CN100484958C - 含有人甲状旁腺素1-34的融合蛋白及其表达载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的融合蛋白，其具有：(1)硫氧还蛋白序列和(2)位于所述硫氧还蛋白下游的甲状旁腺激素1-34肽。较为优选的是，该融合蛋白还具有(3)位于所述硫氧还蛋白序列和所述甲状旁腺激素1-34肽之间的含有蛋白水解酶识别位点的连接肽。从该融合蛋白可制备人甲状旁腺素1-34肽。

Description

含有人甲状旁腺素1-34的融合蛋白及其表达载体
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及含有人甲状旁腺素1-34的融合蛋白及其表达载体。
背景技术
甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone，PTH)是由甲状旁腺激素主细胞合成的，由84个氨基酸组成。人们逐渐认识到PTH能够增加在合成新骨基质中非常活跃的成骨细胞的数量，并且能在体内改变骨骼中的基因表达。PTH还具有降低血压、调节维生素D受体(VDR)表达、调节碱性磷酸酯酶的活性的作用。Tregear等(Tregear GW等，Endocrinology，1973，93：1349)用实验证明PTH发挥钙磷调节分子作用仅需氨基端1-34个氨基酸残基。但是，PTH(1-34)不含半胱氨酸，在体内较不稳定。
PTH的基因工程研究开始于20世纪80年代。目前制备PTH(1-34)的基因工程方法主要有两类，一类为以包涵体的形式制备，另一类以可溶蛋白的形式制备。1997年，日本科学家Yuji Suzuki等将人甲状旁腺素(hPTH(1-34))与β—半乳糖苷酶融合表达，但融合蛋白以包涵体形式存在。中国专利公开号CN1417231A也公开了一种以包涵体的形式制备hPTH(1-34)的方法。在这一类的方法中，表达出的融合蛋白需经包涵体提取、稀释复性、酶切，然后进行离子交换、反相HPLC层析等手段进行纯化，才能得到hPTH(1-34)，因而这一类方法的制备步骤较为复杂。
中国专利申请公开号CN1424325A公开了一种重组人甲状旁腺素前体肽以及重组人甲状旁腺素1-34肽的制备工艺。为了制备该甲状旁腺素1-34肽，需要先使工程菌表达出GST-Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)这一融合蛋白，再先后用凝血酶和脯氨酸内肽酶对所得融合蛋白进行酶切，再经分离纯化后得到所需的甲状旁腺素1-34肽。由于需要使用双酶切，该专利申请公开的制备工艺也较为复杂。
人们早已知道硫氧还蛋白(Thiroedoxin，下文有时简称为“Trx”)是一种普遍存在于酵母、细菌、动物、植物体内的蛋白质，该蛋白质也是目前常用的PTH(1-34)表达宿主例如酵母或大肠杆菌的内源蛋白，但是至今还没有人利用该蛋白与PTH(1-34)融合来简便地制备hPTH(1-34)。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种新的融合蛋白，其具有：(1)Trx序列和(2)位于所述Trx下游的甲状旁腺激素1-34肽。较为优选的是，该融合蛋白还具有(3)位于所述Trx序列和所述甲状旁腺激素1-34肽之间的含有蛋白水解酶识别位点的连接肽。所述蛋白水解酶可以为凝血酶、Kex2-600、脯氨酸内肽酶、肠激酶。肠激酶是优选的，因为该蛋白水解酶在识别位点的C末端裂解所述融合蛋白，这样可以在酶水解完成后获得完整、准确的所述甲状旁腺激素1-34肽。为了便于纯化，在本发明的融合蛋白还优选具有任选的位于所述连接肽中或Trx的C端或N端的(His)6-Tag。因此，可以利用本领域公知的基因重组技术，将Trx、His-Tag编码区、肠激酶识别位点和甲状旁腺激素1-34肽编码区依次连接起来，从而得到Trx-(His)6-肠激酶识别位点-甲状旁腺激素1-34肽。也可将编码甲状旁腺激素1-34肽的基因直接插入到可自市售得到的含有Trx和His-Tag编码序列的适宜表达载体[例如，pET32a(+)]。在本发明的一个具体实施例中，所述的(His)6-Tag和蛋白水解酶(具体为肠激酶)的编码序列就位于所述的连接肽中，所得融合蛋白的序列从N端到C端为：Trx-含有(His)6和蛋白酶识别位点的连接肽-甲状旁腺激素1-34肽。
