CN105017407A - 一种重组人表皮生长因子的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白质纯化领域，涉及了一种重组人表皮生长因子（rhEGF）的纯化方法，将含有rhEGF的离心上清液依次经过Ni？Sepharose亲和层析、Source？15RPC反相层析、Source30Q离子交换层析得到高活性、高纯度的rhEGF蛋白。本发明创造性的采用Ni？Sepharose亲和层析纯化不含HIS纯化标签的天然结构重组人表皮生长因子蛋白，具有工艺简单、活性收率高和易于规模化放大生产等特点。

Description

一种重组人表皮生长因子的纯化方法
技术领域
本发明属于蛋白质纯化领域，涉及一种重组人表皮生长因子（rhEGF）的纯化方法。
背景技术
人表皮生长因子（hEGF）由Cohen等人于1975年从人体尿液中分离得到，由于其可抑制胃酸分泌，又被称为抑胃素（Urogastrone），是由53个氨基酸组成的小分子多肽。hEGF通过与EGF受体（EGFR）结合，使EGFR二聚并激活细胞通路，发挥多种生物学功能，如促进细胞分裂，修复表皮损伤、胃肠溃疡、角膜损伤；防治皮肤衰老，发挥美白嫩肤功效；靶向结合含高密度EGFR受体的肿瘤组织，抑制癌细胞生长等。鉴于Cohen在EGF等方面的开拓性工作及EGF本身重要的生物学作用，他与Montabcini于1986年荣获诺贝尔生理学奖。
EGF在多种疾病（如角膜损伤和糖尿病足等）的治疗中体现出显著的效果，其药用开发具有巨大的潜力；同时，EGF在美容方面的功效已被消费者广泛认可，相关产品的市场需求日益增大。然而，天然提取高活性EGF售价近200万美元/克，提取效率极低，无法大规模工业化制备，高质量EGF原料的生产供应远不能满足市场需求，这严重制约了EGF在医药和化妆品方面的应用。因此，开发一种高效的EGF生产工艺不仅具有巨大的经济价值，也为EGF进一步应用开发提供了最基本的保障。
EGF含有3对二硫键，很难通过化学合成法大量制备，现只能通过基因工程手段大规模重组制备。为促进二硫键的正确配对和高级结构的形成，重组EGF（rEGF）制备主要以融合表达为主：将EGF与可帮助蛋白正确折叠的伴侣蛋白和/或纯化标签融合表达，并经融合蛋白纯化、酶切、目的蛋白（EGF）纯化等步骤制备，涉及的纯化方法主要针对融合蛋白，酶切后EGF纯化仅需去除伴侣蛋白，与常规非融合EGF纯化工艺差异较大，且酶切后EGF蛋白仍含有残留酶切标签，影响活性及安全性。中国专利201310651408.0公布了将EGF与SUMO蛋白和HIS标签融合后利用CHO细胞重组制备的工艺，但未提及酶切后EGF纯化方法；中国专利200810211603.0公布了在EGF C末端增加HIS标签并与PDI蛋白融合后利用大肠杆菌重组表达，酶切后基于EGF结构仍残留的HIS标签利用镍离子亲和柱去除PDI伴侣蛋白，纯化后EGF结构（EGF+HIS标签+酶切标签）与天然EGF差异性较大，存在安全性隐患。
鉴于融合制备繁琐的工艺步骤，部分研究者研发了EGF非融合重组制备方法，该部分研究主要以大肠杆菌原核制备为主。中国专利201210189605.0和200510025289.3分别公布了EGF在大肠杆菌分泌表达制备的方法，纯化步骤包括超滤、疏水层析、凝胶层析和离子交换层析，其中涉及的凝胶层析因上样量所限、无法大规模放大；上述原核制备的hEGF纯品生物学活性分别为1.13×106IU/mg和1.21×106 IU/mg，仅为已上市重组人表皮生长因子（rhEGF）滴眼液（易贝，国药准字S20020016，标示规格为：20000IU(40μg)：2ml，即其比活性为5.0×106IU/mg）活性的20-25%。
酵母表达系统是近年来发展迅速的真核表达系统，不仅具有原核生物生长快、操作简便的特点，还具备哺乳动物细胞的翻译后加工和修饰功能、可表达具有生物活性的外源蛋白，尤其适合表达含多对二硫键的真核蛋白。同时，酵母菌可将目的蛋白通过一定的途径分泌到细胞外，大幅减少了目的蛋白的纯化工艺及制备成本。中国专利97115284.5公布了利用甲基营养型酵母菌重组制备hEGF截短异构体——EGF（1-51）的方法，纯化步骤包括疏水层析、离子交换层析和凝胶层析，不利于工业化放大，且制备所得EGF（1-51）生物学活性（1.14×106IU/mg）较低。目前，尚未有工艺简单、活性收率高、易于规模化放大生产的高活性、高纯度rhEGF制备工艺。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种rhEGF的纯化方法，本发明具有工艺简便快速、步骤少、易于工业化放大等特点，纯化产品活性、纯度等多项指标均高于中国药典要求，提高了后续使用的安全性、可控性和有效性。
为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组人表皮生长因子的纯化方法，包括下述纯化步骤：
（1）Ni Sepharose亲和层析：待Ni Sepharose层析柱用平衡缓冲液平衡后，将pH7.5-8.5的含有rhEGF的培养液离心上清上样，平衡缓冲液复平衡后，用含20mM咪唑的平衡缓冲液洗脱目的蛋白；
