CN102732549A - 一种重组胰岛素样生长因子-i的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组胰岛素样生长因子-I的制备方法，先将5’端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列编码基因的胰岛素样生长因子-I的编码基因克隆入原核表达载体，构建成重组原核表达载体；而后将重组原核表达载体转入合适的原核宿主细胞；而后培养原核宿主细胞，表达可溶性含胰岛素样生长因子-I的融合蛋白；最后分离出含胰岛素样生长因子-I的融合蛋白，用烟草蚀纹病毒蛋白酶酶解后，再分离获得重组胰岛素样生长因子-I。本发明制备IGF-I的方法与现有化学裂解法或酵母系统生产相比，表达量高，成本低，有利于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及重组蛋白的制备工艺，特别是利用基因重组技术制备重组胰岛素样生长因子-I的制备方法。
背景技术
上世纪五十年代，Salmon和Daughaday发现有这么一类生物活性物质，它能促进软骨对硫的吸收，从而促进人体骨骼的生长，当时他们将之命名为“硫化因子”（Sulphate FactorSF）。后来经进一步研究发现，该因子具有与胰岛素相类似的功能，如降血糖、降血脂的作用，所以又被冠名为“胰岛素样生长因子”（Insulin-like Growth Factors,IGFs），该称谓就延用至今（Macauley VM，Annu Rev Physiol 1993：55：l31-153）。
已知胰岛素样生长因子（IGFs）是由两类物质组成，即IGF-I和IGF-II（Klapper，et al．，（1983）Endocrinol 112：2215and Rinderknecht，et al．，（1978）Febs．Lett．89：283）。在人体内，IGF-I是主要部分，能分泌IGF-I的人体细胞有肝细胞、肾细胞、脾细胞等多达十几种。而IGF-II更多的是参与胚胎的发育，在人体内的重要性及功能的广泛性不及IGF-I。
胰岛素样生长因子-I（IGF-I）基因位于12号染色体，编码分子量为7648的70个氨基酸组成的单链多肽，含三个二硫键。它的结构、生物学性质和化学性质与胰岛素有相似之处。有关研究证明IGF-I介导生长激素的作用而促进生物的生长，因此像骨骼生长、细胞复制和另外一些与生长相关的过程均受IGF-I水平的影响（Timsit J.et al，J.Clin.Endocrinol.Metab，l92；75：l83-l88）。现已证明IGF-I在人体内有极其重要并且丰富的生物学功能，如促生长、促分化、参与糖代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢等，与生长荷尔蒙的作用相类似，都是起非常作用的生长因子。
胰岛素样生长因子-I的生理浓度受甲状腺疾病、糖尿病和营养不良的影响（Horm et al.,Blood l983；4：108）胰岛素样生长因子-I与另外一些生长因子有协同作用，如它可以促进软组织和间叶组织损伤的修复（Suh DY，et a1.,Endocrinology l992：l3l：2399-2403），它可以促进哺乳动物细胞在无血清培养基中的生长等（Burleigh et a1．American BiotechLab 1986；4：48）。近年来胰岛素样生长因子-I在国外主要用于ALS（肌营养不良性脊髓侧索硬化症）、周围神经疾病、运动神经元疾病和脊髓灰质炎后综合症。Cephalon公司的基因工程产品重组胰岛素样生长因子-I已获得美国FDA批准，投入市场，用于治疗原发性IGF-I缺陷引起的侏儒症。另有Pharmcia用之于生长激素受体缺乏症（GHRD）的治疗和生长迟缓抗体阳性GH缺乏症LA的治疗也已进入三期临床工作。此外Genentech公司用于糖尿病的治疗和Chiron公司用于肾衰的治疗也都进入了二期临床实验阶段。
美国儿科学院和美国临床内分泌学院将在人群平均高度以下大于两倍标准差的高度定义为身材矮小症。身材矮小症患儿身高在类似年龄和性别的儿童的97．5％以下，一般男孩和女孩的最终成年高度不超过约5’4”和4’11”。根据儿科内分泌学家的评估，估计美国有380，000儿童患有身材矮小症。