在本发明的另一方面提供了一种编码本发明融合蛋白的重组DNA序列以及含有该序列的表达载体。在一个具体的实施例中，本发明的重组DNA序列包含编码肠激酶识别位点-甲状旁腺激素1-34肽的下列核苷酸序列：GACGACGACGACAAGTCCGTTTCCGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCCATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACTTC。
附图说明
图1为重组表达质粒pET-PTH(1-34)酶切鉴定图谱。图1中，各泳道代表的内容为：M、DNA分子量标准(λDNA/Hand III，分子量大小标于图左)；1、重组质粒pET-PTH(1-34)；2、重组质粒pET-PTH(1-34)经EcoR I酶切；3、pET32a(+)质粒DNA经Pst I酶切；
4、重组质粒pET-PTH(1-34)经Pst I酶切。
图2为重组质粒pET-PTH(1-34)正向测序结果。
图3为重组质粒pET-PTH(1-34)反向测序结果。
图4为重组子的表达筛选的SDS-PAGE电泳图。图4中，M、为蛋白质分子量标准(分子量大小标于图左)；泳道1显示的是诱导前取样结果；泳道2-9分别显示的是1-8号重组子诱导表达结果。
图5工程菌发酵表达后的SDS-PAGE电泳分析。图5中，M、为蛋白质分子量标准，各条带分子量大小(kDa)标于图左；泳道1显示的是收集的发酵菌体；泳道2显示的是IPTG诱导前菌体。
图6rhPTH(1-34)各步纯化样品的SDS-PAGE电泳分析。图6中，1、发酵菌体；2、破菌后离心上清；3、镍离子螯合亲和层析样品；4、融合蛋白的肠激酶酶切样品；5、Q Sepharose High Performance柱层析样品；6、反相柱层析样品；7、SP Sepharose Fast Flow柱层析样品；M、为蛋白质分子量标准，各条带分子量大小(kDa)标于图右。
图7是rhPTH(1-34)的RP-HPLC分析图谱。
图8是rhPTH(1-34)的质谱分析图谱。
图9是显示市售的pET32a(+)质粒图谱。
图10是人工合成的含有rhPTH(1-34)编码序列的DNA序列。其中，5′-CTG和AAG-3′为酶切保护碱基，GGTACC为Kpn I酶切位点，GACGACGACGACAAG为肠激酶酶切位点编码序列，TCCGTTTCCGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCCATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACTTC为编码PTH的序列，TAA为终止密码子，GTCGAC为Sal I酶切位点。
具体实施方式
为了获得本发明的融合蛋白，需要先构建能够表达该融合蛋白的表达载体。该表达载体可以通过将编码hPTH(1-34)的DNA序列插入到受启动子控制下的Trx基因的下游而构建完成。如背景技术部分所述，Trx是一种普遍存在于酵母、细菌、动物、植物体内的蛋白质，该蛋白质也是目前常用的hPTH(1-34)表达宿主例如酵母或大肠杆菌的内源蛋白。该蛋白可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，Trx能与许多蛋白发生相互作用，增强融合蛋白的溶解性，从而减少了包涵体的形成(Thomas，J.G.等，Appl Biochem Biotechnol.66(3)：197-238)。在本发明中可以使用完整的Trx，也可以使用Trx的一部分或其突变体，所选取的部分或突变体具有与Trx相同或相似的空间结构和功能。
本发明的表达载体可以是酵母的表达载体，也可以是大肠杆菌的表达载体。所述的hPTH(1-34)可以是完全人工合成的新DNA序列，也可以为已经公开的编码hPTH(1-34)的DNA序列。为了将编码hPTH(1-34)的DNA序列插入Trx基因的下游，优选使用已经含有所述Trx基因或其部分序列的克隆载体。这种载体也可通过购买得到。例如，pET32a(+)就是这样一种载体。pET32a(+)可以高效表达含有109个氨基酸的Trx-Tag的多肽，外源基因插入其多克隆位点后，产生的融合蛋白含有可剪切的His-Tag和S-Tag序列，便于检测和纯化。