（2）Source 15RPC反相层析：待Source 15RPC反相层析柱用平衡缓冲液平衡后，将步骤（1）目的蛋白洗脱液上样，平衡缓冲液复平衡后，用洗脱液Ⅰ洗脱杂质蛋白，用洗脱液Ⅱ洗脱目的蛋白；
（3）Source 30Q离子交换层析：待Source 30Q离子交换层析柱用平衡缓冲液平衡后，将步骤（2）目的蛋白洗脱液上样，平衡缓冲液复平衡后，用浓缩缓冲液洗脱，即得rhEGF原液。
所述的重组人表皮生长因子为酵母菌分泌表达。
所述的步骤（1）-（3）中所用的平衡缓冲液为磷酸（PB）缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液，缓冲浓度为10-50mmol/L，pH为7.5-8.5。
优选的是，步骤（1）-（3）中所用的平衡缓冲液为磷酸缓冲液，缓冲浓度为25mmol/L，pH为8.0。
所述的步骤（2）中所用的洗脱液Ⅰ为含25-35%乙腈的平衡缓冲液。
优选的是，步骤（2）中所用的洗脱液Ⅰ为含33%乙腈的平衡缓冲液。
所述的步骤（2）中所用的洗脱液Ⅱ为含35-45%乙腈的平衡缓冲液。
优选的是，步骤（2）中所用的洗脱液Ⅱ为含40%乙腈的平衡缓冲液。
所述的步骤（3）中所用的浓缩缓冲液为PB缓冲液或甘氨酸-盐酸（Gly-HCl）缓冲液，缓冲浓度为10-50mmol/L，pH为3.0-4.0。
优选的是，步骤（3）中所用的浓缩缓冲液为PB缓冲液，缓冲浓度为25mmol/L，pH为3.5。
经长时间高密度发酵，发酵液上清离子强度较高，且含有大量色素，影响rhEGF与常规层析（如离子交换层析、疏水作用层析、反相层析）填料结合。酵母发酵上清纯化前一般需经数小时的超滤除盐除色素过程，然而，此过程极易引起羧肽酶对rhEGF C-末端的降解。建立高效富集工艺是制备高活性rhEGF的关键。蛋白多肽组氨酸（HIS）残基在特定情况下可与镍离子亲和填料结合，此结合作用力受HIS数量及结构影响。天然hEGF第10位和16位氨基酸为HIS，本发明人研究后发现，发酵上清rhEGF在pH7.5-8.5可与Ni Sepharose 6 Fast Flow填料有效结合，并在较低咪唑浓度完全洗脱，有效去除高浓度盐离子和色素。
为进一步去除残余色素及其他杂质，将Ni Sepharose层析洗脱液进一步进行反相层析纯化。常规反相层析纯化需在含三氟乙酸、高氯酸钠等离子配对剂的强酸性条件下进行，极端pH及反复变化的缓冲条件会影响rhEGF结构稳定性。常规硅胶基质反相层析介质仅能在酸性条件下使用，本发明采用的Source 15RPC反相层析介质为聚苯乙烯/二乙烯基苯，可在碱性条件下长期稳定使用，比硅胶介质载量高、流速快，更适合生产放大。所述的步骤（2）采用与上步Ni Sepharose亲和层析相同的pH和缓冲液，经不同浓度乙腈分步洗脱，可实现高纯度rhEGF的层析制备。此步骤采用阶段梯度洗脱，而非线性梯度洗脱，保证了大规模工艺放大的易操作性。
为去除残余有机溶剂，并使蛋白缓冲条件与原液缓冲液完全一致，反相层析洗脱液继续进行离子交换层析。所述的步骤（3）Source 30Q离子交换层析采用与（1）和（2）完全相同的平衡缓冲液，利用pH梯度洗脱而非常规离子强度梯度洗脱，使rhEGF洗脱液缓冲条件与原液缓冲液完全相同，且避免了后续超滤或透析等除盐操作。本发明采用Source 30Q层析介质的载量远高于Q Sepharose Fast Flow、Q Sepharose High Performance、Mono Q、Macrocap Q等介质，使得本步骤可获得高浓度rhEGF原液，利于储存及后续分装。
与现有技术相比，本发明具有如下突出的技术效果：
①创造性的采用镍离子亲和层析纯化不含HIS纯化标签的天然结构rhEGF蛋白，高效捕捉酵母分泌表达上清中的rhEGF，并有效去除发酵上清的盐离子及色素；
②经本发明三步纯化后，rhEGF蛋白纯度可达到98%以上，比活性高于5.0×106IU/mg，完全超越药典标准要求，具有极高的实用价值；
③纯化工艺中缓冲液pH 始终保持一致，工艺过程不跨越目的蛋白等电点，有利于rhEGF蛋白保持稳定；
④工艺过程步骤少，操作简便，不需特殊试剂，且不含有凝胶层析、透析、线性梯度洗脱等不易放大的工艺步骤或操作，利于大规模工艺放大。
附图说明
附图1：纯化后rhEGF蛋白 SDS-PAGE电泳图谱；
附图2：纯化后rhEGF蛋白RP-HPLC图谱。
具体实施方式
以下对本发明的特点进行描述，所举实施例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。
实施例1. rhEGF蛋白的纯化
收集含rhEGF蛋白的培养液上清（1000mL），用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，离心去除不溶性杂质，收集上清液。
取Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析介质，装入常压层析柱，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）以150cm/h流速（上样和洗脱速度与平衡速度相同，下同）平衡3个柱体积后，将含rhEGF的离心上清液上样，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）复平衡，检测A280nm，穿透峰弃去，待A280nm降至基线后，用含20mM咪唑的平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰；
