CN102827286A - 一种促胰岛素分泌肽与突变的人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明涉及促胰岛素分泌肽(Exendin-4)与410位由R(Arg精氨酸)突变为A(Ala丙氨酸)的人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白，其含有2个多肽区，其1区由2个促胰岛素分泌肽Exendin-4重复序列组成，其2区是点突变的人血清白蛋白HSA，1区通过其C-末端与第2区的N-末端直接连接，中间不加入任何连接肽，其结构表述为(Exendin-4)2-HSA(R410A)。与Exendin-4和(Exendin-4)2-HSA相比，本发明(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白在体内具有更长效的特性，可用于制备非胰岛素依赖性糖尿病的长效治疗制剂。
Description
技术领域
一种促胰岛素分泌肽与突变的人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。
背景技术
促胰岛素分泌肽(Exendin-4)是一种刺激胰岛素分泌的肽激素，含39个氨基酸，早年是从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥(Gila monster)唾液中发现的一种激素物质，其氨基酸序列有53％与人类血液中调控血糖激素即胰高血糖素样肽-1(GLP-1)同源。该物质具有直接降血糖，促胰腺分泌胰岛素作用，是GLP-1受体(GLP-1R)的潜在激动剂；还可以通过减缓胃肠道的蠕动使食物的吸收减慢，从而降低食物中的葡萄糖在血液内出现的高峰。同时，由于不被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)降解，Exendin-4在人体内的半衰期为2-3小时，远长于GLP-1的1-2分钟，其稳定性和生物活性明显高于GLP-1，显示较GLP-1更好的治疗效果。目前人工合成的Exendin-4(Byetta)已被用于治疗II型糖尿病患者。然而，由于它的分子量小，能被肾脏快速清除，患者还是需要每天注射两次才能获得满意的治疗效果，血清浓度变化很大，即使一天注射两次亦不能持续刺激GLP-1R，给患者带来诸多不便。Exendin-4展示了比GLP-1更强的降血糖效应，开发长效Exendin-4类药物将更有利于提高其治疗II-型糖尿病的效果。药物研发人员正在尝试改变其分子结构，使药物在降糖的同时还能延长其在体内的持续效果。如Lilly公司采用基因工程方法研制的Exendin-4与免疫球蛋白(Recombumin)在体外结合产生CJC-1134-PC；Exendin-4与聚乙二醇(PEG)以水解化学键融合的PEG40,000-FMS-Exendin-4。
白蛋白是人血清中的重要蛋白组份，占血清总蛋白量的一半。人血清白蛋白由585个氨基酸组成，分子量为66KD。人血清白蛋白表现出多样性，有30种变异分子。人血清白蛋白基因已经被克隆(A.Drgaiczyk et al，PNAS，79：71-75，1982)，并被成功地应用在多种体外表达系统中进行表达。对人血清白蛋白进行改造，如将其410位由R(Arg精氨酸)突变为A(Ala丙氨酸)能够降低蛋白质的降解(S.M.Kerry Williams et al，YEAST，14：161-169，1998)。人血清白蛋白在正常生理状况下不易透过肾小球，在血清中的半衰期达14-21天。白蛋白由于具有较长的半衰期，可以作为一种载体通过与血液中的其他因子，包括生物活性蛋白的结合，从而保持或延长其他因子在体内的生物活性。将一些小分子肽或蛋白质药物与白蛋白进行融合是改进小分子蛋白质或多肽药物半衰期的有效方法。与其他方法相比，构建长效白蛋白融合蛋白药物可以避免复杂的化学修饰和处理过程，因而具有容易操作和更好的经济型优势。白蛋白作为一种药物载体，在临床上已经获得了应用，如：已成熟的长效白蛋白融合蛋白药物有：胰岛素，人生长激素，白介素，干扰素。使用白蛋白作为载体，可以延长药物的半衰期，使这些药物的治疗效果及药理特性获得明显的改善。利用基因工程技术，将白蛋白与具有生物活性的蛋白分子进行重组表达构建融合蛋白，已经成为开发长效蛋白药物的一个重要手段。
将Exendin-4与人血清白蛋白进行融合是开发长效Exendin-4类药物的新途径。专利申请CN101525387A将Exendin-4与人血清白蛋白直接连接获得多肽具有延长Exendin-4半衰期的作用。专利申请CN101240033A将两个串联的Exendin-4与人血清白蛋白直接融合，得到的多肽(Exendin-4)2-HSA具有比Exendin-4更好的稳定性和体内半衰期。
发明内容
本发明提供一种促胰岛素分泌肽与突变的人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法。在保持Exendin-4的生理特性的基础上，延长其体内作用时间，可开发成为新一代长效治疗糖尿病的药物。
本发明的技术方案：一种促胰岛素分泌肽与突变的人血清白蛋白的融合蛋白，含有2个多肽区，其1区由2个促胰岛素分泌肽Exendin-4重复序列组成，其2区是410位由R(Arg精氨酸)突变为A(Ala丙氨酸)的人血清白蛋白，标记为HSA(R410A)，1区通过其C-末端与第2区的N-末端直接连接，中间不加入任何连接肽，其结构表述为：(Exendin-4)2-HSA(R410A)。
其中Exendin-4氨基酸序列为序列SEQ ID NO：1。
所述的(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白，其Exendin-4重复序列之间的连结方式为：上一个Exendin-4的C末端与下一个Exendin-4的N末端直接连接，中间不加入任何连接肽。
其中(Exendin-4)2氨基酸序列为序列SEQ ID NO：2。
所述的(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白，2区多肽选自410位由R突变为A的人血清白蛋白HSA(R410A)，其氨基酸序列为序列SEQ ID NO：3。
所述的(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白，其氨基酸序列为序列SEQ IDNO：4。
所述的(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白的制备方法，包括使用PCR进行基因片段扩增和拼接，表达质粒的构建，表达工程菌的构建，转录，翻译，蛋白分离和纯化，以及鉴定步骤。
本发明为了获得正确折叠的融合蛋白，并且能够进行外分泌，我们优选的表达载体为pPicZαA(购自Invitrogen)，该表达载体含有a-Factor分泌信号肽。将(Exendin-4)2-HSA(R410A)编码基因连接在信号肽之后。具体连接方式如下：a-Factor序列-XhoI-Kex2蛋白酶识别序列-编码基因-NotI。在编码基因上游5’端加上XhoI酶切位点，下游3’端加入NotI酶切位点，并在a-Factor分泌信号肽与编码基因两者之间加入Kex2蛋白酶识别位点的核酸序列，这可以将(Exendin-4)2-HSA(R410A)与a-Factor信号肽基因组成一个完整的开放阅读框架，在蛋白表达分泌到胞外时，a-Factor信号肽被切割，培养上清只有(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白。