为了在后续步骤中将hPTH(1-34)从融合蛋白上释放下来，优选在编码hPTH(1-34)的DNA序列的5’端引入编码蛋白水解酶识别位点核苷酸序列。所述蛋白水解酶可以为凝血酶、Kex2-600、脯氨酸内肽酶、肠激酶。肠激酶是优选的，因为该酶能够在识别位点的C末端水解融合蛋白。因此，更优选在编码肠激酶识别位点的核苷酸序列的后面直接跟着hPTH(1-34)的编码序列，这样肠激酶可以将最终所需的hPTH(1-34)完整、准确地释放出来。如果采用人工合成编码hPTH(1-34)的DNA序列的话，为了便于克隆，在人工合成所述DNA序列时，还需要在该序列的5’端和3’端引入适当的限制性酶切位点。为了便于日后的纯化，可在融合蛋白的适当位置上插入便于纯化的序列，例如优选在所用Trx的N端或C端插入His-Tag。市售的载体pET32a(+)中不但具有Trx的基因，而且在该基因的下游还具有His-Tag。
本发明还提供了一种大规模、高效的hPTH(1-34)表达方法。为了大量制备hPTH(1-34)，需要将构建的重组表达载体转化适当宿主的感受态细胞，例如酵母细胞或大肠杆菌细胞，并在适当的培养基中进行发酵，以收获融合蛋白。在本发明的一个具体实施例中采用的宿主细胞是可自市售得到的E.coli BL21(DE3)。该细胞的胞内和胞间周质蛋白酶均已失活，这样当进行外源蛋白的可溶性表达时，不容易被宿主菌的蛋白酶水解，因而可稳定存在。
为了在发酵期间进行有效的控制，建议采用可诱导型的表达载体。pET系列载体就是这样一类大肠杆菌表达载体。该载体是利用T7噬菌体RNA聚合酶/启动子系统构建的E.coli表达载体，即在E.coliBL21(DE3)或JM109(DE3)的染色体上整合了T7RNA聚合酶基因，而且受lac操纵子调控。所以，当用IPTG诱导时，导致T7 RNA聚合酶的合成，从而诱导了pET载体上目的基因的表达。T7噬菌体RNA/启动子具有很强的启动活性，而且在载体多克隆位点序列上游有强核蛋白体结合序列(rbs)，所以，pET载体可以高效地表达外源蛋白。
所述的发酵培养基根据宿主的不同而异。在选用大肠杆菌为宿主，以pET系列载体为表达载体的情况下，发酵培养基可以为LB、TB、M9CA等，优选为TB培养基。发酵温度为30-40℃，优选为37℃；pH6.5-7.5，优选为pH 7.0；溶氧DO≥30％，诱导用的IPTG终浓度为0.3-1.0mM，优选为0.5mM；诱导时间为3-5h，优选为3.5h。在上述适宜的条件下，可使发酵液浓度达到30g细菌湿重/L发酵液以上，目的融合蛋白表达量在25％以上。
为了得到rhPTH(1-34)多肽纯品，首先用高压匀浆破菌法将胞内分泌的融合蛋白溶于裂解液中；然后用镍离子螯合亲和层析进行初步纯化，将初步纯化后的样品用肠激酶酶切，酶切后的样品用阴离子交换柱进行层析，收集穿透蛋白溶液，将穿透蛋白溶液过反相层析柱，最后将样品过阳离子交换柱除去有机溶剂得到rhPTH(1-34)蛋白原液。利用该方法，70升发酵液可得约2000g湿重菌体，通过纯化可得到约3.5grhPTH(1-34)蛋白原液。
临床前药效学试验、毒理学试验和研究表明：本发明制备的rhPTH(1-34)皮下注射具有显著促进成骨细胞骨形成作用，其安全剂量为15μg/kg。因此，本发明制备的rhPTH(1-34)用于人体治疗是安全有效的。
综上所述，本发明将hPTH(1-34)与亲水性的Trx融合，该融合蛋白在胞内以可溶形式表达，避免了工艺复杂且收率较低的包涵体复性步骤。融合蛋白N端含His-Tag，可以通过Ni2+鳌和亲和层析快速、简便、高效地纯化，大大提高了回收率。在本发明的优选实施例方案中，Trx与hPTH(1-34)间存在肠激酶切割位点，保证纯化的融合蛋白经肠激酶切割可以释放完整的hPTH(1-34)。采用肠激酶将表达出的融合蛋白酶解，并利用一系列的柱层析将目的蛋白hPTH(1-34)纯化出来，纯度可达到99％以上，甚至达到100％。
以下将以大肠杆菌作为宿主的例子，通过具体实施例的方式，对本发明进行举例说明，但应当理解这些实施例不以任何形式限制本发明范围。
实施例1  表达hPTH(1-34)的DNA序列的设计和人工合成