取Source 15RPC反相层析介质，装入中高压层析柱，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）以300cm/h流速平衡3个柱体积后，将rhEGF Ni Sepharose洗脱样品上样，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）复平衡，检测A214nm，穿透峰弃去，待A214nm降至基线后，用含33%乙腈的平衡缓冲液洗脱杂质，用含40%乙腈的平衡缓冲液洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰；
取Source 30Q离子交换层析介质，装入中高压层析柱，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）以300cm/h流速平衡3个柱体积后，将rhEGF Source 15RPC洗脱样品上样，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）复平衡，检测A214nm，穿透峰弃去，待A214nm降至基线后且残留乙腈完全去除后（可用气相色谱监控），用浓缩缓冲液（25mM PB缓冲液，pH3.5）洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰，即得高浓度rhEGF原液。
实施例2. rhEGF蛋白SDS-PAGE纯度测定
（1）15%的分离胶配置
双蒸水：3.3 mL；1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)：2.5 mL；10%SDS：100 μL；30%丙烯酰胺单体贮液：4.0 mL；TEMED：4 μL；10%过硫酸铵：100 μL；总体积：10 mL。混匀后加入电泳槽的玻璃板夹缝中，并在胶面上加入约1cm双蒸水，待胶自然凝聚后，除净双蒸水，并在夹缝中放入梳子。
（2）5%的浓缩胶配置
双蒸水：3.4 mL；1mol/L Tris-HCl (pH6.8)：0.63 mL；10% SDS：50 μL；30%丙烯酰胺单体贮液：0.83 mL；TEMED：5 μL；10%过硫酸铵：150 μL；总体积：5 mL。混匀后，加入夹缝中并没过梳孔，待凝聚后小心拔出梳子，用电泳缓冲液冲洗加样孔，清除未凝聚的丙稀酰胺。
（3）溶液配置
① 电泳缓冲液（10×）：称取Tris 3.0 g，甘氨酸 14.4g，SDS 1.0 g，加适量的超纯水溶解，用HCl调pH至8.3，加超纯水定容至1 000 mL。
② 供试品缓冲液（4×）：称取Tris 0.303g、溴酚蓝2mg、SDS 0.8g，量取盐酸0.189mL、甘油4mL，加水溶解并稀释至10mL，使用前按体积比加入终浓度5%的β-巯基乙醇，即得。
③ 考马斯亮蓝染色液　称取考马斯亮蓝R250 1g，加入甲醇200mL、冰醋酸50mL、水250mL混匀，即得。
④ 考马斯亮蓝脱色液 取甲醇400mL、冰醋酸100mL与水500mL混匀，即得。
（4）样品制备
将rhEGF样品分别与4×凝胶样品缓冲液3:1混匀，在100℃沸水中保温4-5 min，取出待用。
（5）样品测定
    将样品及标准蛋白加入点样孔后，接通电源，恒压电泳至溴酚蓝到离底部约0.5 cm时，停止电泳。将分离胶从玻璃板上取下，在染色液中染色1-2 h，脱色8 h，换保存液保存。
如附图1所示，rhEGF样品未见明显杂质条带，SDS-PAGE纯度99.2%，高于中国药典规定的电泳法“人表皮生长因子纯度应不低于95.0％”的标准。
实施例3. rhEGF RP-HPLC纯度测定
仪器：Aglient 1100 HPLC；色谱柱：Welch Ultimate XB-C18（5μm 4.6×100mm）；流动相：A液为0.1%三氟乙酸+水溶液 ；B液为0.1%三氟乙酸+乙腈溶液；流速：1.0 mL/min；洗脱方式：0-30min，B从 5-95%；检测波长：220nm。取10μL rhEGF样品，按上述条件进行全梯度RP-HPLC纯度测定。
如附图2所示，rhEGF样品RP-HPLC图谱未见明显杂质条带，主峰RP-HPLC纯度为99.3%，高于中国药典规定的高效液相色谱法“人表皮生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0％”的标准。
实施例4. hEGF 生物活性测定（细胞增殖法/MTT比色法）
（1）试剂配制
RPMI 1640培养液：RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释到1000ml，加青霉素105U和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