本发明(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白的基因核苷酸序列，可选用两种序列方案。方案一：人血清白蛋白第410位由R突变为A，表示为HSA(R410A)-OPT1，其融合蛋白表达质粒表示为pPicZαA-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1；方案二：人血清白蛋白第410位由R突变为A，并且密码子进行了优化，表示为HSA(R410A)-OPT2，其融合蛋白表达质粒表示为pPicZαA-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2。
其中HSA(R410A)-OPT1核苷酸序列为序列SEQ ID NO：5。
其中HSA(R410A)-OPT2核苷酸序列为序列SEQ ID NO：6。
其中(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1核苷酸序列为序列SEQ ID NO：7。
其中(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2核苷酸序列为序列SEQ ID NO：8。
本发明优选的表达质粒是pPicZαA(购自Invitrogen)，适合在酵母工程菌中表达。但是，本发明中的融合蛋白也可以选择利用其他质粒来表达，这些表达质粒包括但是不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。
具体地，该表达质粒含有适当的启动子，用以控制融合蛋白的表达。这些启动子包括但是不局限于以下所述启动子AOX1，优选的启动子为AOX1。
本发明为使表达的(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白不带有任何本融合蛋白以外的氨基酸残基，在HSA基因的3’末端加入终止密码子，使融合蛋白转译过程中不会带上表达载体上的任何成分。
本发明提供构建上述优选的(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白的表达质粒的构建方法及工程菌构建方法。
具体地，通过RT-PCR技术，将人肝癌细胞SMMC7721的RNA反转录成cDNA，然后通过PCR方法获得编码HSA(R410A)蛋白的核苷酸序列。分别将HSA(R410A)-OPT1和HSA(R410A)-OPT2片段插入到TA克隆载体pTG19(购自上海捷瑞生物工程有限公司)中，获得pTG19-HSA(R410A)-OPT1和pTG19-HSA(R410A)-OPT2重组质粒。编码(Exendin-4)2多肽区的核苷酸序列通过人工引物拼接的方法合成，获得(Exendin-4)2核酸序列，其5’端带有XhoI酶切位点，核苷酸序列为序列SEQ ID NO：9。将分别得到的HSA(R410A)-OPT1或HSA(R410A)-OPT2基因与(Exendin-4)2基因，进行PCR拼接，分别得到(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1和(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2基因。用限制性内切酶XhoI、NotI同时切割重组质粒pTG19-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1、pTG19-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2与表达质粒pPicZαA，分别制备(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1或(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2融合基因片段和线性化pPicZαA质粒片段；将纯化后的(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1或(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2融合基因片段和线性化pPicZαA质粒片段用T4DNA连接酶进行连结，转化大肠杆菌DH5α，分别获得pPicZα-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1重组表达质粒和pPicZα-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2重组表达质粒。提取该重组表达质粒质粒，用PemI酶切线性化后转化到毕赤酵母X33菌株，在含有Zecion的YPD平板上进行繁殖和筛选，获得含有重组表达质粒的酵母菌。
本发明表达(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白的重组质粒可在多种酵母菌种表达，其优选的酵母菌是毕赤酵母，其优选菌株是X33(购自Invitrogen公司)。
本发明提供一种工程菌大规模发酵表达(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白的方法。具体地，将含有重组表达质粒的单个酵母菌(X33)菌落接种到基本培养基YPD(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物)，30℃振摇过夜。计算获得50mL诱导培养基OD600＝0.3所需要过夜培养物的总量。离心收集菌体沉淀，并用诱导培养基BMMY(酵母基本氮源YNB1.34％，2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲溶液pH＝6.0，生物素0.02％)悬浮，并转种到诱导培养基中发酵，每天加入2％甲醇诱导表达，30℃振摇培养72h，离心收集发酵上清液，-80℃保存用于融合蛋白表达的分析和纯化。
融合蛋白的表达，可以通过一般的蛋白生化手段检测，包括但不局限于：SDS-PAGE等。
本发明也提供一种(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白的分离纯化方法。
具体地，该分离纯化方法利用了(Exendin-4)2-HSA(R410A)的等电点pH＝5.5左右特点，选择阳离子交换层析柱，使用SP Sepharose FF为填料，成功捕获了发酵液中的产物(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白质。捕获的(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白质再经过疏水型Phenyl sepharose FF(high)层析柱，阴离子Q Sepharose FF交换层析进行精细纯化，目标蛋白质的纯度可以达95％以上。
本发明采用基因重组技术，将两个Exendin-4多肽重复序列和突变的人血清白蛋白融合，产生促胰岛素分泌肽融合蛋白(Exendin-4)2-HSA(R410A)，中间不加入任何连接肽，在保持Exendin-4的药理特性的基础上延长其在体内的作用时间，在药学领域包括II型糖尿病及肥胖症治疗将有良好的应用前景。
经过动物实验验证，本发明(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白具有长效降血糖作用；与(Exendin-4)2-HSA融合蛋白相比，具有更长的疗效持续时间、以及更好的生物学活性。