身材矮小症更通常与低水平IGF-I有关而不是与GH低分泌相关。此外，身材矮小症与低水平IGF-I的相关性比与低水平GHBP（生长激素结合蛋白）的相关性更好。正如医生用标准差评分（SDS）表征身高，IGF-l标准差评分（IGF-I SDS）说明了一个人的IGF-I水平距离相似年龄和性别的人群的平均水平有多少个标准差。还有，已发现，许多患有极严重或严重身材矮小症（身高-3SDS）的儿童的GH分泌至少是正常值，但非常缺乏IGF，即他们的IGF-1水平是-3SDS评分或更低。这些患者的特征是患有严重的原发性胰岛素样生长因子-I缺陷（IGFD）。临床研究表明，给予原发性胰岛素样生长因子-I缺陷（IGFD）患者IGF-I治疗，能显著改善这类患者的身高。
鉴于科胰岛素样生长因子-I（IGF-1）在临床和科学研究上的应甩，以及天然产品在分离纯化技术上的难度，应用重组DNA技术即基因工程的方法制备胰岛素样生长因子-I（IGF-1）有着重要的意义。
目前胰岛素样生长因子-I（IGF-1）的生产方法为酵母细胞生产，或者大肠杆菌表达后用羟胺裂解。酵母细胞生产周期较长，产量也不高，且在发酵过程中有降解产物出现；而羟胺化学裂解法有一定危险性，特异性也不高，容易产生副产物，且不易放大。本发明提供的生产工艺安全，简单，特异性高，有利于大规模生产。
发明内容
本发明提供了一种安全简单，成本低，有利于大规模生产的利用基因重组技术制备重组胰岛素样生长因子-I（IGF-I）的方法。
本发明提供的重组胰岛素样生长因子-I的制备方法包括下列步骤：
1）将5’端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列编码基因的胰岛素样生长因子-I编码基因克隆入原核表达载体，构建成重组原核表达载体；
2）将步骤1构建的重组原核表达载体转入合适的原核宿主细胞；
3）培养步骤2的原核宿主细胞，使其表达可溶性含胰岛素样生长因子-I的融合蛋白；
4）分离出含胰岛素样生长因子-I的融合蛋白，用烟草蚀纹病毒蛋白酶酶解后，再分离获得重组胰岛素样生长因子-I。
步骤1所述烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列的氨基酸序列为：
ENLYFQG.（SEQ ID NO:1）
其编码基因的核苷酸序列为：
gaa aac ctg tat ttt cag GGC（SEQ ID NO:2）
步骤1所述胰岛素样生长因子-I编码基因经优化，其核苷酸序列为：
5’GGC CCA GAA ACC CTG TGT GGT GCT GAA CTG GTA GAT GCT CTG CAG TTC GTG TGCGGT GAC CGT GGC TTC TAC TTT AAC AAG CCG ACT GGT TAC GGT TCT TCT TCC CGC CGT GCCCCG CAG ACC GGC ATC GTT GAT GAA TGC TGC TTC CGT AGC TGC GAC CTG CGC CGT CTG GAGATG TAT TGT GCG CCG CTG AAA CCG GCG AAA TCT GCA TAA 3’（SEQ ID NO:3）
步骤1所述5’端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列编码基因的重组胰岛素样生长因子-I编码基因的核苷酸序列为：
gaa aac ctg tat ttt cag GGC CCA GAA ACC CTG TGT GGT GCT GAA CTG GTA GAT GCTCTG CAG TTC GTG TGC GGT GAC CGT GGC TTC TAC TTT AAC AAG CCG ACT GGT TAC GGT TCTTCT TCC CGC CGT GCC CCG CAG ACC GGC ATC GTT GAT GAA TGC TGC TTC CGT AGC TGC GACCTG CGC CGT CTG GAG ATG TAT TGT GCG CCG CTG AAA CCG GCG AAA TCT GCA TAA 3’（SEQID NO:4）
很显然，步骤1克隆时应保证读框正确。
较佳的，步骤1所述原核表达载体为含有强启动子T7启动子的原核表达载体。
最佳的，所述原核表达载体选用pET32a(+)。该表达载体含有强启动子T7启动子，可利用IPTG诱导T7聚合酶，显著提高目的基因的表达水平，且该质粒含有His-tag和S-Tag序列，便于表达蛋白的鉴定和纯化当原核表达载体。
