CN102191303A

CN102191303A - 基因重组Tα1的表达和制备方法

Info

Publication number: CN102191303A
Application number: CN2010105603789A
Authority: CN
Inventors: 丁宇; 岳妙姝; 杨子义; 干玉; 李光伟
Original assignee: Beijing Haiyan Pharmaceutical Industry Co Ltd Yangzijiang Pharmaceutical Ind
Current assignee: Beijing Haiyan Pharmaceutical Industry Co Ltd Yangzijiang Pharmaceutical Ind
Priority date: 2010-11-26
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2011-09-21

Abstract

本发明是关于基因重组Tα1的表达和制备新方法，各个步骤经过优化后，简捷高效，选用对环境和人员无害的原材料，便于操作和规模放大。优化后的方法流程如下：(1)用密码子优化后的碱基序列，构建大肠杆菌高效表达工程菌株；(2)工程菌的发酵表达采用IPTG诱导法诱导表达融合蛋白；(3)目的多肽的分离采用Ni金属螯合、蛋白酶切、Capto Q和S100纯化；(4)纯化获得的多肽经过理化、活性分析鉴定，与设计的一致。

Description

基因重组Tα1的表达和制备方法

技术领域：

本发明是关于基因重组Tα1的制备工艺，重点是经密码子优化后的工程菌构建、发酵表达与纯化的工艺。

技术背景：

慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Viral Hepatitis B，CH-B)是一种严重危害人类健康的常见病，慢性乙肝的防治是一个全球性公共卫生问题，已引起世界各国的关注。我国乙型肝炎病毒(HBV)感染率高达57.63％，目前有现症慢性乙肝患者2000多万人，每年有23.7万人死于乙型肝炎相关的疾病。Tα1是一种生物反应调节因子，主要是T淋巴细胞的免疫增强剂，对NK及LAK等免疫细胞也有协同作用。此外它能促进免疫细胞释放IL-2和合成IL-2等免疫分子。目前在临床上Tα1广泛应用于慢性乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、肝细胞癌及增强免疫疾病的联合治疗。

Tα1在体内半衰期长，每周只需注射2次，同时停药后仍有较长时间的治疗作用；并且具有极高的安全性，自1997年Tα1在中国上市后，数以万计病者使用过本品，约少于0.5％病者出现过敏性皮疹，及偶尔在注射部位疼痛的报告。

Tα1多肽的制备方法有动物组织提取法、化学合成法和基因重组法。目前用化学合成法的比较多，已上市的日达仙即为化学合成的，但是合成仪器昂贵、成本较高，过程涉及有害化学物质。基因重组法易于规模放大，对环境影响小，制备成本低。

研究内容：

本发明提供的Tα1生产方法，采用基因重组工程菌表达蛋白，制备工艺步骤简捷高效，所用材料低毒，易于规模放大。

研究内容包括表达工程菌的构建、工程菌发酵表达、目的蛋白的纯化工艺和活性理化性质分析鉴定。

1.工程菌的构建：

内容包括根据密码子偏爱性设计序列、合成全基因序列、酶切连接转导，构建了以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌、以pET32a(+)为表达载体的Tα1融合表达系统。Tα1的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性，确定基因序列如下：

5′-AGCGATGCGGCGGTGGATACCAGCAGCGAAATTACCACCAAAGATCTGAAAGAAAAAAAAGAAGTGGTGGAAGAAGCGGAAAAC-3′

基因序列由北京三博远志生物技术有限公司合成。pET32a(+)克隆载体购自Invitrogen公司，E.coli BL21(DE3)宿主菌购自Invitrogen公司。工程菌构建完成后，经表达质粒酶切鉴定、目的片段DNA测序鉴定，结果表明工程菌构建正确。

2.工程菌发酵表达

确立了工程菌株后，通过对种子培养基、接种浓度、发酵培养基、发酵过程参数的摸索，确定工艺步骤如下：

(1)：将冻存种子按1∶100接种于含100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基，在37℃、180rpm下摇瓶培养约8-10小时，为一级种子液；