本发明(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白可以用于包括糖尿病等症状的治疗。给药方式可以是注射，口服，鼻内，呼吸道等。
为了提高用药效果，本发明(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白也可以与其他降血糖药物共同使用。
附图说明
图1：pPicZc-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1重组表达质粒构建图
图2：pPicZα-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2重组表达质粒构建图
图3：(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1融合蛋白的表达与纯化。
1)：Marker(购自上海生工公司，fermentas，10％)；2)酵母表达上清；3)SP柱流穿；4)SP柱洗脱；5)疏水柱流穿；6)疏水柱0.5M NaOH洗脱；7)Q柱流穿；8)Q柱洗脱
图4：(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2融合蛋白的表达
MK：Marker(购自上海生工公司，fermentas，12％)；D1、D2、D3为第一、二、三天的表达情况
图5：(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2融合蛋白的纯化。
1)发酵上清；2)阳离子柱洗脱收集；3)疏水柱流穿收集；4)阴离子柱洗脱收集；5)Marker(购自上海生工公司，fermentas，12％)
图6：(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白的短效活性观察
图7：(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1融合蛋白的长效活性观察
图8：(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2融合蛋白的长效活性观察
具体实施方式
以下所提供的实施例，可以更详细地解释本发明内容。但是，本发明的内容并不限于这些实施例所阐述的内容。
实施例1：pTG19-(Exendin-4)2-HSA重组质粒的构建
人血清白蛋白基因通过RT-PCR方法获得。首先获得人肝癌细胞，并从中制备总RNA。然后通过反转录方法获得cDNA。再用PCR分子克隆技术扩增获得人血清白蛋白基因。具体说明如下：
1、人肝癌细胞总RNA的抽提
人肝癌细胞SMMC7721，用BioFlux simply P总RNA提取试剂盒提取总RNA。具体地，将人肝癌细胞SMMC7721，约5×106个，在冷冻粉碎后，离心5000rpm×1min，弃上清，加入100μL的Solution R1(Simply P总RNA提取试剂盒)，震荡混合30s，室温静置1min，进入下一步。处理好的样本中，加入600μLSolution R2(Simply P总RNA提取试剂盒)，充分颠倒混匀，室温静置3-5min。此步骤不可离心，取上清时尽量避免洗到悬浮杂质，以避免下步离心时堵塞离心柱。将上清液吸入Spin column(Simply P总RNA提取试剂盒)要套上离心管，离心30s。弃去外套管中液体，向Spin column中加入600μL Wash Buffer，离心30s，弃去接液管中液体。重复洗涤一次。然后空柱于10000rpm离心1分钟后将离心柱转移到一个新1.5mL离心管。5、将Spin column移入新的1.5mL离心管中，在膜中央加入Elution Buffer(或pH＞7.0的DEPC处理水)20-50μL，室温静置1min，离心30s，获得总RNA。反转录成cDNA，再以cDNA为模板PCR获得目的基因。
2、HSA基因扩增
反转录的体系及条件为：反应体系中加入总RNA 7μL，引物HSAdoIIID 1μL，RNAinhibitor 0.5μL后，65℃反应15min，冰上放置5min；然后再在体系中加入5×RT Buffer 4.0μL，2.5mM dNTPs 4.0μL，RNA inhibitor 0.5μL，AMV 3μL，48℃反应60min，然后80℃灭活2min。
引物设计：
HSAdoIU：5’-GATGCACACAAGAGTGAGGTT-3′
HSAdoIIID：5’-TTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3′
PCR反应条件：在一个0.2mL的PCR管中，加入10×pfu PCR缓冲液5μL，2.5mM dNTPs 4μL，cDNA2μL(50ng)，引物HSAdoIU 1μL(10μM)、HSAdoIIID1μL(10μM)，Pfu酶0.6μL，加水到终体积50μL。PCR条件：94℃变性3min；再按94℃，40s；55℃，40s，72℃，2min，一共30个循环。最后，72℃，保温5min。所得PCR产物加A尾，即在反应体系中加入Taq酶0.5μL，72℃保温20min。然后采用琼脂糖凝胶电泳方法回收纯的HSA基因片段。具体是用1％的agarose胶电泳酶切产物，切下1800bp左右的目的条带，再用上海生工公司的DNA切胶回收试剂盒纯化HSA基因片段。将HSA基因片段与pTG19TA克隆载体连结，构建HSA/pTG19重组质粒，连结产物转化大肠杆菌DH5α，再经含Amp的LB平板筛选获得HSA/pTG19重组质粒质粒。用质粒DNA纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)纯化重组质粒DNA，进行DNA序列分析，确定HSA基因序列的正确性。
3、(Exendin-4)2基因合成与克隆
(Exendin-4)2基因是利用人工引物拼接的方法获得。按SEQ ID NO：9序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成六条引物，通过PCR拼接的方法获得(Exendin-4)2基因，并使其5’端带下XhoI酶切位点。具体六条引物如下：
E21U：5’-CATGGTGAAGGTACTTTCACTTCTGATTTGTCTAAGCAAATGGAAGAAGAAGC-3′
E21D：5’-GGACCACCGTTCTTCAACCATTCAATGAACAATCTGACAGCTTCTTCTTCCATTTGCTT-3′
E22U：5’-GTTGAAGAACGGTGGTCCATCCTCTGGTGCTCCTCCACCTTCTCACGGT GAAG-3′
E22D：5’-AGCTTCCTCTTCCATTTGCTTAGATAAATCAGAAGTAAAGGTACCTCACCGTGAGAAG-3′
E23U：5’-AGCAAATGGAAGAGGAAGCTGTAGATTGTTCATCGATGGTTAAATGGTGGTCCT-3′
E23D：5’-TTGTGTGCATCAGATGAGGTGGACACCACTGAAGGACCACCTTTT-3′
第一轮PCR E21，E22，E23片段拼接
PCR体系中含引物E21U/E22U/E23U与E21D/E22D/E23D各5.0μL，2.5mM的dNTPs 4.0μL，10×pfu反应缓冲液5.0μL，5μ/μL pfu 0.6μL，加入双蒸水30.4μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸20秒，循环30次；第三阶段72℃延伸5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见约100bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