选用pET32a(+)时，可将所述5’端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列编码基因的重组胰岛素样生长因子-I编码基因克隆入pET32a(+)的Kpn I与Hind III酶切之间，以与硫氧还蛋白融合表达。
当选用的原核表达载体为pET32a(+)时，步骤3表达的融合蛋白为硫氧还蛋白与胰岛素样生长因子-I的融合蛋白。
较佳的，步骤2所述原核宿主细胞为大肠杆菌。较佳的，为大肠杆菌BL21(DE3)。表达菌株BL21（DE3）能高效表达控制于T7启动子和核糖体结合位点的外源基因，它不表达ompT和lon（1）蛋白酶，因此表达产物比较稳定，不会被菌株内源性的蛋白酶所降解。
步骤4后，还可采用常规方法经透析、浓缩、病毒灭活及灌装或冻干等步序后制成浓缩液或粉剂
步骤4具体可包括下列步骤：
a：离心分离发酵液中的菌体，重悬后破菌并离心取上清液；
b：上清液采用亲和层析法初步分离含胰岛素样生长因子-I的融合蛋白；
c：用烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切经步骤a分离的融合蛋白获得酶解夜。
d：采用亲和柱串连反相柱的层析法纯化酶解液，分离得到重组胰岛素样生长因子-I。
e：离子交换法进一步纯化重组胰岛素样生长因子-I及去除有机试剂。
步骤a中，离心分离发酵液中的菌体后，可采用pH7.0～8.0的10~20mM磷酸盐缓冲液重悬菌体。
具体的，步骤b为：先用平衡液平衡亲和层析柱；在上清液中加入咪唑及NaCI，使溶液中咪唑终浓度为10~20mM，NaCl终浓度为400-600mM，然后上亲和层析柱；用平衡液清洗亲和柱后，再用洗脱液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
步骤b中所述平衡液为含l0~20mM咪唑及400-600mM NaCl的pH7.0～8.0的10~20mM磷酸盐缓冲液，所述洗脱液为含200~250mM咪唑，400-600mM NaCl的pH7.0～8.0的10~20mM磷酸盐缓冲液。
步骤b中，所述平衡液、上清液及洗脱液中的NaCl浓度相同，磷酸盐缓冲液的pH值及浓度保持一致。
步骤b的亲和层析法可采用Chelating Sepharose F．F．层析柱。
具体的，步骤c为：将步骤b收集的活性蛋白峰流出液稀释5～10倍，烟草蚀纹病毒蛋白酶于4~8℃酶切16～20小时。
所述烟草蚀纹病毒蛋白酶与融合蛋白的重量比为l/2000～1/500。融合蛋白的重量可通过采用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定流出液的浓度换算。
步骤d采用反相柱串联层析柱，目的是将目的蛋白即重组IGF-I穿透Ni2+ChelatingSepharose F．F．亲和柱，而使硫氧还蛋白与亲和柱结合，而目的蛋白与反相柱C18结合，再进行洗脱。
具体的，步骤d可选自以下任一：
a)采用亲和柱在上反相柱在下的串联层析柱，先用平衡液平衡串联层析柱，将酶解液上柱；用平衡缓冲液清洗串联层析柱后将串联的亲和柱与反相柱分开，反相柱用洗脱液洗脱得到重组胰岛素样生长因子-I；
b)先用平衡液平衡亲和柱，将酶解液上柱后收集流出液；用平衡液平衡反相柱，将流出液上反相柱，用平衡缓冲液清洗反相柱后，用洗脱液洗脱得到重组胰岛素样生长因子-I。
步骤d中所述平衡液为pH7.5～8．0的10～20mM磷酸盐缓冲液，所述洗脱液为体积百分比为20～80％乙醇水溶液，或者采用体积百分比为20～80％异丙醇水溶液线性梯度洗脱。
步骤d所述亲和柱可采用Ni2+Chelating Sepharose F．F．层析柱、DEAE层析柱或Q柱，优选Ni2+Chelating Sepharose F．F．层析柱。
步骤d所述反相柱可采用C18反相柱、Source 15RPC反相柱或30RPC反相柱，优选C18反相柱。
步骤e的目的是进一步纯化目的多肽及除去有机试剂乙醇或异丙醇。
具体的，步骤e为：采用平衡液平衡离子交换柱后，将步骤d获得的洗脱液上柱，用平衡液清洗后，用洗脱液洗脱得到目的蛋白。
步骤e中所述平衡液为pH7.0～8.0的10~20mM磷酸盐缓冲液，所述洗脱液为含300～500mM NaCl的pH7.0～8.0的l0~20mM磷酸盐缓冲液。
