亲和层析，收集吸收峰，冷冻干燥，得到人α1-胸腺肽样品，所述的蛋白酶为肠激酶EK、凝血酶、Xa因子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100185432A CN100523172C (zh) | 2004-05-21 | 2004-05-21 | 高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100185432A CN100523172C (zh) | 2004-05-21 | 2004-05-21 | 高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1616652A CN1616652A (zh) | 2005-05-18 |
| CN100523172C true CN100523172C (zh) | 2009-08-05 |
Family
ID=34763316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004100185432A Expired - Fee Related CN100523172C (zh) | 2004-05-21 | 2004-05-21 | 高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100523172C (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102191303A (zh) * | 2010-11-26 | 2011-09-21 | 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 | 基因重组Tα1的表达和制备方法 |
| CN102660568B (zh) * | 2012-03-28 | 2013-05-08 | 江苏海王生物制药有限公司 | 一种重组胸腺肽α1的制备方法 |
| CN102978228A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-03-20 | 厦门北大之路生物工程有限公司 | 一种重组虎纹克胰肽载体及其制备方法和用途 |
-
2004
- 2004-05-21 CN CNB2004100185432A patent/CN100523172C/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 重组人胸腺肽α1工程菌的高密度发酵. 颜真等.药物生物技术，第7卷第4期. 2000 |
| 重组人胸腺肽α1工程菌的高密度发酵. 颜真等.药物生物技术，第7卷第4期. 2000 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1616652A (zh) | 2005-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100579986C (zh) | 一种生产促胰岛素分泌肽glp-1(7-36)及glp-1类似物的方法 | |
| CN109966484B (zh) | 一种免疫增强剂、制备方法、禽流感疫苗和应用 | |
| CN101429519A (zh) | 重组人胰岛素样生长因子-1(igf-1)融合蛋白的制备方法 | |
| CN100392070C (zh) | 表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN100523172C (zh) | 高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN108794638A (zh) | 一种重组牛长效干扰素α及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN112480227A (zh) | 一种提高鲟鱼抵抗病原菌能力的蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN105463006A (zh) | 重组人表皮生长因子的新型制备方法 | |
| CN101544693B (zh) | 重组胸腺素α1二串体蛋白及其制备方法 | |
| CN101497863B (zh) | 一种制备N-末端乙酰化的胸腺素α1的方法及其专用工程菌 | |
| EP0645454A2 (en) | Chimeric somatostatin containing protein and coding DNA, immunogenic compositions and method for increasing farm animal productivity | |
| CN113999318B (zh) | 一种重组鸡干扰素融合蛋白及其应用 | |
| CN105420174A (zh) | 一种表达重组vegf融合蛋白的基因工程菌的构建 | |
| CN101580846A (zh) | 一种用于防治肝硬化的人源细胞珠蛋白及其制备方法 | |
| CN101045923B (zh) | 生产一种白细胞介素类似物的方法 | |
| CN101089181A (zh) | 重组人白细胞介素－4的生产方法 | |
| CN108794644A (zh) | 一种由牛白细胞介素2、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN108794645A (zh) | 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN114196691B (zh) | 一种制备防治牛、羊棘球蚴病多表位重组疫苗的基因、蛋白质、疫苗和应用 | |
| CN107365390A (zh) | 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN101434957B (zh) | 重组人干扰素α2b DNA片段及编码的蛋白质 | |
| CN107254001A (zh) | 一种由犬白蛋白与犬干扰素γ组成的融合蛋白及其制备方法和一种重组犬长效干扰素γ | |
| CN107383202A (zh) | 一种由鸡白蛋白、鸡干扰素γ和鸡白细胞介素2组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN107253999A (zh) | 一种重组羊长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN101906424B (zh) | 一种重组人干扰素α2b DNA片段及编码的蛋白质 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Hainan Zhonghe Pharmaceutical Co., Ltd. Assignor: East China Normal University Contract record no.: 2010990000498 Denomination of invention: Gene engineering bacteria of high efficiency expression of human alpha 1-thymulin and its construction method and use Granted publication date: 20090805 License type: Exclusive License Open date: 20050518 Record date: 20100709 |
|
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090805 Termination date: 20130521 |