第二轮PCR E223片段拼接
PCR体系中含模板E22 PCR产物和E23 PCR产物各5.0μL，引物E22U(10μM)和E23D(10μM)各1.0μL，2.5mM的dNTPs 4.0μL，10×pfu反应缓冲液5.0μL，5μ/μL pfu 0.6μL，加入双蒸水28.4μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸20秒，循环30次；第三阶段72℃延伸5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见约180bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
第三轮 PCR E2片段扩增
PCR体系中含模板E21 PCR产物和E223 PCR产物各5.0μL，引物E21U(10μM)和E23D(10μM)各1.0μL，2.5mM的dNTPs 4.0μL，10×pfu反应缓冲液5.0μL，5μ/μL pfu 0.6μL，加入双蒸水28.4μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸20秒，循环30次；第三阶段72℃延伸5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见约250bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
PCR产物回收加A尾
加A体系中含E2PCR产物38μL，2.5mM dNTPs 4.0μL，25mM MgCl2 2.4μL，10×PCR缓冲液5.0μL，Taq酶0.6μL；72℃保温20min。
产物回收连接T载体pTG19
pTG19 1.0μL，E2加A产物11.5μL，10×T4DNA ligation buffer 1.5μL，T4DNA ligase 1.0μL。16℃，3小时，转化DH5α，菌落PCR鉴定阳性克隆，送测序，测序公司上海美吉生物医药科技有限公司，测序结果显示该片段第153位核苷酸发生一个由A到G的的突变，但是该突变没有影响到氨基酸，因此我们之后的序列均以这个质粒为模板。
4、(Exendin-4)2-HSA融合基因的构建与克隆
(一)以pTG19-(Exendin-4)2质粒为模板，E2FU，E2FD为引物进行PCR。
E2FU：5’-GACTCGAGAAAAGACATGGTGAAGGTACTTTC-3′
E2FD：5’-ACCTCACTCTTGTGTGCATCAGATGGA-3′
PCR体系中含模板pTG19-(Exendin-4)2质粒0.1μL，引物E2FU(10μM)和E2FD(10μM)各1μL，2.5mM的dNTPs 4μL，10×pfu反应缓冲液5.0μL，5U/μLpfu 0.6μL，加入双蒸水38.3μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸20秒，，循环30次；第三阶段72℃保温5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见约250bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
(二)以pTG19-HSA质粒为模板，HSAdoIU，HSAdoIIID为引物PCR
HSAdoIU：5’-GATGCACACAAGAGTGAGGTT-3′
HSAdoIIID：5’-TTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3′
PCR体系中含模板pTG19-HSA质粒0.1μL，引物HSAdoIU(10μM)和HSAdoIIID(10μM)各1μL，2.5mM的dNTPs 4μL，10×pfu反应缓冲液5μL，5U/μLpfu 0.6μL，加入双蒸水38.3μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分40秒，循环30次；第三阶段72℃保温5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约1800bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
(三)获得的两个基因片段进行PCR拼接
E2FU：5’-GACTCGAGAAAAGACATGGTGAAGGTACTTTC-3′
HSAdoIIID：5’-TTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3′
PCR体系中含模板E2PCR回收产物3μL，HSA回收产物3μL，，2.5mM的dNTPs 4μL，10×pfu反应缓冲液5μL，5U/μL pfu 0.6μL，加入双蒸水32.4μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性1分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环6次；然后加入引物E2FU(10μM)和HSAdoIIID(10μM)各1μL，第一阶段93.5℃预变性1分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，循环32次；第三阶段72℃保温5分钟，；所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约2000bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
pTG19 1μL，上述PCR产物11.5μL，10×T4DNA ligation buffer 1.5μL，T4DNA ligase 1μL。16℃，3小时，转化大肠杆菌DH5a，菌落PCR鉴定阳性克隆，送测序，测序公司上海美吉生物医药科技有限公司，获得pTG19-(Exendin-4)2-HSA重组质粒。
实施例2：pTG19-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1重组质粒的构建
人血清白蛋白第410位由R突变为A，编码基因表示为HSA(R410A)-OPT1，核苷酸序列为序列SEQ ID NO：5。融合蛋白编码基因为(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1，核苷酸序列为序列SEQ ID NO：7。融合蛋白重组质粒表示为pTG19-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1，其构建过程如下：
表达载体质粒pPicZαA，进行XhoI/NotI双酶切。具体条件如下，表达载体质粒pPicZαA，25μL；10×H buffer 5.0μL，XhoI 1.0μL，NotI 1.0μL，双蒸水18μL。37℃恒温水浴箱内反应6小时，通过琼脂糖凝胶电泳回收分子量为3600bp的线性化pPicZαA质粒DNA。pTG19-(Exendin-4)2-HSA作同样的双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收分子量约2000bp的(Exendin-4)2-HSA基因片段。