步骤e中的离子交换柱可采用CM Sepharose F.F离子交换柱或SP Sepharose F．F．离子交换柱。
采用本发明优化后的基因以及独特的纯化方法纯化后，融合蛋白的表达量相比没有优化的天然基因，表达水平提高了2-3倍；目的蛋白的纯度可达98％以上，得率达到50mg/L发酵液，比传统的10-20mg/L有了大幅度的提高。
本发明制备IGF-I的方法与现有化学裂解法或酵母系统生产相比，成本低，有利于大规模生产。
附图说明
图1为pET-32a(+)载体物理图谱；
图2为pET32a(+)Polylinker区顺序；
图3为融合蛋白在转化体E.coli内表达的SDS-PAGE电泳分析；
左起第1泳道：标准分子量Marker
左起第2泳道：诱导前
左起第3泳道：密码子优化过的序列表达
左起第4泳道：密码子未优化的序列表达
图4为融合蛋白在转化体E.coli内表达的SDS-PAGE电泳分析；
M：标准蛋白质分子量；
1：诱导前；
2：诱导4小时；
图5为30升发酵罐发酵融合蛋白在转化体内表达的SDS-PAGE电泳分析；
M：标准蛋白质分子量；
1：诱导前；
2：诱导4小时；
图6为融合蛋白经烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切后的SDS-PAGE电泳分析；
M：标准蛋白质分子量；
1：融合蛋白；
2：烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切16小时；
图7为纯化后的重组胰岛素样生长因子-I（IGF-I）蛋白的SDS-PAGE电泳分析；
M：标准蛋白质分子量；
1：纯化后样品10ug（氧化）；
2：纯化后样品10ug（还原）；
图8为纯化后的重组胰岛素样生长因子-I（IGF-I）蛋白的HPLC的检测结果。
注：标准蛋白质分子量（从上至下）：97K,66K,45K,30K,20K,14.4K
具体实施方式
本发明利用基因重组技术制备重组胰岛素样生长因子-I，先人工合成全序列胰岛素样生长因子-I（IGF-I）基因，在其5’端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列的编码基因，并进一步在其两端引入酶切位点，双酶切后，克隆入经双酶切的表达载体构建成重组表达质粒。重组质粒导入宿主大肠杆菌构成原核表达系统，进而在表达系统内表达融合蛋白，融合蛋白用烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切后纯化获得终产物。
本发明在胰岛素样生长因子-I（IGF-I）基因序列中引入Kpn I、Hind III酶切位点和肠激酶或烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列。与重组体质粒pET32a(+)载体上的Kpn I、HindIII酶切位点一致。重组体所用质粒为pET32a(+)，表达菌株为BL2l（DE3）购自Novagen公司，宿主菌株为DH5α购自Promega公司。pET32a(+)全长5900bp，用于在大肠杆菌中克隆外源基因并与硫氧还蛋白（Thioredoxin，简称Trx）以融合蛋白形式表达。
本发明所述烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV Protease)是来源于烟草蚀纹病毒(TEV)的Nla蛋白酶或者其改进酶。TEV蛋白酶具有很强的位点特异性，能够识别EXXYXQ(G/S)的七氨基酸序列，本发明选用的识别序列为ENLYFQG，其切割位点在谷氨酰胺和甘氨酸或丝氨酸之间。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
1.序列的合成
全序列由上海生工生物工程公司合成，并在序列中引入Kpn I、Hind III酶切位点和肠激酶或烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列。序列如下：
