CN101993851A - 基因重组Exendin-4的表达和制备新方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于基因重组Exendin-4的表达和制备新方法，各个步骤经过优化后，简捷高效，缩小了所需时间空间，选用对环境和人员无害的原材，便于操作和规模放大。优化后的方法流程如下：(1)用密码子优化后的碱基序列，构建大肠杆菌工程菌株；(2)工程菌的发酵表达采用乳糖诱导法；(3)纯化工艺中，目的多肽的分离采用制备级C4柱反相纯化；(4)所纯化的多肽经过理化、活性分析鉴定，与设计的一致。

Description

基因重组Exendin-4的表达和制备新方法

技术领域：

本发明是关于基因重组制备Exendin-4的工艺，重点是经优化后的工程菌构建、发酵表达、纯化的工艺。

技术背景：

近二十年来，随着人们生活方式的改变，糖尿病患病率急剧升高。全球糖尿病患者已近2.5亿，并且以10％以上的速度递增。目前我国糖尿病患者已逾7000万，并且糖尿病患者增长率是欧美国家的2倍。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1)受体激动剂为II型糖尿病的治疗提供了新的思路。此类药物促胰岛素分泌作用呈明显的血糖依赖性，低血糖发生几率低；同时改善胰岛β细胞功能并促进β细胞增殖，并且可以减轻体重，降低血压，在II型糖尿病治疗领域具有独特优势，成为近来糖尿病治疗领域的研究热点。

人体内源性激动剂GLP-1在可以被DPPIV和中性肽链内切酶24.11迅速降解，体内半衰期仅1-2min。

Exendin-4是从希拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液中分离得到的，其具有GLP-1相同的调控血糖功能，并且这一天然化合物对DPPIV具有很高的耐受性，在体内的稳定性远高于GLP-1，体内半衰期达2-4小时。Exendin-4的临床实验效果充分体现了GLP-1受体激动剂的优势，每天注射两次，控制血糖、降低体重的效果良好。并且其优势还在于不需要根据糖化血红蛋白(HbA1c)或血糖水平来调整剂量，在早餐和晚餐前给予固定剂量即可，从而减少监测血糖的不便。该药物已由美国Amylin和礼来合作开发上市，最初批准和二甲双胍、磺脲类药物联合使用治疗使用口服降糖药未能取得良好效果的II型糖尿病患者。2009年10月，FDA批准扩大Byetta的适应症，可用于单一疗法，结合饮食和锻炼控制血糖。

Exendin-4多肽的制备方法有化学合成法和基因重组法，目前用化学合成法的比较多，已上市的Byetta是化学合成的。但是合成仪器昂贵、成本较高，过程涉及有害化学物质。基因重组法易于规模放大，对环境影响小，制备成本低。

研究内容：

本发明提供的Exendin-4生产方法，采用基因重组法，步骤简捷，安全高效，周期短，易于规模放大。

研究内容包括表达工程菌的构建、工程菌发酵表达、目的蛋白的纯化工艺和活性理化性质分析鉴定。

1.工程菌的构建：

内容包括根据密码子偏爱性设计序列、合成全基因序列、酶切连接转导，构建了以大肠杆菌BL21(DE3)plysS为宿主菌、以pET32a(+)为表达载体的Exendin-4融合表达系统。全基因序列中包括构建克隆所需的BglII、XhoI酶切位点、肠激酶酶切位点，序列如“序列表”所述。基因全序列的合成、BL21(DE3)plysS宿主菌都购自invitrogen公司；pET32a(+)表达载体购自Novagen公司，是基因重组表达的常用菌株，融合蛋白表达量高、可溶性高、便于捕获纯化。