将回收的(Exendin-4)2-HSA基因片段与上述双酶切的表达质粒pPicZαA连接构建融合蛋白表达质粒pPicZαA-(Exendin-4)2-HSA。连接体系为：pPicZαA载体3.0μL；(Exendin-4)2-HSA片段9.5μL；10×T4DNA ligation buffer，1.5μL；T4DNAligase，1.0μL。连接反应于16℃恒温水浴锅内反应3小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α。用含抗生素Zecion的LB平板进行抗生素筛选，菌落PCR鉴定阳性克隆，送测序，测序公司为上海美吉生物医药科技有限公司。测序正确的重组克隆抽取质粒，用Sac I进行酶切线性化后，乙醇沉淀，用以转化酵母，得到表达质粒pPicZα-(Exendin-4)2-HSA。
以pPicZa-(Exendin-4)2-HSA质粒为模板，以E2FU/HSAopt6D，341CY-For/HSAopt6D，HSAopt7U/HSAdoIIID为引物分别扩增三个片段A，B，C
第一轮以pPicZα-(Exendin-4)2-HSA质粒为模板，以E2FU/HSAopt6D，341CY-For/HSAopt6D，HSAopt7U/HSAdoIIID为引物进行PCR，分别扩增A，B，C三个片段。具体引物如下：
E2FU：5’-GACTCGAGAAAAGACATGGTGAAGGTACTTTC-3’
HSAopt6D：5’-AGCATTTTGGAACTTGTATTCACCTAACTGTTCGAACAACTCACAGTTTTGT-3’
341CY-FOR：5’-TACTCTGTCGTCTTGCTATTGAGACTTGCCAAGAC-3’HSAopt7U：5’-TACAAGTTCC1AAAATGCTCTATTAGTTGCTTACACCAAGAAAGTTCCACAAGTG-3’(下划线部分由CGT突变而来，为R410A突变位点)
HSAdoIIID：5’-TTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3′
PCR体系中含模板pPicZα-(Exendin-4)2-HSA质粒0.1μL；引物E2FU/341CY-For/HSAopt7U(10μM)和HSAopt6D/HSAopt6D/HSAdoIIID(10μM)各1.0μL；2.5mM的dNTPs 4.0μL；10×pfu反应缓冲液5.0μL；5U/μL pfu 0.6μL；加入双蒸水38.3μL，体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸90秒，，循环30次；第三阶段72℃保温5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见约A(1500bp)、B(600bp)、C(250bp)电泳带，将PCR产物分别回收、纯化。
第二轮以B和C的PCR产物为模板，341CY-For，HSAdoIIID为引物PCR。
PCR体系中含模板B片段和C片段各5.0μL；引物E2FU/341CY-For/HSAopt7U(10μM)和HSAdoIIID(10μM)各1.0μL；2.5mM的dNTPs 4.0μL；10×pfu反应缓冲液5.0μL；5U/μL pfu 0.6μL；加入双蒸水30.3μL，体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57C退火30秒，72℃延伸40秒，，循环30次；第三阶段72℃保温5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见约900bp大小电泳带，将PCR产物分别回收、纯化。
第三轮以A片段和BC片段为模板，E2FU和HSAdoIIID为引物扩增获得(Exendin-4)2-HSA(R410A)基因片段。
PCR体系中含模板A片段和BC片段各3.0μL；2.5mM的dNTPs 4.0μL；10×pfu反应缓冲液5.0μL；5U/μL pfu 0.6μL；加入双蒸水32.4μL，体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性1分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸90秒，循环6次；然后加入引物E2FU(10μM)和HSAdoIIID(10μM)各1.0μL；，第一阶段93.5℃预变性1分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，循环32次；第三阶段72℃保温5分钟；所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约2000bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
pTG19 1.0μL，上述PCR产物11.5μL，10×T4DNA ligation buffer 1.5μL，T4DNA ligase 1.0μL。16℃，3小时，转化大肠杆菌DH5a，菌落PCR鉴定阳性克隆，送测序，测序公司上海美吉生物医药科技有限公司，获得pTG19-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1重组质粒。
实施例3：pTG19-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2重组质粒的构建
人血清白蛋白第410位由R突变为A，并且密码子进行了优化，编码基因表示为HSA(R410A)-OPT2，核苷酸序列为序列SEQ ID NO：6。融合蛋白编码基因为(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2，核苷酸序列为序列SEQ ID NO：8。融合蛋白重组质粒表示为pTG19-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2，构建过程如下：
使用实施例1中取得的人血清白蛋白基因通过多轮PCR进行基因改造，获得HSA(R410A)-OPT2基因片断。具体说明如下：
第一轮PCR H1-10片段扩增
以pPicZα-HSA质粒为模板，HSAoptU(1-10U)，HSAopt(1-9D，HSAdoIIID)为引物进行PCR。具体引物如下：
HSAopt1U：5’-CGCTCGAGAAAAGAGATGCTCACAAGTCTGAAGTTGCTCACAGATTCAAAGATT-3’
HSAopt2U：5’-GTCATGTGTACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTCTTGAAGAAAIACT-3’
HSAopt3U：5’-ATTGTTCTTTGCTAAACGTTACAAAGCTGCTTTTACTGAATGTTGC-3’
HSAopt4U：5’-TCTTCTGCCAAGCAAAGATTGAAGTGTGCCTCTCTACAAAAGTTTGGTGAAAGAG-3’
HSAopt5U：5’-CTGAGTTTGCTGAAGTTTCCAAGTTAGTTACTGATCTAACCAAAGTCCACACTGAATGC-3’
HSAopt6U：5’-AACCAAGATTCCATCTCCTCTAAGTTGAAGGAATGCTGTGAAAAGCCATTGTTGG-3’
HSAopt7U：5’-TACAAGTTCC1AAAATGCTCTATTAGTTGCTTACACCAAGAAAGTTCCACAAGTG-3’(下划线部分由CGT突变而来，为R410A突变位点)
HSAopt8U：5’-CCTGAAGCCAAAAGAATGCCTTGTGCAGAAGACTACTTATCCGTTGTCTTGAACC-3’