根据hPTH(1-34)氨基酸序列(见表1)，依据大肠杆菌密码子偏爱性，人工合成优化的适合大肠杆菌表达的DNA序列。合成hPTH(1-34)基因时，在该基因的5′端引入Kpn I酶切位点GGTACC，在3′端引入终止密码TAA和Sal I酶切位点GTCGAC，并在5′端引入的Kpn I酶切位点后面加上肠激酶酶切识别位点的编码序列GACGACGACGACAAG，得到序列1(见图10)。为便于以后的亚克隆，将合成基因克隆到pUC18上，用于保存该合成的DNA序列。质粒pUC18含有与质粒pET32a(+)相同的Kpn I和Sal I酶切位点。
表1、hPTH(1-34)密码子使用表
 
序号 氨基酸 所选密码子 可选密码子 不可选密码子
1 Ser TCC TCT，TCA，TCG，AGT，AGC
2 Val GTT GTC，GTA，GTG
3 Ser TCC TCT，TCA，TCG，AGT，AGC
4 Glu GAA GAG
5 Ile ATC ATT ATA
6 Gln CAG CAA
7 Leu CTG TTA，TTG，CTT，CTC CTA
8 MET ATG
9 His CAC CAT
10 Asn AAC AAT
11 Leu CTG TTA，TTG，CTT，CTC CTA
12 Gly GGT GGC，GGG GGA
13 Lys AAA AAG
14 His CAC CAT
15 Leu CTG TTA，TTG，CTT，CTC CTA
16 Asn AAC AAT
17 Ser TCC TCT，TCA，TCG，AGT，AGC
18 Met ATG
19 Glu GAA GAG
20 Arg CGT CGC CGA，CGG，AGA，AGG
21 Val GTT GTC，GTA，GTG
 
22 Glu GAA GAG
23 Trp TGG
24 Leu CTG TTA，TTG，CTT，CTC CTA
25 Arg CGT CGC CGA，CGG，AGA，AGG
26 Lys AAA AAG
27 Lys AAA AAG
28 Leu CTG TTA，TTG，CTT，CTC CTA
29 Gln CAG CAA
30 Asp GAC GAT
31 Val GTT GTC，GTA，GTG
32 His CAC CAT
33 Asn AAC AAT
34 Phe TTC TTT
注：氨基酸序列是从hPTH多肽的N端开始标记的。
实施例2 重组质粒的构建过程
以下分子克隆技术操作方法，如无特别说明，均参照文献：分子克隆实验指南(黄培堂等译，[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002)。DNA操作中所用的DNA提取试剂盒(UNIQ-10)、DNA胶回收试剂盒(UNIQ-10)及连接试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司。克隆载体pUC18、限制性内切酶购自Fermentas LifeScience公司。表达载体pET32a(+)，大肠杆菌TOP10及BL21(DE3)均购自Novagen公司。克隆用大肠杆菌宿主为TOP10，表达用大肠杆菌宿主为BL21(DE3)。BL21(DE3)基因型为：hsdS gal(λcIts857indl Sam7 nin5 lacUV5-T7geneI)。BL21(DE3)带有T7 RNA多聚酶基因，在IPTG的诱导下T7 RNA多聚酶大量产生，因而开启了外源基因的表达，可使外源基因高效表达。
1.准备目的基因片段
用DNA抽提试剂盒提取含有hPTH(1-34)编码序列的pUC18质粒DNA，用Kpn I/Sal I双酶切，在1％的琼脂糖凝胶电泳分离小片段，切下含有130bp左右片段的凝胶，用凝胶DNA回收试剂盒回收130bp左右片段，电泳验证后备用。
2.准备表达载体片段
用DNA抽提试剂盒提取pET32a(+)质粒DNA，用Kpn I/Sal I双酶切，1％的琼脂糖凝胶电泳分离大片段，切下含有大片段的凝胶，用凝胶DNA回收试剂盒回收大片段，电泳验证后备用。
3.构建重组质粒pET-PTH(1-34)
将1、2准备好的DNA片段按不同的体积比(2/8、3/7、4/6、5/5)混合均匀，用T4 DNA连接酶在16℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布于含有100μg/ml Amp的LB琼脂糖平板(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl，2％琼脂))，37°C培养过夜。