核苷酸序列为SEQ ID NO:5：GAT CTG GGT ACC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGC CCA GAA ACC CTG TGT GGT GCT GAA CTGGTA GAT GCT CTG CAG TTC GTG TGC GGT GAC CGT GGC TTC TAC TTT AAC AAG CCG ACT GGTTAC GGT TCT TCT TCC CGC CGT GCC CCG CAG ACC GGC ATC GTT GAT GAA TGC TGC TTC CGTAGC TGC GAC CTG CGC CGT CTG GAG ATG TAT TGT GCG CCG CTG AAA CCG GCG AAA TCT GCATAA AAG CTT GCG G
其中：
碱基第7-12位为Kpn I酶切识别位点；
碱基第13-33位为烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点编码基因对应的核苷酸序列；
碱基第31-243位为IGF-I编码基因；
碱基第244-249位为HindIII酶切识别位点。
2.融合表达载体pET32a(+)-IGF-I的构建
将人工合成的重组IGF-I基因序列以及天然的IGF-I基因序列经Kpn I/Hind III双酶切后克隆于经Kpn I/HindIII双酶切的pET32a(+)中，T4DNA连接酶（Promega公司），2～16℃，1～30小时，然后CaCl2法（分子克隆实验指南，第二版，科学出版社）转化DH5α菌，Amp抗性筛选阳性克隆，再经Kpn I和HindIII双酶切鉴定得到重组质粒pET32a(+)-IGF-I，结果表明已获得正确插入重组IGF-I基因融合表达载体。
以T7terminator primer为引物，以pET32a(+)-IGF-I为模板，对该重组质粒中的重组IGF-I基因进行序列分析，重组质粒用T7terminator引物测序得到序列结果为SEQ ID NO:6。结果表明：以此DNA序列推导的重组IGF-I的氨基酸序列与文献报道及实验设计完全一致。
3.pET32a(+)-IGF-I/BL21(DE3)表达系统的建立
将重组质粒pET32a(+)-IGF-I以CaCl2法（分子克隆实验指南，第二版，科学出版社）转化受体菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。选择表达相对最高的一株作为重组IGF-I融合表达工程菌（pET32a(+)-IGF-I/BL21(DE3)）。
同样方法，利用文献报道天然IGF-I密码子构建IGF-I密码子未优化的重组IGF-I融合表达工程菌。
4.外源基因在转化体中的表达及SDS-PAGE电泳分析
将经筛选的重组IGF-I工程菌划线在含100ul/ml氨苄青酶素的LB琼脂平板上，37℃培养16小时。挑选生长良好的单菌落，接种于LB培养液（含Amp l00ug/ml），37℃培养过夜。将过夜菌以1：50接种于20ml LB培养液中（含Amp l00ug/rnl），37℃振荡培养。当OD600达0.6-0.8时，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导4小时。菌液经5000rpm，5min离心，去培养基上清，沉淀菌体加入上样缓冲液，100℃水浴3min，离心后上SDS-PAGE电泳（积层胶5％，分离胶15％），染色，脱色，扫描分析。因Trx-IGF-I融合基因长687bp，融合蛋白含230个氨基酸，理论分子量约为24.9KD。SDS-PAGE结果表明：在22KD和30KD之间有明显表达条带，与预期相符，融合蛋白占菌体总蛋白的30％左右。见图3、4。相比密码子未优化的重组IGF-I融合表达工程菌，经密码子优化的重组IGF-I融合表达工程菌的表达量提高了2-3倍。
发酵工艺
种子活化：自保存的经密码子优化的重组IGF-I融合表达工程菌斜面上取一环菌种接入30ml LB培养液中（含100ug/ml氨苄青酶素），37℃，200rpm摇瓶培养15小时。
种子液制备：取活化种子，按10％接种量接于2000ml M9+LB培养液中（含100ug/ml氨苄青酶素），37℃，250rpm摇瓶培养6小时。
30升发酵罐发酵：将种子液按6％接种量加入装有M9+LB培养基的发酵罐中，37℃，控制PH值在7．0左右，由通气及搅拌速度控制溶氧在30％以上。OD600为20～30时，加入IPTG至终浓度为0.5rnM，诱导4.0小时收菌。
SDS-PAGE测蛋白表达量。积层胶5％，分离胶15％，目的蛋白分子量约为24．9KD，约占菌体总蛋白的30％左右。每升发酵液可获目标蛋白约50mg，见图5。
5.蛋白纯化工艺