HSAopt9U：5’-TGTTTCTCTGCTTTGGAAGTCGATGAAACTTACGTTCCTAAAGAATTCAATGCT-3’
HSAopt10U：5’-AGTTGAGTTGGTTAAGCACAAGCCTAAGGCTACCAAAGAACAATTGAAAG-3’
HSAopt1D：5’-GAAAAGCAGTACACATGACATCAACTTCTGGTCTAACCAATCTGGGCAAGTTTGGG-3’
HSAopt2D：5’-GACATCCATACTTCTATGCCCCAGAATTATTGTTCTTTGCTAAACGTTAC-3’
HSAopt3D：5’-CTTTGCTTGGCAGAAGAAGCCTTACCTTCATCACGTAGTTCATCCAACTTTGGC-3’
HSAopt4D：5’-CTTCAGCAAACTCAGCCTTAGGAAATCTTTGAGACAATCTAGCAACAGCCCAGGCTTTG-3’
HSAopt5D：5’-TAGAGGAGATGGAATCTTGGTTTTCACAGATGTACTTGGCCAAGTCAGCCCTG-3’
HSAopt6D：5’-AGCATTTTGGAACTTGTATTCACCTAACTGTTCGAACAACTCACAGTTTTGT-3’
HSAopt7D：5’-GGCATTCTTTTGGCTTCAGGATGTTTACAACATTTGGAACCAACTTTGCCTAGG-3’
HSAopt8D：5’-CTTCCAAAGCAGAGAAACATGGACGTCTGTTGACCAAGGATTCAGTACAGCAT-3’
HSAopt9D：5’-GTGCTTAACCAACTCAACTAAGGCAGTTTGTTTCTTGATTTGTCTTTCCTTC-3’
HSAdoIIID：5’-TTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’
PCR体系中含模板pPicZα-HSA质粒0.1μL；引物HSAoptU(1-10U)(10μM)和HSAopt(1-9D，HSAdoIIID)(10μM)各1.0μL；2.5mM的dNTPs 4.0μL；10×pfu反应缓冲液5.0μL；5U/μL pfu 0.6μL；加入双蒸水38.3μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，，循环30次；第三阶段72℃保温5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见H1-382bp，H2-120bp，H3-129bp，H4-118bp，H5-144bp，H6-420bp，H7-140bp，H8-157bp，H9-147bp，H10-182bp电泳带，将PCR产物分别回收、纯化。
第二轮PCR H23，H45，H78，H910片段拼接
PCR体系中含模板H2/H4/H7/H9PCR产物和H3/H5/H8/H 10PCR产物各5.0μL；引物HSAopt(2U/4U/7U/9U)(10μM)和HSAopt(3D/5D/8D)/HSAdoIIID(10μM)各1.0μL；2.5mM的dNTPs 4.0μL；10×pfu反应缓冲液5.0μL；5μ/μL pfu0.6μL；加入双蒸水28.4μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环30次；第三阶段72℃延伸5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见H23-227bp，H45-247bp，H78-277bp，H910-310bp电泳带，将PCR产物分别回收、纯化。
第三轮PCR H2345，H78910片段扩增
PCR体系中含模板H23/H78 PCR产物和H45/H910 PCR产物各5.0μL；引物HSAopt(2U/7U)(10μM)和HSAopt5D/HSAdoIIID(10μM)各1.0μL；2.5mM的dNTPs 4.0μL；10×pfu反应缓冲液5.0μL；5U/μL pfu 0.6μL；加入双蒸水28.4μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环30次；第三阶段72℃保温5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见H2345-457bp，H78910-568bp电泳带，将PCR产物回收、纯化。
第四轮PCR H12345，H678910片段扩增
PCR体系中含模板H1/H6 PCR产物和H2345/H78910 PCR产物各5.0μL；引物HSAopt(1U/6U)(10μM)和HSAopt5D/HSAdoIIID(10μM)各1.0μL；2.5mM的dNTPs 4.0μL；10×pfu反应缓冲液5.0μL；5U/μL pfu 0.6μL；加入双蒸水28.4μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸70秒，，循环30次；第三阶段72℃保温5分钟。所得PCR产物经21％琼脂糖电泳检测可见H12345-820bp，H678910-970bp电泳带，将PCR产物分别回收、纯化。
第五轮PCR HSA(R410A)-OPT2片段扩增
PCR体系中含模板H12345 PCR产物和H678910 PCR产物各5.0μL；引物HSAoptlU(10μM)和HSAdoIIID(10μM)各1.0μL；2.5mM的dNTPs 4.0μL；10×pfu反应缓冲液5.0μL；5U/μL pfu 0.6μL；加入双蒸水28.4μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸110秒，，循环30次；第三阶段72℃保温5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见约1800bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
第六轮PCR 产物回收加A尾
加A体系中含HSA(R410A)-OPT2 PCR产物38μL，2.5mM dNTPs 4.0μL，25mM MgCl2 2.4μL，10×PCR缓冲液5.0μL，Taq酶(5u/μL)0.6μL；72℃保温20min。
产物回收连接T载体pTG19(购自上海捷瑞生物工程有限公司)
pTG19 1.0μL，HSA(R410A)-OPT2加A产物11.5μL，10×T4DNA ligationbuffer 1.5μL，T4DNA ligase 1.0μL。16℃，3小时，转化DH5α，菌落PCR鉴定阳性克隆，送测序，测序公司为上海美吉生物医药科技有限公司，得到pTG19-HSA(R410A)-OPT2重组质粒。
(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2融合基因的构建与克隆。
以pTG19-(Exendin-4)2质粒为模板，E2FU，E2FD为引物进行PCR。
E2FU：5’-GACTCGAGAAAAGACATGGTGAAGGTACTTTC-3′
E2FD：5’-ACCTCACTCTTGTGTGCATCAGATGGA-3′
PCR体系中含模板pTG19-(Exendin-4)2质粒0.1μL，引物E2FU(10μM)和E2FD(10μM)各1.0μL，2.5mM的dNTPs 4.0μL，10×pfu反应缓冲液5.0μL，5U/μL pfu 0.6μL，加入双蒸水38.3μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸20秒，，循环30次；第三阶段72℃保温5分钟。所得PCR产物经2％琼脂糖电泳检测可见约250bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
