CN102212127B - 胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物，所述的胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物是聚乙二醇修饰胰高血糖素样肽-2得到的，其中每个胰高血糖素样肽-2上共价结合1个聚乙二醇分子。本发明还提供了上述胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物的制备方法和用途。本发明通过对PEG化反应条件的优选，得到一种药效好、半衰期长的胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物，若用于临床，每周只需用药1-2次，可大大减轻病人的痛苦。同时，本发明提供的重组生产GLP-2的方法简单、安全，大大降低制备胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物的成本，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉胰高血糖素样肽-2领域，特别涉及一种胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物及其制备方法和用途。
背景技术
胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide 2，GLP-2)属于胰高血糖素原衍生肽类(proglucagon-derived peptide，PGDP)，是胰高血糖素原(proglucagon，PG)被激素原转化酶(prohormone convertase，PC)降解的产物之一，是由33个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量3900道尔顿，氨基酸序列在哺乳动物具有高度保守性(Drucker，J.Clin.Endocrinol.Metab.，2001，86：1758-1774)。GLP-2由肠道L内分泌细胞合成和释放，并受摄食、神经和内分泌等因素调节，以进食含碳水化合物和脂肪食物等活动的影响尤为明显(Rocca等，Endocrinology，2001，142：1148-55)。正常成人餐后15分钟内和1小时后两个时期，血循环中GLP-2的浓度升高最显著。GLP-2在肠粘膜组织及血液循环中存在的主要形式是完整的GLP-2，即GLP-2(1-33)。GLP-2在人体血循环中的生物半衰期约7分钟，代谢主要是通过肾脏排泄和肠道刷状缘上的二酰肽肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)水解氨基末端前两个残基形成无活性的GLP-2(2-33)。饲喂缺少DPP-4作用位点的GLP-2类似物的大鼠的肠上皮生长情况明显好于饲喂天然GLP-2的大鼠，双侧肾脏切除的大鼠血中GLP-2的清除率明显低于未切除肾脏大鼠，而GLP-2(2-33)被证实是GLP-2受体(GLP-2R)的竞争性拮抗剂，能抑制GLP-2和营养诱导的肠粘膜生长(Shin等.Gastroenterology，2005，128：1340-53)，说明GLP-2的生物学活性受DDP-4水解、其降解产物拮抗和肾脏清除三者的调节。
GLP-2能促进肠粘膜生长，也能加速肠粘膜损伤后的再生修复，其作为肠道保护性药物的研究与开发具有广阔的前景，但其半衰期短，在人体血循环中的生物半衰期约7分钟。
替度鲁肽(Teduglutide)为DPP-IV抗性的GLP-2肽(其中丙氨酸-2被甘氨酸取代(A2G))，正被NPS Pharmaceuticals开发用于胃肠疾病(包括短肠综合征、克罗恩氏病和儿科胃肠疾病)的潜在治疗。替度鲁肽还具有治疗与癌症化疗相关的粘膜炎和溃疡性结肠炎的炎性肠病的潜力。然而，由于替度鲁肽的分子量低，该肽半衰期不足30分钟而被快速清除，需要每日给药。
经聚乙二醇(polyethylene，PEG)共价修饰的蛋白质为PEG化(PEGylation)蛋白质。PEG化蛋白药物通过增加蛋白质的分子量，可以减少药物排泄，PEG作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇[Lee等，Biotechnol Bioeng，2005，92(1)：24～34]，可减少免疫原性，降低蛋白的体内清除率，PEG作为屏障还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解[Veronese等，Drug Discov Today，2005，10(21)：1451～145]，这些特点均有利于延长蛋白药物的半衰期。PEG化蛋白质的药理学性质因它们所修饰的蛋白质的性质、修饰产物的相对分子量不同而不同，且由于蛋白质结构的复杂性，若对蛋白质进行随机修饰，会出现产物不均一、修饰后蛋白质生物活性减低等缺陷，若要达到生物活性较高，半衰期也很长的效果，需对PEG化反应的条件进行特意筛选和组合。