菌体处理：将发酵培养后的菌体4℃，9000rpm离心25分钟，弃上清液。用10倍菌体重量的磷酸盐缓冲液（pH7.0的10mM的磷酸盐缓冲液）悬浮菌体，然后APV-1000匀浆机（Invensys公司）循环破菌3次。4℃，9000rpm离心30分钟，取上清液，于4℃静止3小时后，再4℃，9000rpm离心30分钟，取上清液。
四步法纯化IGF-I重组蛋白：本纯化步骤所用设备为通用电气公司（GE）AKTAPurifier 100或者AKTA Primer，所有填料均为该公司产品。
第一步Chelating Sepharose F.F.亲和层析法：先用含10mM磷酸盐（pH7.0）l0mM咪唑600mM NaCl的缓冲液平衡亲和柱，菌体处理后得到上清液中加入1M咪唑及NaCI固体使溶液中含有10mM咪唑，600mMNaCl，然后上柱，流速为10mL/min（柱床体积200mL），用4~5柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用10mM磷酸盐缓冲液（pH7.0），200mM咪唑，600mM NaCl，洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
第二步酶解融合蛋白：将第一步所收集活性蛋白峰流出液用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定浓度后稀释5倍，用l/1000（w/w，烟草蚀纹病毒蛋白酶/融合蛋白）烟草蚀纹病毒蛋白酶于4~8℃酶切16～20小时。
第三步Chelating Sepharose F.F.与C18反相柱串连层析法：本实验步骤目的是将目的蛋白即重组IGF-I穿透Ni 2+Chelating Sepharose F．F．亲和柱，而使硫氧还蛋白与亲和柱结合，目的蛋白与C18反相柱结合，再进行洗脱。方法为将Ni 2+ChelatingSepharose F．F．与C18反相柱串连好后用10mM磷酸盐缓冲液（pH7.5）平衡，将上一步得到的酶解液上柱，流速为10mL/min，用平衡缓冲液清洗后将两个柱子分开，将C18反相柱．柱用20～80％乙醇或异丙醇线性梯度洗脱得到目的蛋白。或者Ni 2+Chelating Sepharose F．F．和C18反相柱不串联而分别进行纯化，或采用DEAE或Q柱代替Ni2+Chelating Sepharose F．F．进行纯化。反相柱也可以为Source 15RPC或30RPC。
第四步CM Sepharose F.F离子交换法：本步骤的目的是进一步纯化目的多肽及除去有机试剂乙醇或异丙醇。10mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）平衡柱后上柱，流速为l0mL/min（柱床体积200mL），清洗后以含300m mM NaCl的l0mM pH7.0的磷酸盐缓冲液洗脱，得到目的蛋白，经SDS-PAGE电泳和HPLC检测纯度达98％以上。见图7，图8。步骤4中离子交换法采用的填料也可以为SP Sepharose F．F．。
实施例2
采用实施例1构建的经密码子优化的重组IGF-I工程菌，采用实施例1的方法发酵获得发酵液。
菌体处理：将发酵液4℃，9000rpm离心25分钟，弃上清液。用10倍菌体重量的磷酸盐缓冲液（pH8.0的15mM的磷酸盐缓冲液）悬浮菌体，破菌3次。4℃，9000rpm离心30分钟，取上清液，于4℃静止3小时后，再4℃，9000rpm离心30分钟，取上清液。
四步法纯化IGF-I重组蛋白：
第一步Chelating Sepharose F.F.亲和层析法：先用含15mM磷酸盐（pH8.0）20mM咪唑500mM NaCl的缓冲液平衡亲和柱，菌体处理后得到上清液中加入1M咪唑及NaCI固体使溶液中含有20mM咪唑，500mM NaCl，然后上柱，流速为10mL/min（柱床体积200mL），用4~5柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用15mM磷酸盐缓冲液（pH8.0），250mM咪唑，500mMNaCl，洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
第二步酶解融合蛋白：将第一步所收集活性蛋白峰流出液用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定浓度后稀释5倍，用l/2000（w/w，烟草蚀纹病毒蛋白酶/融合蛋白）烟草蚀纹病毒蛋白酶于4~8℃酶切16～20小时。