工程菌构建完成后，经目的片段测序鉴定，结果表明工程菌构建正确。

2.工程菌发酵表达

本发明的工程菌发酵采用乳糖诱导法。以葡萄糖、乳糖为碳源，在优先利用葡萄糖后，添加乳糖为碳源，同时诱导融合蛋白表达。而常用的诱导剂IPTG，对人体有潜在的毒性，价格也比较昂贵；乳糖诱导则兼备提供碳源、无毒、价格低，也可获得诱导产生相同量的表达蛋白。如果试验设计合理，还可减少了补加诱导剂步骤，操作简便，减少污染机会。

确立了工程菌株后，通过对种子培养基、接种浓度、发酵培养基、发酵过程参数的摸索，确定工艺步骤如下：

(1)：将冻存种子按1∶100接种于含50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基，在37℃、180rpm下摇瓶培养约8-12小时，为一级种子液；

(2)：将一级种子液按适当比例接种于含适量抗生素的LB培养基，在37℃、200rpm下摇瓶培养约6-8小时，OD₆₀₀＝2.0～3.0时为二级种子；菌体此时处于对数生长期初期，生长旺盛，更容易适应新的生长环境；

(3)：二级种子液接种比例为1∶10接种入发酵起始培养基；发酵过程培养温度控制在37℃，氨水调节pH至7.00±0.2，溶氧率通过搅拌速度和通气量维持在30％以上，用20％的泡敌溶液做消泡剂，根据发酵过程各培养阶段工程菌生长补料。

工程菌生长达合适密度时，开始乳糖诱导。诱导培养要保证适合浓度的乳糖碳源和氮源，维持溶氧率在20％以上，诱导表达3.5小时终止发酵离心收菌。乳糖诱导发酵可选择①批式培养：初始培养基含有葡萄糖(5-10g/L)和乳糖(5g/L)，大肠杆菌在优先利用葡萄糖后，用自行启动乳糖做碳源，既可促进菌体生长，又可促进蛋白表达。但是若乳糖浓度过高，则会产生抑制作用。批式培养适合摇瓶培养摸索乳糖浓度和小试规模。②乳糖诱导液补料培养：在M9发酵培养基加葡萄糖培养工程菌至合适密度时，开始流加乳糖和酵母提取物的诱导培养液。此种方式，适合于中试及以上规模，乳糖浓度相对恒定，诱导培养时间容易掌握。

3.目的蛋白的纯化工艺

研究内容包括融合蛋白的捕获、肠激酶酶切融合蛋白、酶切混合物的纯化。其中第三步，与以往的二次Ni柱收集流穿的粗分离，结合SOURCE反相、离子交换的精细纯化相比，本发明提供的C4反相工艺实现了一步纯化得99％以上纯品的目标。该工艺简化了流程，节省时间、空间、试剂耗材，易于规模放大。

具体步骤如下：

(1)：Ni-Sepharose 6FF亲和层析法捕获带His-S-Trx标签的Exendin-4融合蛋白；

(2)：适宜浓度的肠激酶酶切融合蛋白，得到标签蛋白与目的多肽的混合液；

(3)：制备级HPLC的C4反相柱纯化，得到高纯度的目的多肽；后续可通过Superdex30或SephadexG-25将目的多肽置换到制剂溶液中。

4.活性理化性质分析鉴定

经SDS-PAGE电泳、HPLC、质谱、相应的细胞活性检测分析鉴定，获得的目的多肽与设计的完全一致。

具体实施方式：

实施例一

摇瓶批式发酵，摸索乳糖诱导浓度

(1)：将冻存种子按1∶100接种于含50μg/mL Amp的20mL/瓶LB培养基1瓶，在37℃、180rpm下摇瓶过夜培养；

(2)：将上述种子液按1∶100接种于含50μg/mLAmp的200mL/瓶LB培养基7瓶，在37℃、200rpm下培养；约2小时后，OD₆₀₀＝0.6时，开始诱导，分别加入0g/L乳糖、3g/L乳糖、6g/L乳糖、9g/L乳糖、12g/L乳糖、15g/L乳糖、0.4mMIPTG。37℃继续培养4h，收菌。