目前，没有通过PEG化延长胰高血糖素样肽-2半衰期的报道。
另一方面，现有的GLP-2大多为合成的，需要相应的设备与技术，价格昂贵。申请号：200610066176.2，发明名称：重组生产胰高血糖素样肽-2的方法的发明专利申请提供了一种改进的重组生产胰高血糖素样肽-2的方法，该申请文件记载了“对GLP-2来说，其分子量较小，仅为3.9KD，用普通的基因重组表达较困难”，该申请通过设计串联的3个GLP-2拷贝克服该问题，实现了基因重组表达GLP-2。然而，该方法表达的融合蛋白通常以包涵体形式存在，需要在变性条件下纯化，对GLP-2活性有较大影响；且该方案需要用到溴化氰，来裂解融合蛋白释放多肽，溴化氰为剧毒挥发性物质，对研发人员的安全构成威胁，在工业化密闭的GMP车间中，影响尤其大。
因此，亟需寻找一种更加简单、安全的重组生产GLP-2的方法。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种新的胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物。
本发明首先提供了一种胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物，所述的胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物是聚乙二醇修饰胰高血糖素样肽-2得到的，其中每个胰高血糖素样肽-2上共价结合1个聚乙二醇分子。
其中，所述的聚乙二醇为mPEG2-丙醛。
其中，所述胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物由下述方法制备：
1)将胰高血糖素样肽-2制备成pH为4.0～6.0的溶液；
2)将步骤(1)制备的胰高血糖素样肽-2溶液与聚乙二醇反应，所述胰高血糖素样肽-2与聚乙二醇的摩尔浓度比为1∶1～1∶10，反应温度为4～37℃，反应时间为1～20小时；
3)分离纯化，得到胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物纯品。
所述步骤(1)中pH为5.0；所述步骤(2)中，胰高血糖素样肽-2与聚乙二醇的摩尔浓度比为1∶2，反应温度为25℃，反应时间为5小时，还加入终浓度为20mM硼氢化钠作为催化剂。
其中，所述胰高血糖素样肽-2可使用天然的人高血糖素样肽-2，也可使用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胰高血糖素样肽-2，该胰高血糖素样肽-2的丙氨酸-2被甘氨酸取代。
其中，所述的胰高血糖素样肽-2可以是市售的，也可是由下述方法制备的：
a、构建包含编码硫氧还蛋白、编码蛋白水解酶识别位点以及编码胰高血糖素样肽-2的基因片段表达质粒；
b，将步骤a制备的表达质粒导入宿主细胞，并进行诱导表达，得到表达产物，分离纯化表达产物，得到硫氧还蛋白-胰高血糖素样肽-2融合蛋白；
c，用蛋白水解酶水解步骤b得到的融合蛋白，纯化，即得胰高血糖素样肽-2。
Trx，硫氧还蛋白，是普遍存在于酵母、细菌、动物、植物体内的蛋白质，该蛋白质也是目前常用的G2GLP-2表达宿主例如酵母或大肠杆菌的内源蛋白。该蛋白可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，Trx能与许多蛋白发生相互作用，增强融合蛋白的溶解性，从而减少了包涵体的形成(Thomas，J.G.等，Appl Biochem Biotechnol.66(3)：197-238)。
其中，所述的步骤a中，表达质粒是pET32a，编码蛋白水解酶识别位点以及编码胰高血糖素样肽-2基因片段如SEQ ID NO.2所示，其中蛋白水解酶识别位点为肠激酶识别位点；所述步骤b中，宿主细胞是大肠杆菌；所述步骤c中，蛋白水解酶为肠激酶。
pET32a质粒中包含了编码硫氧还蛋白的基因片段，因此只需将编码蛋白水解酶识别位点以及编码胰高血糖素样肽-2基因片段插入pET32a质粒即可构建得到本发明表达质粒，该基因的上游还具有His-Tag，便于后续分离纯化。