第三步Chelating Sepharose F.F.与C18反相柱串连层析法：本实验步骤目的是将目的蛋白即重组IGF-I穿透Ni2+Chelating Sepharose F．F．亲和柱，而使硫氧还蛋白与亲和柱结合，目的蛋白与C18反相柱结合，再进行洗脱。方法为将Ni 2+Chelating SepharoseF．F．与C18反相柱串连好后用15mM磷酸盐缓冲液（pH8．0）平衡，将上一步得到的酶解液上柱，流速为10mL/min，用平衡缓冲液清洗后将两个柱子分开，将C18反相柱．柱用20～80％乙醇或异丙醇线性梯度洗脱得到目的蛋白。或者Ni2+Chelating Sepharose F．F．和C18反相柱不串联而分别进行纯化，或采用DEAE或Q柱代替Ni2+Chelating SepharoseF．F．进行纯化。反相柱也可以为Source 15RPC或30RPC。
第四步SP Sepharose F．F．离子交换法：本步骤的目的是进一步纯化目的多肽及除去有机试剂乙醇或异丙醇。15mM磷酸盐缓冲液（pH8.0）平衡柱后上柱，流速为l0mL/min（柱床体积200mL），清洗后以含400m mM NaCl的15mM pH8.0的磷酸盐缓冲液洗脱，得到目的蛋白，经SDS-PAGE电泳和HPLC检测纯度达98％以上。
实施例3
采用实施例1构建的经密码子优化的重组IGF-I工程菌，采用实施例1的方法发酵获得发酵液。
菌体处理：将发酵液4℃，9000rpm离心25分钟，弃上清液。用10倍菌体重量的磷酸盐缓冲液（pH7.5的20mM的磷酸盐缓冲液）悬浮菌体，破菌3次。4℃，9000rpm离心30分钟，取上清液，于4℃静止3小时后，再4℃，9000rpm离心30分钟，取上清液。
四步法纯化IGF-I重组蛋白：
第一步Chelating Sepharose F.F.亲和层析法：先用含20mM磷酸盐（pH7.5）15mM咪唑400mM NaCl的缓冲液平衡亲和柱，菌体处理后得到上清液中加入1M咪唑及NaCI固体使溶液中含有15mM咪唑，400mM NaCl，然后上柱，流速为10mL/min（柱床体积200mL），用4~5柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用20mM磷酸盐缓冲液（pH7.5），200mM咪唑，400mMNaCl，洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
第二步酶解融合蛋白：将第一步所收集活性蛋白峰流出液用考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定浓度后稀释10倍，用1/500（w/w，烟草蚀纹病毒蛋白酶/融合蛋白）烟草蚀纹病毒蛋白酶于4~8℃酶切16～20小时。
第三步Chelating Sepharose F.F.与C18反相柱串连层析法：本实验步骤目的是将目的蛋白即重组IGF-I穿透Ni 2+Chelating Sepharose F．F．亲和柱，而使硫氧还蛋白与亲和柱结合，目的蛋白与C18反相柱结合，再进行洗脱。方法为将Ni 2+Chelating SepharoseF．F．与C18反相柱串连好后用20mM磷酸盐缓冲液（pH7.5）平衡，将上一步得到的酶解液上柱，流速为10mL/min，用平衡缓冲液清洗后将两个柱子分开，将C18反相柱．柱用20～80％乙醇或异丙醇线性梯度洗脱得到目的蛋白。或者Ni2+Chelating Sepharose F．F．和C18反相柱不串联而分别进行纯化，或采用DEAE或Q柱代替Ni2+Chelating SepharoseF．F．进行纯化。反相柱也可以为Source 15RPC或30RPC。
第四步SP Sepharose F．F．离子交换法：本步骤的目的是进一步纯化目的多肽及除去有机试剂乙醇或异丙醇。20mM磷酸盐缓冲液（pH7.5）平衡柱后上柱，流速为l0mL/min（柱床体积200mL），清洗后以含500m mM NaCl的20mM pH7.5的磷酸盐缓冲液洗脱，得到目的蛋白，经SDS-PAGE电泳和HPLC检测纯度达98％以上。
Claims (10)
1.一种重组胰岛素样生长因子-I的制备方法包括下列步骤：