(2)：将一级种子液按适当比例接种于含适量抗生素的LB培养基，在37℃、200rpm下摇瓶培养约10-16小时，OD₆₀₀＝2.0～3.0时为二级种子；菌体此时处于对数生长期初期，生长旺盛，更容易适应新的生长环境；

(3)：二级种子液接种比例为1∶10接种入发酵起始培养基；发酵过程培养温度控制在37℃，氨水调节pH至7.00±0.2，溶氧率通过搅拌速度和通气量维持在30％以上，用20％的泡敌溶液做消泡剂，根据发酵过程各培养阶段工程菌生长补料。

在M9发酵培养基加葡萄糖培养工程菌生长达OD₆₀₀8.0～10.0密度时，一次性加入IPTG开始诱导，开始IPTG诱导。诱导培养要保证适合浓度的碳源和氮源，维持溶氧率在20％以上，诱导表达3.5小时终止发酵离心收菌。此种方式，适合于中试及以上规模，诱导培养时间容易掌握。

3.目的蛋白的纯化工艺

研究内容包括融合蛋白的捕获、肠激酶酶切融合蛋白、酶切混合物的纯化。本发明提供的纯化工艺是亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析相组合的方法。该工艺简化了流程，节省时间、试剂耗材，易于放大。

具体步骤如下：

(1)：Ni-Sepharose 6FF亲和层析法捕获带His-S-Trx标签的Tα1融合蛋白；

(2)：适宜浓度的肠激酶酶切融合蛋白，得到标签蛋白与目的多肽的混合液；

(3)：Capto Q纯化，得到较高纯度的目的多肽；

(4)：S100纯化，得到高纯度的目的多肽，其中流动相可以换为制剂缓冲液。

4.活性理化性质分析鉴定

经SDS-PAGE电泳、HPLC、质谱、相应的细胞活性检测分析鉴定，获得的目的多肽与设计的完全一致。

具体实施方式：

实施例一

IPTG诱导液补料发酵培养

(1)：将冻存种子按1∶100接种于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的20mL/瓶LB培养基1瓶，在37℃、180rpm下摇瓶培养约10小时，为一级种子液；

(2)：将一级种子液按1∶100接种于含100μg/mLAmp的200mL/瓶LB培养基5瓶，在37℃、200rpm下摇瓶培养约12小时，为二级种子；

(3)：二级种子液接种比例为1∶10接种入9L基础培养基(培养基成分g/L：glucose 3-5，tryptone 10，yeast extract 5，KH2P04 3，Na2HP04·12H2017.1，NH4C11.0，MgSO4·7H200.72，NaCI 0.5)的发酵罐；温度控制在37℃，氨水调节pH至7.0±0.2，初始搅拌速度为300rpm，通过逐步增加搅拌速度和通气量维持溶氧量在30％以上。

约2～2.5h后，OD₆₀₀上升至2.5-3.0，一次性补加300mL碳源和氮源(glucose 200g/L：yeast extract 200g/L：tryptone 200g/L为2∶1∶2)；当OD₆₀₀上升为6.0-7.0时一次性补加300mL碳源和氮源(glucose 200g/L：yeast extract 200g/L：tryptone 200g/L为1∶1∶2)。当OD₆₀₀上升为8-10时，添加IPTG至终浓度0.5mM开始诱导，诱导3.5h后收菌。经离心后称重共获得湿菌350克。

取诱导3h、3.5h的菌体，相同浓度超声破碎，取上清。经15％SDS-PAGE胶检验，分子量约为20KD，目的蛋白表达量约为15～20％，见图2。

实施例二

目的多肽的纯化

菌体处理：取100g湿菌，溶于1.0L Tris缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，30mM咪唑)中，超声破碎，4℃，9000rpm离心30min，取上清，0.45μm滤膜过滤。

(1)：选用含100mL Ni Sepharose 6FF柱料的柱子，经平衡(30mM咪唑)、上样(30mM咪唑)、清洗(60mM咪唑)、洗脱(100～150mM咪唑)，收集Tα1融合蛋白；