本发明还提供了一种制备胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物的方法，它包括如下步骤：
1)将胰高血糖素样肽-2制备成pH为4.0～6.0的溶液；
2)将步骤(1)制备的胰高血糖素样肽-2溶液与聚乙二醇反应，所述胰高血糖素样肽-2与聚乙二醇的摩尔浓度比为1∶1～1∶10，反应温度为4～37℃，反应时间为1～20小时；
3)分离纯化，得到胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物纯品。
其中，所述步骤(1)中pH为5.0；所述步骤(2)中，胰高血糖素样肽-2与聚乙二醇的摩尔浓度比为1∶2，反应温度为25℃，反应时间为5小时，还加入终浓度为20mM硼氢化钠作为催化剂。
本发明还提供了一种制备胰高血糖素样肽-2的方法，它包括如下步骤：
a、构建包含编码硫氧还蛋白、编码蛋白水解酶识别位点以及编码胰高血糖素样肽-2基因片段的表达质粒；
b，将步骤a制备的表达质粒导入宿主细胞，并进行诱导表达，得到表达产物，分离纯化表达产物，得到硫氧还蛋白-胰高血糖素样肽-2融合蛋白；
c，用蛋白水解酶水解步骤b得到的融合蛋白，纯化，即得胰高血糖素样肽-2。
其中，所述的步骤a中，表达质粒是pET32a，编码蛋白水解酶识别位点以及编码胰高血糖素样肽-2基因片段如SEQ ID NO.2所示，其中蛋白水解酶识别位点为肠激酶识别位点；所述步骤b中，宿主细胞是大肠杆菌；所述步骤c中，蛋白水解酶为肠激酶。
本发明最后提供了上述胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物在制备胃肠疾病治疗药物中的用途。
其中，所述疾病是短肠综合症、克罗恩氏病、与癌症化疗相关的粘膜炎和溃疡性结肠炎的炎性肠病。
本发明通过对PEG化反应条件的优选，得到一种药效好、半衰期长的胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物，若用于临床，预计只需每周用药1-2次，大大减轻了病人的痛苦。同时，本发明提供的重组生产GLP-2的方法简单、安全，大大降低制备胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物的成本，应用前景良好。
附图说明
图1pET32a(+)质粒图谱及其多克隆位点序列。
图2重组质粒pET-GLP-2中目的基因及其插入位点两端的序列。1：Trx序列；2：Kpn I；3：EK酶切位点；4：GLP基因序列；5：终止密码；6：HindIII；7：终止子序列。
图3重组表达GLP-2各步纯化样品的SDS-PAGE电泳分析。图3中，1：发酵菌体；2：镍离子螯合亲和层析样品得到的融合蛋白；3：融合蛋白的肠激酶酶切样品；4：反相柱层析样品；5：Q Sepharose Fast Flow柱层析样品；M：蛋白质分子量标准，各条带分子量大小(单位：kDa)标于图右。
图4GLP-2与mPEG-ALD20000摩尔比及反应时间对单位点PEG-GLP-2得率的影响
图5反应温度对单位点PEG-GLP-2得率的影响
图6反应pH对单位点PEG-GLP-2得率的影响
图7PEG-GLP-2制备的SDS-PAGE电泳分析。1：GLP-2样品；2：GLP-2的PEG化反应样品；3：纯化的PEG-GLP-2样品；M：为蛋白质分子量标准，各条带分子量大小分别为：116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4kDa。
图8PEG-GLP-2和GLP-2的药-时曲线图，1表示GLP-2，2表示PEG-GLP-2。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1GLP-2的重组生产
(1)工程菌种的构建
丙氨酸-2被甘氨酸取代的GLP-2含有33个氨基酸，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，为His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu MET Asn Thr Ile Leu AspAsn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr Asp。依据大肠杆菌密码子偏爱性，人工合成优化的适合大肠杆菌表达的、5’端有肠激酶识别位点DNA序列(如SEQ ID NO.2所示)，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成该DNA序列，并将其克隆到表达质粒pET32a(Novagen公司，如图1所示)中，构建得到重组质粒为pET-GLP-2，其插入序列及其两端序列如图2所示。测序结果表明GLP-2基因已正确插入到pET32a中。