以pTG19-HSA(R410A)-OPT2质粒为模板，Opt1U2，HSAdoIIID为引物PCR
Opt1U2：5’-GATGCTCACAAGTCTGAAGTTGCTCACAGAT-3’
HSAdoIIID：5’-TTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3′
PCR体系中含模板pTG19-HSA(R410A)-OPT2质粒0.1μL，引物opt1U2(10μM)和HSAdoIIID(10μM)各1.0μL，2.5mM的dNTPs4.0μL，10×pfu反应缓冲液5.0μL，5U/μL pfu 0.6μL，加入双蒸水38.3μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性3分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分40秒，循环30次；第三阶段72℃保温5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约1800bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
获得的两个基因片段进行PCR拼接
E2FU：5’-GACTCGAGAAAAGACATGGTGAAGGTACTTTC-3′
HSAdoIIID：5’-TTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3′
PCR体系中含模板(Exendin-4)2PCR回收产物3.0μL，HSA(R410A)-OPT2PCR回收产物3.0μL，2.5mM的dNTPs 4.0μL，10×pfu反应缓冲液5.0μL，5U/μLpfu0.6μL，加入双蒸水32.4μL。体系总体积为50μL。PCR的反应条件为：第一阶段93.5℃预变性1分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环6次；然后加入引物E2FU(10μM)和HSAdoIIID(10μM)各1μL，第一阶段93.5℃预变性1分钟；第二阶段93.5℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，循环32次；第三阶段72℃保温5分钟，；所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约2000bp大小电泳带，将PCR产物回收、纯化。
pTG19 1.0μL，上述PCR产物11.5μL，10×T4DNA ligation buffer 1.5μL，T4DNA ligase 1.0μL。16℃，3小时，转化大肠杆菌DH5a，菌落PCR鉴定阳性克隆，送测序，测序公司上海美吉生物医药科技有限公司，获得pTG19-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2重组质粒。
实施例4：(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1、(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2表达质粒的构建
采用pPicZαA为表达载体质粒，其制备方法为常用分子生物学方法。即通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备质粒后-20℃保存待用。
具体如下，先对表达载体质粒pPicZαA，进行XhoI/NotI双酶切。表达载体质粒pPicZαA，25μL；10×H buffer 5.0μL，XhoI 1.0μL，NotI 1.0μL，双蒸水18μL。37℃恒温水浴箱内反应6小时，通过琼脂糖凝胶电泳回收分子量为3600bp的线性化pPicZαA质粒DNA。pTG19-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1、pTG19-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2作同样的双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收分子量约2000bp的(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1、(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2基因片段。
将回收的(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT 1、(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2基因片段分别与上述双酶切的表达质粒pPicZαA连接，构建融合蛋白表达质粒pPicZα-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1、pPicZα-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2。连接体系为：pPicZαA载体3.0μL；(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1、(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2片段分别为9.5μL；10×T4DNA ligation buffer，1.5μL；T4DNA ligase，1.0μL。连接反应于16℃恒温水浴锅内反应3小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α。用含抗生素Zecion的LB平板进行抗生素筛选，菌落PCR鉴定阳性克隆，送测序，测序公司为上海美吉生物医药科技有限公司。测序正确的重组克隆抽取质粒，用Pem I进行酶切线性化后，乙醇沉淀，用以转化酵母，分别得到表达质粒pPicZα-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1(构建过程见图1)、pPicZα-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2(构建过程见图2)。
实施例5：融合蛋白表达工程菌的构建
首先细胞准备：1)在YPD平板上划线培养毕赤酵母菌，30℃孵育2天。2)从平板上挑取单克隆于5.0mL YPD中，30℃振荡过夜。3)第二天早上转接至50mL YPD培养基中，培养毕赤酵母至OD600＝0.8-1.0(约108个/mL)。4)收集细胞，用25mL灭菌水洗涤，室温，3000rpm离心5min。5)去除水，用1mL100mM LiCl重悬细胞。6)将细胞悬液转至1.5mL离心管中。7)12000rpm离心细胞15s，用枪头吸去LiCl。8)在400μL 100mM LiCl中悬浮细胞。9)将50μL细胞悬浮液移到1.5mL离心管中，每次用一管，现做现用，不要置于冰上或-20℃保存。