维持培养液：量取新生牛血清4ml，加RPMI 1640培养液到1000ml。
完全培养液：量取新生牛血清100ml，加RPMI 1640培养液到1000ml。
PBS：量取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释到1000ml的溶液，经121℃，15分钟灭菌。
噻唑蓝（MTT）溶液：取MTT粉末0.10g，加PBS20ml使溶解，经0.22um滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
（2）标准品溶液的制备
取重组人表皮生长因子标准品按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每1ml含50 IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个孔。以上操作在无菌条件下进行。
（3）供试品溶液的制备
将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每1ml约含50 IU。在96孔板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个孔。以上操作在无菌条件下进行。
（4）测定法
Balb/c3T3细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105-5.0×106个细胞，传代后24-36小时用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0×104-8.0×104个细胞的细胞悬液 ，接种于96孔板中，每孔100ul，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液，于37℃、5%二氧化碳培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100ul，于37℃、5%二氧化碳培养64-72小时。每孔加入MTT溶液20ul，于37℃、5%二氧化碳培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100ul，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结果：供试品生物学活性（IU/ml）=Pr*Ds*Es/Dr*Er，式中Pr为标准品生物学活性，IU/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准半效稀释倍数。
Balb/c3T3细胞活性测定结果显示，本发明制备的hEGF原液比活性为5.5×106IU/mg，高于中国药典规定的按照细胞增殖法/MTT比色法“每1mg蛋白应不低于5.0×105IU”的标准。
实施例5. rhEGF蛋白的纯化
收集含rhEGF蛋白的培养液上清（1000mL），用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，离心去除不溶性杂质，收集上清液。
取Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析介质，装入常压层析柱，用平衡缓冲液（25mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0）以150cm/h流速平衡3个柱体积后，将含rhEGF的离心上清液上样，用平衡缓冲液（25mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0）复平衡，检测A280nm，穿透峰弃去，待A280nm降至基线后，用含20mM咪唑的平衡缓冲液（25mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0）洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰；
取Source 15RPC反相层析介质，装入中高压层析柱，用平衡缓冲液（25mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0）以300cm/h流速平衡3个柱体积后，将rhEGF Ni Sepharose洗脱样品上样，用平衡缓冲液（25mmol/LTris-HCl缓冲液，pH8.0）复平衡，检测A214nm，穿透峰弃去，待A214nm降至基线后，用含33%乙腈的平衡缓冲液洗脱杂质，用含40%乙腈的平衡缓冲液洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰；
取Source 30Q离子交换层析介质，装入中高压层析柱，用平衡缓冲液（25mmol/LTris-HCl缓冲液，pH8.0）以300cm/h流速平衡3个柱体积后，将rhEGF Source 15RPC洗脱样品上样，用平衡缓冲液（25mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0）复平衡，检测A214nm，穿透峰弃去，待A214nm降至基线后且残留乙腈完全去除后（可用气相色谱监控），用浓缩缓冲液（25mM Gly-HCl缓冲液，pH3.5）洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰，即得高浓度rhEGF原液。