将鉴定合格的阳性克隆pET-GLP-2质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)后，挑取转化子在5ml含100μg/ml Amp的LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中37℃培养过夜，以1/100的体积转接于50ml含100μg/ml Amp的LB培养基中37℃培养。OD600达到0.5时，加入IPTG到终浓度0.5mM进行诱导表达，4小时后取样进行SDS-PAGE电泳。与未诱导的对照相比，诱导后的重组子均有预期分子量20kDa(Trx-GLP-2融合蛋白分子量约为20kDa)左右的表达带，表达量约为全菌蛋白的25％。选取表达量高且稳定的转化子作为工程菌，命名为BL21(DE3)-GLP-2，置甘油中保存。
(2)工程菌BL21(DE3)-GLP-2的发酵
取表达Trx-GLP-2融合蛋白的工程菌BL21(DE3)-GLP-2甘油菌种1支(1mL)，接种到400mL LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中，37℃，200rpm摇瓶培养14-16h，得活化种子。取活化种子按10％接种量接于3.5L TB培养基中(1.2％蛋白胨，2.4％酵母膏，0.4％甘油，17mMKH2PO4，72mM K2HPO4)(5L B.Braun发酵罐)，37℃培养4h。然后将此培养液按5％接种量接于70L TB培养基中(100L B.Braun发酵罐)进行发酵，温度为37℃、pH7.0、DO≥30％，培养至OD600＝4.0时开始诱导表达，诱导用的IPTG终浓度为0.5mM，诱导时间为4h。离心收集菌体。
(3)GLP-2的纯化
采用连速流离心机(CEPAZ41，B.Braun公司，德国)收集步骤(2)中的发酵菌体，用缓冲液A(10mM PB，500mM NaCl，30mM咪唑，pH8.0)悬浮，然后用APV-1000高压匀浆机(APV Co.丹麦)破菌，将胞内分泌的融合蛋白溶于缓冲液A中，9000rpm离心30min。取上清液依次采用以下方法对GLP-2进行纯化：
1)镍离子螯合亲和层析
将高压匀浆破菌上清液上样与用缓冲液A平衡的镍离子螯合亲和层析(Chelating Sepharose Fast Flow，GE Healthcare)柱，缓冲液A充分洗涤后，用缓冲液B(10mM PB，500mM NaCl，200mM咪唑，pH8.0)洗脱，收集洗脱峰，得到融合蛋白样品。
2)融合蛋白的酶切
上述融合蛋白经超滤脱盐后，配制酶切反应液，其组成如下：1mg/mL融合蛋白，50mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM CaCl2，肠激酶(按1U肠激酶切割5mg融合蛋白的比例加入肠激酶)。25℃酶切20小时。
3)镍离子螯合亲和层析
将酶切后蛋白溶液上样于用缓冲液C(50mM Tris-HCl，pH8.0)平衡的镍离子螯合亲和层析柱，收集穿透液。
4)反相柱层析
选用反相柱Source 15RPC(GE Healthcare)对步骤3得到的穿透液进行精细纯化，用24-64％乙腈作梯度洗脱，收集含GLP-2的洗脱峰，纯度达到98％以上。
5)阴离子交换柱层析
将反相柱洗脱的样品用缓冲液D(10mM PB，pH7.0)稀释后，上于经缓冲液D平衡的Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)层析柱，缓冲液D充分洗涤后，用含400mM NaCl的缓冲液D洗脱，得到纯度大于99％的GLP-2蛋白。
用SDS-PAGE电泳分析各步纯化效果见图3，由该图可知，表达的Trx-GLP-2融合蛋白经过镍离子螯合亲和层析、肠激酶酶切、镍离子螯合亲和层析、反相层析及离子交换层析步骤的分离纯化后，得到了GLP-2纯品。
本发明将重组表达得到GLP-2与亲水性的Trx连接的融合蛋白，该融合蛋白在胞内以可溶形式表达，避免了工艺复杂且收率较低的包涵体复性步骤。同时，融合蛋白N端含His-Tag，可以通过Ni2+鳌和的亲和层析快速、简便、高效地纯化，大大提高了回收率。Trx与GLP-2间存在肠激酶切割位点，保证纯化的融合蛋白经肠激酶切割可以释放完整的G2GLP-2。采用肠激酶将表达出的融合蛋白酶解，并利用一系列的柱层析将目的蛋白G2GLP-2纯化出来，纯度可达到99％以上。