然后转化：1)煮沸单链DNA 5min，快速放于冰水中使变冷，后置于冰上。2)取上面第7步中细胞，12000rpm离心细胞15s，去除LiCl。3)每个转化样品，按顺序加入下列试剂。240μL 50％PEG，36μL 1M LiCl，25μL 2mg/mL单链DNA，溶解于50μL灭菌水中的质粒DNA(5-10μg)4)剧烈涡旋细胞沉淀至完全混匀1min。5)在30℃孵育30min(不要摇动)。6)在42℃水浴热击20-25min。7)6000-8000rpm离心，将转化溶液转移走。8)用1mL YPD重悬细胞沉淀，在30℃，200rpm，孵育2-4小时。9)在YPDZ平板上涂100μL，在30℃孵育2-4天，筛选转化子。
最后转化成功，pPicZα-(Exendin-4)2-HSA、pPicZα-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1、pPicZα-(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2分别转化后均得到了大于50个转化子。
实施例6：(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白表达和纯化
1)分别将实施例5所得酵母菌株接种至10mLYPD培养基中，30℃，250rpm培养24-48小时。2)室温3000rpm，5min离心去上清，加入10mL灭菌水重悬3)室温3000rpm，5min离心去上清，加入配制好的BMMY培养基(100mM磷酸盐缓冲液pH＝6.0，1％甲醇)5.0mL重悬，30℃，250rpm培养，每隔12hr左右加一次甲醇，甲醇终浓度为1％，每隔24hr取一次上清。4)连续培养72hr，收上清。5)每次收取的样品12000rpm，1min离心，保留上清。6)上清样品SDS-PAGE，检测表达(图3和图4)。
收集上清液，热处理后，选择阳离子交换层析柱，使用SP Sepharose FF为填料，成功捕获了发酵液中的产物(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白。捕获的(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白再经过疏水型层析柱Phenyl sepharose FF(high)。阴离子交换层析Q Sepharose FF进行精细纯化，目标蛋白质的纯度可以达95％以上(图3和图5)。
实施例7：(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1和(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2融合蛋白的短效活性观察
昆明小鼠，雄性，适应性喂养7天后，将25只小鼠随机分为5组，分别为PBS溶媒对照组(含0.05％吐温20的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液)、实施例6融合蛋白组(3组)，Exendin-4组，每组5只。皮下注射(Exendin-4)2-HSA(10mg/kg)、(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1(10mg/kg)、(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2(10mg/kg)、Exendin-4(0.01mg/kg)。
禁食3h后，检测空腹血糖。各药物组皮下注射各浓度药物，对照组小鼠皮下注射等量磷酸盐缓冲液。各组小鼠分别于给药后60min灌胃2.5g/kg葡萄糖，并于给糖后0.5h、1h、2h对小鼠进行剪尾取血，用血糖仪测定血样中葡萄糖含量，观察上述待试品对小鼠血糖的影响。结果表明，本发明融合蛋白能有效地降低空腹血糖浓度，同时使血糖浓度曲线趋于平稳(图示6)。
实施例8：(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1融合蛋白的长效活性观察
小鼠适应性喂养3天后，将20只小鼠随机分为4组，每组5只。分别为PBS溶媒对照组、(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT1(10mg/kg)、(Exendin-4)2-HSA(10mg/kg)及Exendin-4(10μg/kg)组。第一天禁食3h后，检测空腹血糖，称重后皮下注射给相应剂量药物，各组小鼠分别于给药后60min灌胃给予2.5g/kg葡萄糖，第二天、第三天、第四天分别在禁食3h后检测24h、48h、72h的空腹血糖及给糖后0.5h、1h、2h的血糖值。
结果显示：在给药24h、48h、72h后，相比于(Exendin-4)2-HSA融合蛋白，本发明(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白降低血糖的作用更强，血糖浓度波动较小，表明具有更好的长效特性(图示7)。
实施例9：(Exendin-4)2-HSA(R410A)-OPT2融合蛋白的长效活性观察
小鼠适应性喂养3天后，将30只小鼠随机分为6组，每组5只。分别为PBS溶媒对照组、(Exendin-4)2-HSA(R410A)48h(10mg/kg)、(Exendin-4)2-HSA48h(10mg/kg)、(Exendin-4)2-HSA(R410A)96h(10mg/kg)、(Exendin-4)2-HSA96h(10mg/kg)及Exendin-4(10μg/kg)组。于d5日禁食3h后，检测空腹血糖。各药物组皮下注射各浓度药物，对照组小鼠皮下注射等量磷酸盐缓冲液。各组小鼠分别于给药后60min灌胃2.5g/kg葡萄糖，并于给糖后0.5h、1h、2h对小鼠进行剪尾取血，检测血糖。
结果显示：在给药48h后，相比于(Exendin-4)2-HSA融合蛋白组，本发明(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白明显降低血糖的作用更强，血糖浓度波动较小，表明具有更好的长效特性(图示8)。
Claims (8)
1.一种促胰岛素分泌肽与突变人血清白蛋白的融合蛋白，其中含有2个多肽区，其1区由2个Exendin-4串联，其2区是410位由R突变为A的人血清白蛋白HSA(R410A)，1区通过其C-末端与第2区的N-末端直接连接，其结构表述为：(Exendin-4)2-HSA(R410A)。
2.如权利要求1所述的(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白，其中Exendin-4重复序列之间的连结方式为：上一个Exendin-4的C末端与下一个Exendin-4的N末端直接连接，融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
3.一种编码权利要求2所述(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7
4.一种编码权利要求2所述(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO：8
5.一种质粒载体，包含权利要求3或4所述的多核苷酸。
6.一种转化的酵母菌，其被权利要求5所述质粒载体所转化。
7.一种权利要求2所述(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白的制备方法，包括使用PCR方法进行基因片段扩增和拼接、表达质粒的构建、表达工程菌的构建、转录、翻译、蛋白分离和纯化。
8.权利要求2所述(Exendin-4)2-HSA(R410A)融合蛋白在制备非胰岛素依赖性糖尿病治疗制剂中的应用。
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