1）将5’端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列编码基因的重组胰岛素样生长因子-I的编码基因克隆入原核表达载体，构建成重组原核表达载体；
2）将步骤1构建的重组原核表达载体转入合适的原核宿主细胞；
3）培养步骤2的原核宿主细胞，使其表达可溶性含胰岛素样生长因子-I的融合蛋白；
4）分离出含胰岛素样生长因子-I的融合蛋白，用烟草蚀纹病毒蛋白酶酶解后，再分离获得重组胰岛素样生长因子-I。
2.如权利要求1所述重组胰岛素样生长因子-I的制备方法，其特征在于：步骤1）所述5’端引入烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列编码基因的重组胰岛素样生长因子-I的编码基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO:4。
3.如权利要求1所述重组胰岛素样生长因子-I的制备方法，其特征在于：步骤1）所述原核表达载体为含有强启动子T7启动子的原核表达载体，步骤2）所述原核宿主细胞为大肠杆菌。
4.如权利要求1所述重组胰岛素样生长因子-I的制备方法，其特征在于：步骤4）具体包括下列步骤：
a：离心分离发酵液中的菌体，重悬后破菌并离心取上清液；
b：上清液采用亲和层析法初步分离含胰岛素样生长因子-I的融合蛋白；
c：用烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切经步骤b分离的融合蛋白获得酶解夜；
d：采用亲和柱串连反相柱的层析法纯化酶解液，分离得到重组胰岛素样生长因子-I；
e：离子交换法进一步纯化重组胰岛素样生长因子-I及去除有机试剂。
5.如权利要求4所述重组胰岛素样生长因子-I的制备方法，其特征在于：步骤b具体为：先用平衡液平衡亲和层析柱；在上清液中加入咪唑及NaCI，使溶液中咪唑终浓度为10-20mM，NaCl终浓度为400-600mM，然后上亲和层析柱；用平衡液清洗亲和柱后，再用洗脱液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液；所述平衡液为含l0-20mM咪唑及400-600mM NaCl的pH7.0～8.0的10-20mM磷酸盐缓冲液；所述洗脱液为含200-250mM咪唑，400-600mM NaCl的pH7.0～8.0的10-20mM磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求4所述重组胰岛素样生长因子-I的制备方法，其特征在于，步骤d可选自以下任一：
a)采用亲和柱在上反相柱在下的串联层析柱，先用平衡液平衡串联层析柱，将酶解液上柱；用平衡缓冲液清洗串联层析柱后将串联的亲和柱与反相柱分开，反相柱用洗脱液洗脱得到重组胰岛素样生长因子-I；
b)先用平衡液平衡亲和柱，将酶解液上柱后收集流出液；用平衡液平衡反相柱，将流出液上反相柱，用平衡缓冲液清洗反相柱后，用洗脱液洗脱得到重组胰岛素样生长因子-I。
7.如权利要求6所述重组胰岛素样生长因子-I的制备方法，其特征在于，步骤d中所述平衡液为pH7.5～8．0的10～20mM磷酸盐缓冲液，所述洗脱采用体积百分比为20～80％乙醇水溶液或者20～80％异丙醇水溶液线性梯度洗脱。
8.如权利要求4所述重组胰岛素样生长因子-I的制备方法，其特征在于，步骤e具体为：采用平衡液平衡离子交换柱后，将步骤d获得的洗脱液上柱，用平衡液清洗后，用洗脱液洗脱得到目的蛋白。
9.如权利要求8所述重组胰岛素样生长因子-I的制备方法，其特征在于，步骤e中所述平衡液为pH7.0～8.0的10～20mM磷酸盐缓冲液，所述洗脱液为含300～500mM NaCl的pH7.0～8.0的l0～20mM磷酸盐缓冲液。
10.如权利要求4所述重组胰岛素样生长因子-I的制备方法，其特征在于，步骤b的亲和层析法采用Chelating Sepharose F．F．层析柱；步骤d所述亲和柱采用Ni2+ ChelatingSepharose F．F．层析柱、DEAE层析柱或Q柱；步骤d所述反相柱采用C18反相柱、Source 15RPC反相柱或30RPC反相柱；步骤e中的离子交换柱采用CM Sepharose F.F离子交换柱或SP Sepharose F．F．离子交换柱。
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