实验证明，本发明生产GLP-2的方法简单、安全，大大降低了制备胰高血糖素样肽-2的生产成本。
实施例2GLP-2的PEG化参数优选实验
根据有关文献(如Kinstler等J.Pharm.Res.1996，13：996)，影响PEG试剂对蛋白的专一性反应的因素包括PEG试剂与蛋白质的摩尔比、反应时间、反应温度、pH值、蛋白质的摩尔浓度等。以文献为依据，对有关参数进行了优化：
1)GLP-2与mPEG-ALD20000摩尔比及反应时间的影响
反应混合液组成：0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.0)，GLP-2浓度2mg/ml，20mM催化剂硼氢化钠(NaBH3CN，Sigma)，分别按摩尔浓度比1∶10、1∶5、1∶2、1∶1(GLP-2∶mPEG-ALD20000)加入修饰剂，mPEG2-ALD(mPEG2-丙醛)试剂购自北京键凯科技有限公司。
25℃下轻轻震荡反应，第1、2、5、10、15、20小时取样。用2M HCl调pH至2.0终止反应。
采用SDS-PAGE电泳，用Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像系统扫描分析单位点PEG的量，即结合了一个PEG分子的PEG-GLP-2的量，结果如图4所示。由图4可知，反应时间为5小时时，单位点PEG-GLP-2得率最高，在GLP-2与mPEG-ALD20000摩尔比1∶2和1∶10时，单位点PEG-GLP-2得率均较高，但是GLP-2与mPEG-ALD20000摩尔比为1∶10时，PEG化产品中含有多位点的PEG-GLP-2(即结合了多个PEG分子的PEG-GLP-2)，不利于分离纯化得到均一的PEG-GLP-2纯品。
2)反应温度试验
反应混合液组成：0.1M醋酸钠缓冲液pH为5.0，GLP-2浓度2mg/ml，20mM催化剂硼氢化钠，GLP-2∶mPEG-ALD20000＝1∶2。
置于4℃、25℃、37℃轻轻震荡反应，分别在3、5、10小时取样。用2MHCl调pH至2.0终止反应。
采用SDS-PAGE电泳，用Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像系统扫描分析单位点PEG的量，结果如图5所示。由图5可知，25℃反应5小时，或37℃反应3小时，单位点PEG-GLP-2得率均较高，但是考虑到PEG-GLP-2的稳定性，反应条件优选25℃反应5小时。
3)pH影响试验
反应混合液组成：0.1M醋酸钠缓冲液，GLP-2浓度2mg/ml，20mM催化剂硼氢化钠，GLP-2∶mPEG-ALD20000＝1∶2。
其中，醋酸钠缓冲液调pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。25℃反应5小时，用2M HCl调pH至2.0终止反应。
采用SDS-PAGE电泳，用Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像系统扫描分析单位点PEG的量，结果见图6。由图6可知，pH5.0时，单位点PEG-GLP-2得率最高。
实验证明在pH为5.0，反应温度为25℃，反应时间为5h，GLP-2与mPEG-ALD20000摩尔比为1∶2是生产得PEG-GLP-2的最佳反应条件，产品得率高，均一程度高、活性高。
实施例3GLP-2的PEG化及其产物的纯化
本发明GLP-2可以是未经修饰的人胰高血糖素样肽-2，也可是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胰高血糖素样肽-2，该胰高血糖素样肽-2的丙氨酸-2被甘氨酸取代。同时，该GLP-2可以是市售的，也可由实施例1的方法制备得到。
用0.2M pH5.0的醋酸钠缓冲液溶解实施例1制备的GLP-2冻干样品，至终浓度2mg/ml。按摩尔浓度比1∶2(GLP-2∶mPEG-ALD20000)加入修饰剂，mPEG2-ALD(mPEG2-丙醛)试剂购自北京键凯科技有限公司。加入催化剂硼氢化钠(NaBH3CN，Sigma)至终浓度20mM，搅拌溶解，25℃下反应5小时。用2M HCl调pH至2.0终止反应。硼氢化钠存在时，带醛基的PEG会和伯胺发生还原氨化反应。
将反应混合物上样于经10mM pH6.5的PB平衡过的Resource15反相柱，用42％的乙腈洗脱2-3CV(柱体积)，再用42-55％乙腈洗脱15CV，最后用100％乙腈洗涤。收集55％乙腈洗脱峰。