(3)取相同重量的每份菌产物，稀释为相同浓度，超声破碎，取上清，观察蛋白表达量(见图2)。

实施例二

乳糖诱导液补料发酵培养

(1)：将冻存种子按1∶100接种于含50μg/mL Amp的20mL/瓶LB培养基1瓶，在37℃、180rpm下摇瓶培养约12小时，为一级种子液；

(2)：将一级种子液按1∶100接种于含50μg/mLAmp的200mL/瓶LB培养基5瓶，在36℃、200rpm下摇瓶培养约8小时，为二级种子；

(3)：二级种子液接种比例为1∶10接种入9L基础培养基(培养基成分g/L：glucose 2.5，tryptone 10，yeast extract 5，KH₂PO₄2，K₂HPO₄4，NaH₂PO4·12H₂O 7，(NH₄)₂SO₄1.2，NH₄C10.2，MgSO₄·7H₂O 0.2，NaCI 1)的发酵罐；温度控制在37℃，氨水调节pH至7.0±0.2，初始搅拌速度为250rpm，通过逐步增加搅拌速度和通气量维持溶氧量在30％以上。

约2～2.5h后，溶氧急剧上升到80％以上时，按0.2～0.3mL/L/min的速度补加20％葡萄糖溶液(glucose 200g/L，yeast extract 50g/L)，60～120min后停止。此时OD₆₀₀为11～13，首次快速加入至乳糖终浓度9g/L，之后按0.15～0.3mL/L/min的速度补加乳糖诱导液(lactose200g/L，yeast extract 50g/L)，诱导5h后收菌。经离心后称重共获得湿菌400克。

取诱导0h、1h、2h、3h、4h、5h的菌体，相同浓度超声破碎，取上清。经15％SDS-PAGE胶检验，分子量约为21KD，目的蛋白表达量约为15～20％(见图3)。

实施例三

目的多肽的纯化

菌体处理：取100g湿菌，溶于1.0L Tris缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl)中，超声破碎，4℃，8000rpm离心20min，取上清，0.45μm滤膜过滤。

(1)：加20mL1M咪唑于细胞裂解液，使上样缓冲液含20mM咪唑；选用含100mLNiSepharose 6FF柱料的柱子，经平衡(20mM咪唑)、上样(20mM咪唑)、清洗(40mM咪唑)、洗脱(100～150mM咪唑)，收集Exendin-4融合蛋白；

(2)：用50mMTris溶液将融合蛋白稀释到酶切缓冲液(50mMTris，50mMNaCl，15～25mM咪唑)，加入合适浓度的肠激酶，30～37度酶切6～12h；

(3)：选用制备级HPLC的C4反相柱(250mm×10mm)，检测波长为214nm，柱温30℃；以H₂O(0.1％TFA)为流动相A，以乙腈(0.1％TFA)为流动相B；上样100mL，流速4.0mL/min，线性梯度洗脱，收集第11峰，其保留时间为16.470(见图4)。

经检测，收集的目的多肽组分纯度为99.8％。

后续可用SephadexG-25将目的多肽置换到制剂缓冲液中。Exendin-4多肽纯化过程的Tris-Tricine电泳图(见图5)。

实施例四

部分性质分析鉴定

(1)纯度检测：选用C4色谱柱(100mm×4.6mm)，检测波长为214nm，柱温30℃，流速0.8mL/min；以H₂O(0.1％TFA)为流动相A，以乙腈(0.1％TFA)为流动相B；线性梯度洗脱从20％B到60％B。结果表明：目的多肽纯度为99％(见图6)。

(2)分子量检测：基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF，ABI-4700型)进行分子量测定，结果表明：所纯化多肽的分子量为4186.4，与理论值一致(见图7)。