(2)：将Ni柱洗脱用G25换液至酶切缓冲液(50mMTris，50mMNaCl)，加入合适浓度的肠激酶，25～37度酶切12～24h；

(3)：选用含5mL Capto Q柱料的柱子，以50mM HAc-NaAc，PH5.0，电导6.0mS/cm为流动相A，以50mM HAc-NaAc，500mM NaCl，PH5.0为流动相B；流速1.5mL/min，线性梯度洗脱，收集各组分；

(4)：选用含470mL S100柱料的柱子，以50mM碳酸氢铵为流动相；上样6mL，流速2.5mL/min，收集各组分。

经检测，收集的目的多肽组分纯度为98.1％；纯化制备过程见图3、4。

在用S100时可将流动相换为制剂缓冲液。Tα1多肽纯化过程的Tris-Tricine电泳图见图5、6。

实施例三

部分性质分析鉴定

(1)纯度检测：选用C4色谱柱(100mm×4.6mm)，检测波长为214nm，柱温30℃，流速0.8mL/min；以H2O(0.1％TFA)为流动相A，以乙腈(0.1％TFA)为流动相B；线性梯度洗脱从20％B到60％B。结果表明：目的多肽纯度为98.1％。见图7。

(2)分子量检测：基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF，ABI-4700型)进行分子量测定，结果表明：所纯化多肽的分子量为3067.92，与理论值基本一致；见图8。

(3)细胞体外活性检测

取小试管6支，其中3支各加hanks液0.1ml作对照管，另3支各加供试品溶液0.1ml作测定管，每管中各加T细胞悬液0.2ml(每ml含有3*106～5*106个T细胞)，37度保温1小时后，加入绵羊红血球悬液0.2ml(每ml含有3*107～5*107个红血球)，摇匀，以每分钟500转离心3分钟，放入4度冰箱过夜。

次日取出，弃去上清液，每管中各加入固定液一滴，轻轻摇匀，静置10分钟，加入染色液2滴并摇匀，静置15分钟后开始计数，显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大方格上所有的淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的E玫瑰花结形成的细胞(结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞)，求得结合百分率，取平均值，即为供试品管或对照管的平均值，见图9。

附图说明：

图1：工程菌的质粒目的序列测序图；

图2：IPTG诱导发酵培养过程，融合蛋白表达图；

各泳道是不同诱导时间的菌体裂解上清，分别为1：收菌；2：诱导3小时；3：诱导前4小时；4：诱导前3小时；5：诱导前2小时；6：诱导前1小时；7：诱导前0小时。

图3：Capto Q纯化过程，在线检测图

图4：S100纯化过程，在线检测图；

图5：Capto Q纯化过程的Tris-Tricine图

各泳道分别为1：肠激酶酶切融合蛋白混合物；2：分部收集的第7管；3：分部收集的第9管；4：分部收集的第11管；5：分部收集的第13管；6：分部收集的第15管；7：分部收集的第17管；8：分部收集的第20管；9：分部收集的第22管；

图6：S100纯化过程的Tris-Tricine图

各泳道分别为1：Capto Q洗脱分部收集的第7管至第13管合并样品；2：分部收集的第5管；3：分部收集的第6管；4：分部收集的第7管；5：分部收集的第8管；6：分部收集的第10管；7：分部收集的第11管；8：分部收集的第12管；9：分部收集的第14管；

图7：目的多肽的HPLC纯度分析图

图8：目的多肽的质谱分析图

图9：目的多肽的细胞活性检测分析表

菌种保藏说明

本菌种是根据密码子偏爱性设计序列、合成全基因序列、酶切连接转导，构建了以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌、以pET32a(+)为表达载体的Tα1融合表达系统。Tα1的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性确定，基因序列如文中所述，经检定结果表明工程菌构建正确。本菌种构建简单，易于实现，无需保藏。

Claims

1.采用经密码子优化的序列构建工程菌，经过发酵表达、纯化，获得高纯度的目的多肽；多肽经理化活性分析鉴定，与设计的一致。

2.如权利要求1所述，目的多肽的碱基序列如文中所述；

3.如权利要求1所述，目的多肽的纯化经金属螯合捕获融合蛋白→肠激酶酶切。酶切后的混合蛋白采用Capto Q和S100获得高纯度目的蛋白。