最后用Superdex G-25分子筛柱除去乙腈，得到PEG-GLP-2纯品。用SDS-PAGE电泳分析各步纯化效果见图7。由图7可知，使用上述方法制备得到的PEG-GLP-2产品仅结合1个mPEG2-ALD分子，均一程度高。
实验证明本发明制备得到了均一程度高的PEG-GLP-2纯品。
实施例4药效学试验
取6周大的同龄雌性昆明种小鼠(n＝3-4/组)。对照是同龄、同性别(n＝3-4/组)动物。GLP-2及实施例3植被得到的PEG-GLP-2分别溶于PBS溶液中。GLP-2每天1次皮下注射，剂量为0.1mg/kg；PEG-GLP-2每周2次皮下注射，剂量为0.5mg/kg；对照为0.5ml PBS溶液，并在实验条件下每日1次进行监测。持续用药1周，注射后14天处死动物，小鼠在处死前禁食1天。将从幽门到盲肠的小肠从腹腔中取出，洗净称重。小肠重量变化百分比的计算方法是：将以样品处理的小鼠相对于仅用PBS处理的小鼠的平均肠重量变化除以仅以PBS处理的小鼠的平均肠重量，再将此值乘以100。
结果表明，PEG-GLP-2组小肠重量增加68％，GLP-2组小肠重量增加70％，说明PEG-GLP-2与GLP-2一样具有大大增强肠营养活性的作用。
实验证明，上述方法制备得到的胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物的生物活性较高，药效好，也证明了上述PEG化方法未影响胰高血糖素样肽-2的活性基团。本发明制备得到的PEG-GLP-2与GLP-2的生物活性和药效类似，可用于制备治疗胃肠疾病的药物，特别是制备短肠综合症、克罗恩氏病、儿科胃肠疾病与癌症化疗相关的粘膜炎和溃疡性结肠炎的炎性肠病的药物。
实施例5药代动力学实验
大鼠静脉注射125I-标记实施例2制备得到的PEG-GLP-2，剂量为0.5mg/kg；静脉注射125I-标记GLP-2，剂量为0.1mg/kg。不同时间采取血样，同位素放射性分析。结果见图8，PEG-GLP-2终末血浆清除半衰期T1/2为7.5小时，而GLP-2终末血浆清除半衰期T1/2约为0.5小时。因此，与GLP-2相比，PEG-GLP-2的半衰期大大延长，若用于临床，每周只需用药1-2次，大大减轻了病人的痛苦。
综上，本发明制备得到了一种药效好、半衰期长的胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物，若用于临床，预计只需每周用药1-2次，大大减轻了病人的痛苦。同时，本发明提供的重组生产GLP-2的方法简单、安全，大大降低制备胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物的成本，应用前景良好。
Claims (3)
1.一种制备胰高血糖素样肽-2的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、构建包含编码硫氧还蛋白、编码蛋白水解酶识别位点以及编码胰高血糖素样肽-2基因片段的表达质粒；
b，将步骤a制备的表达质粒导入宿主细胞，并进行诱导表达，得到表达产物，分离纯化表达产物，得到硫氧还蛋白-胰高血糖素样肽-2融合蛋白；
c，用蛋白水解酶水解步骤b得到的融合蛋白，纯化，即得胰高血糖素样肽-2；
其中，所述的步骤a中，表达质粒是pET32a，编码蛋白水解酶识别位点以及编码胰高血糖素样肽-2基因片段如SEQ ID NO.2所示，其中蛋白水解酶识别位点为肠激酶识别位点；
所述步骤b中，宿主细胞是大肠杆菌；
所述步骤c中，蛋白水解酶为肠激酶。
2.一种制备胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1）按照权利要求1的方法制备胰高血糖素样肽-2，将其制备成pH为4.0～6.0的溶液；
2）将步骤（1）制备的胰高血糖素样肽-2溶液与聚乙二醇反应，所述胰高血糖素样肽-2与聚乙二醇的摩尔浓度比为1：1～1：10，反应温度为4～37℃，反应时间为1～20小时；
3）分离纯化，得到胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物纯品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述步骤（1）中pH为5.0；
所述步骤（2）中，胰高血糖素样肽-2与聚乙二醇摩尔浓度比为1：2，反应温度为25℃，反应时间为5小时，还加入终浓度为20mM硼氢化钠作为催化剂。
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