(3)细胞体外活性检测：选用大鼠胰岛素瘤细胞株RINm-5F，接种处于对数生长期的细胞1.0X105个/mL，100μL于96孔板→培养2天后，待细胞长至90％覆盖率→换为无血清1640培养基，饥饿孵育2h→用1640培养基将样品和对照品预稀释到一定浓度，然后做2倍系列稀释梯度，用此稀释梯度刺激10min→去上清，收集细胞，用R&D公司的cAMP酶免试剂盒检测各样品中的cAMP值。

经数据处理分析，用Exendin-4样品浓度的lg值做X轴，cAMP值做Y轴；样品与参考品的四点直线回归部分：R²(参考品)＝0.96、R²(样品)＝0.95，斜率无显著性差异，活性与参考品相当(见图8)。

附图说明：

图1：工程菌的质粒目的序列测序图；

图2：批式培养发酵工艺过程，融合蛋白表达图

各泳道是不同诱导剂作用下产生的菌体裂解上清，诱导剂分别为1：0g/L乳糖；2：3g/L乳糖；3：6g/L乳糖；4：9g/L乳糖；5：12g/L乳糖；6：15g/L乳糖；7：0.4mMIPTG；M：Marker。

图3：乳糖诱导液补料发酵培养过程，融合蛋白表达图

各泳道是发酵过程不同时间点样品的裂解上清，分别是1：诱导0h；2：诱导1h；3：诱导2h；4：诱导3h；5：诱导4h；6：诱导5h；M：Marker。

图4：纯化过程，在线检测图；

图5：纯化全程及目的多肽的Tris-Tricine图

各泳道分别为1：工程菌发酵诱导前上清；2：工程菌发酵诱导后上清；3：Ni Sepharose6FF亲和纯化融合蛋白；4：肠激酶酶切融合蛋白混合物；5：C4反相柱纯化后原液的3μL上样；M：Marker；6：C4反相柱纯化后原液的6μL上样；7：C4反相柱纯化后原液的10μL上样；

图6：目的多肽的HPLC纯度分析图；

图7：目的多肽的质谱分析图；

图8：目的多肽的细胞活性检测分析图。

序列表：

<110>扬子江药业集团北京海燕药业有限公司

扬子江药业集团

<120>基因重组Exendin-4的表达和制备新方法

<160>1

<170>Patentln 3.3

<210>1

<211>148

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含酶切位点

<400>1

agatctggac gacgacgaca agcatggtga aggtaccttc accagcgatc tgtctaagca    60

aatggaagag gaggccgtgc gtctgtttat tgaatggctg aaaaacggtg gcccaagctc    120

tggcgcgccg ccaccaagct gactcgag                                       148

菌株构建补充说明：

1.基因合成

全基因序列合成可由生物公司协助完成，序列包括构建克隆所需的BglII、XhoI酶切位点、肠激酶酶切位点，序列如“序列表”所述。

2.表达载体构建

以购自Novagen公司的pET32a(+)为表达载体，以BglII、XhoI酶切位点将目的序列片段插入表达载体。

3.表达菌株构建

选用电转法或热激法，将含有目的片段的表达载体转入BL21(DE3)plysS感受态菌株，该菌株购自invitrogen公司。涂布于LB/Amp⁺培养基上，挑选单克隆做鉴定。

4.筛选与鉴定

可通过菌株PCR、提取质粒测序、提取质粒酶切、表达蛋白大小分析等手段检测所挑选的菌株是否与设计的一致。

鉴于此，本发明涉及的菌株可自行构建完成，无需生物材料样品保藏。

Claims (4)

1.采用经密码子优化的序列构建工程菌，经过发酵表达、纯化，获得高纯度的目的多肽；多肽经理化活性分析鉴定，与设计的一致。

2.如权利要求1所述，目的多肽的碱基序列如说明书中所述。

3.如权利要求1所述，工程菌的发酵过程采用流加乳糖诱导法。

4.如权利要求2所述，目的多肽的纯化经金属螯合捕获融合蛋白→肠激酶酶切→制备级HPLC的C4反相柱纯化，一步酶切二步层析法获得高纯度目的蛋白。 

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