rhEGF蛋白测定结果见表1。
实施例6. rhEGF蛋白的纯化
收集含rhEGF蛋白的培养液上清（1000mL），用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.5，离心去除不溶性杂质，收集上清液。
取Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析介质，装入常压层析柱，用平衡缓冲液（10mmol/L PB缓冲液，pH7.5）以150cm/h流速平衡3个柱体积后，将含rhEGF的离心上清液上样，用平衡缓冲液（10mmol/L PB缓冲液，pH7.5）复平衡，检测A280nm，穿透峰弃去，待A280nm降至基线后，用含20mM咪唑的平衡缓冲液（10mmol/L PB缓冲液，pH7.5）洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰；
取Source 15RPC反相层析介质，装入中高压层析柱，用平衡缓冲液（10mmol/L PB缓冲液，pH7.5）以300cm/h流速平衡3个柱体积后，将rhEGF Ni Sepharose洗脱样品上样，用平衡缓冲液（10mmol/L PB缓冲液，pH7.5）复平衡，检测A214nm，穿透峰弃去，待A214nm降至基线后，用含25%乙腈的平衡缓冲液洗脱杂质，用含35%乙腈的平衡缓冲液洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰；
取Source 30Q离子交换层析介质，装入中高压层析柱，用平衡缓冲液（10mmol/L PB缓冲液，pH7.5）以300cm/h流速平衡3个柱体积后，将rhEGF Source 15RPC洗脱样品上样，用平衡缓冲液（10mmol/L PB缓冲液，pH7.5）复平衡，检测A214nm，穿透峰弃去，待A214nm降至基线后且残留乙腈完全去除后（可用气相色谱监控），用浓缩缓冲液（10mM PB缓冲液，pH3.0）洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰，即得高浓度rhEGF原液。
rhEGF蛋白测定结果见表1。
实施例7. rhEGF蛋白的纯化
收集含rhEGF蛋白的培养液上清（1000mL），用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.5，离心去除不溶性杂质，收集上清液。
取Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析介质，装入常压层析柱，用平衡缓冲液（50mmol/L PB缓冲液，pH8.5）以150cm/h流速平衡3个柱体积后，将含rhEGF的离心上清液上样，用平衡缓冲液（50mmol/L PB缓冲液，pH8.5）复平衡，检测A280nm，穿透峰弃去，待A280nm降至基线后，用含20mM咪唑的平衡缓冲液（50mmol/L PB缓冲液，pH8.5）洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰；
取Source 15RPC反相层析介质，装入中高压层析柱，用平衡缓冲液（50mmol/L PB缓冲液，pH8.5）以300cm/h流速平衡3个柱体积后，将rhEGF Ni Sepharose洗脱样品上样，用平衡缓冲液（50mmol/L PB缓冲液，pH8.5）复平衡，检测A214nm，穿透峰弃去，待A214nm降至基线后，用含35%乙腈的平衡缓冲液洗脱杂质，用含45%乙腈的平衡缓冲液洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰；
取Source 30Q离子交换层析介质，装入中高压层析柱，用平衡缓冲液（50mmol/L PB缓冲液，pH8.5）以300cm/h流速平衡3个柱体积后，将rhEGF Source 15RPC洗脱样品上样，用平衡缓冲液（50mmol/L PB缓冲液，pH8.5）复平衡，检测A214nm，穿透峰弃去，待A214nm降至基线后且残留乙腈完全去除后（可用气相色谱监控），用浓缩缓冲液（50mM PB缓冲液，pH4.5）洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰，即得高浓度rhEGF原液。
rhEGF蛋白测定结果见表1。
实施例8. rhEGF蛋白的纯化
收集含rhEGF蛋白的培养液上清（2500mL），用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，离心去除不溶性杂质，收集上清液。
取Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析介质，装入常压层析柱，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）以150cm/h流速平衡3个柱体积后，将含rhEGF的离心上清液上样，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）复平衡，检测A280nm，穿透峰弃去，待A280nm降至基线后，用含20mM咪唑的平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰；
取Source 15RPC反相层析介质，装入中高压层析柱，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）以300cm/h流速平衡3个柱体积后，将rhEGF Ni Sepharose洗脱样品上样，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）复平衡，检测A214nm，穿透峰弃去，待A214nm降至基线后，用含33%乙腈的平衡缓冲液洗脱杂质，用含40%乙腈的平衡缓冲液洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰；
取Source 30Q离子交换层析介质，装入中高压层析柱，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）以300cm/h流速平衡3个柱体积后，将rhEGF Source 15RPC洗脱样品上样，用平衡缓冲液（25mmol/L PB缓冲液，pH8.0）复平衡，检测A214nm，穿透峰弃去，待A214nm降至基线后且残留乙腈完全去除后（可用气相色谱监控），用浓缩缓冲液（25mM PB缓冲液，pH3.5）洗脱，收集含rhEGF蛋白的洗脱峰，即得高浓度rhEGF原液。
rhEGF蛋白测定结果见表1。
本发明上述实施例1、5-8所得rhEGF蛋白，通过SDS-PAGE纯度测定方法、RP-HPLC纯度测定方法、生物活性测定方法（细胞增殖法/MTT比色法）的结果见下表1。实施例5-8所得rhEGF蛋白通过SDS-PAGE、RP-HPLC图谱均未见明显杂质条带。
表1.rhEGF蛋白纯化后结果
由于已经根据以上实施例描述了本发明，任何等同替换对于本领域的技术人员来说都是显而易见的，且包含在本发明之中。

Claims (10)

1.一种重组人表皮生长因子的纯化方法，其特征在于，包括下述纯化步骤：
（1）Ni Sepharose亲和层析：待Ni Sepharose层析柱用平衡缓冲液平衡后，将pH7.5-8.5的含有重组人表皮生长因子的培养液离心上清上样，平衡缓冲液复平衡后，用含20mmol/L咪唑的平衡缓冲液洗脱目的蛋白；
（2）Source 15RPC反相层析：待Source 15RPC反相层析柱用平衡缓冲液平衡后，将步骤（1）目的蛋白洗脱液上样，平衡缓冲液复平衡后，用洗脱液Ⅰ洗脱杂质蛋白，用洗脱液Ⅱ洗脱目的蛋白；
（3）Source 30Q离子交换层析：待Source 30Q离子交换层析柱用平衡缓冲液平衡后，将步骤（2）目的蛋白洗脱液上样，平衡缓冲液复平衡后，用浓缩缓冲液洗脱，即得目的蛋白原液。
2.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的纯化方法，其特征在于：所述的重组人表皮生长因子为酵母菌分泌表达。
3.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的纯化方法，其特征在于：步骤（1）-（3）中所用的平衡缓冲液为磷酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，缓冲浓度为10-50mmol/L，pH为7.5-8.5。
4.如权利要求3所述的重组人表皮生长因子的纯化方法，其特征在于：步骤（1）-（3）中所用的平衡缓冲液为磷酸缓冲液，缓冲浓度为25mmol/L，pH为8.0。
5.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的纯化方法，其特征在于：步骤（2）中所用的洗脱液Ⅰ为含25-35%乙腈的平衡缓冲液。
6.如权利要求5所述的重组人表皮生长因子的纯化方法，其特征在于：步骤（2）中所用的洗脱液Ⅰ为含33%乙腈的平衡缓冲液。
7.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的纯化方法，其特征在于：步骤（2）中所用的洗脱液Ⅱ为含35-45%乙腈的平衡缓冲液。
8.如权利要求7所述的重组人表皮生长因子的纯化方法，其特征在于：步骤（2）中所用的洗脱液Ⅱ为含40%乙腈的平衡缓冲液。
9.如权利要求1所述的重组人表皮生长因子的纯化方法，其特征在于：步骤（3）中所用的浓缩缓冲液为PB缓冲液或甘氨酸-盐酸缓冲液，缓冲浓度为10-50mmol/L，pH为3.0-4.0。
10.如权利要求9所述的重组人表皮生长因子的纯化方法，其特征在于：步骤（3）中所用的浓缩缓冲液为PB缓冲液，缓冲浓度为25mmol/L，pH为3.5。
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