4.重组子筛选
挑取10个菌落，在5ml含100μg/ml Amp的LB培养基中37°C培养过夜，用DNA抽提试剂盒提取质粒DNA。分别用EcoR、PstI对所提取的DNA酶切，然后进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子。由于EcoR I在pET32a(+)中为单一酶切位点，构建重组子时已被Kpn I/Sal I双酶切除去，故重组子不能被EcoR I切割；而pET32a(+)中的Pst I单一位点不在多克隆区，且rhPTH(1-34)基因中含一个Pst I位点，故用Pst I酶切pET32a(+)载体质粒时，得到分子量为5.9kb的单一DNA片段，而重组质粒用PstI酶切应该出现1.2kb和4.7kb左右的两条DNA片段(请参见图1)。酶切分析结果表明，10个菌落均为正确的重组子，正确的重组质粒命名为pET-PTH(1-34)。
5.质粒pET-PTH(1-34)的序列测定：
将重组质粒pET-PTH(1-34)进行测序验证，正向测序结果见图2，反向测序结果见图3。其中编码融合蛋白Trx-含有(His)6和肠激酶识别位点的连接肽-甲状旁腺激素1-34肽的核苷酸序列如下：ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtacc
Figure C200610070995D0013102740QIETU
TCCGTTTCCGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCCATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACTTCTAA。其中，非黑体大写字母组成的序列是Trx编码序列，小写字母组成的序列是含有Trx-含有(His)6和蛋白酶识别位点编码区的连接肽编码序列，带有下划线的斜体字部分是(His)6编码区，双划线部分是肠激酶识别位点编码区，黑体大写字母组成的序列是hPTH(1-34)DNA序列，斜体的TAA是终止密码子。测序证明构建的工程菌中的hPTH(1-34)DNA序列与理论设计完全一致。另外，需要说明的是，在上述融合蛋白的编码序列中，小写字母所组成的连接肽编码序列中(His)6-Tag和肠激酶编码区对于获得纯的hPTH(1-34)是必需的序列，因此小写字母中的其它序列是可有可无的，也可替换为其它有功能的序列。
实施例3  工程菌的诱导表达
用重组质粒pET-PTH(1-34)DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)，所得到的即为用于表达rhPTH(1-34)融合蛋白的基因工程菌。挑取8个单菌落，在5ml含100μg/ml Amp的LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中37℃培养过夜，以1/100的体积转接于50ml含100μg/ml Amp的LB培养基中37℃培养，剩余菌液用15％甘油分装冻存。OD600达到0.5时，加入IPTG到终浓度0.5mM进行诱导表达，4小时后取样进行SDS-PAGE电泳。与未诱导的对照相比，诱导后的重组子均有预期分子量20kDa左右的表达带，表达量均为全菌蛋白的25％以上。取产量最高菌6号作为工程菌，命名为BL21(DE3)-PTH(1-34)，置甘油中保存。蛋白表达筛选电泳图见附图4。
实施例4  工程菌BL21(DE3)-PTH(1-34)的发酵
取表达Trx-hPTH的工程菌BL21(DE3)-PTH(1-34)的甘油菌种1支(1mL)，接种到400mL LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中，37℃，200rpm摇瓶培养14-16h，得活化种子。取活化种子按10％接种量接于3.5L TB培养基中(1.2％蛋白胨，2.4％酵母膏，0.4％甘油，17mM KH2PO4，72mM K2HPO4)(5L B.Braun发酵罐)，37℃培养3-4h。然后将此培养液按5％接种量接于70L TB培养基中(100L B.Braun发酵罐)进行发酵，温度为37℃、pH7.0、DO≥30％，培养至OD600＝4.0时开始诱导表达，诱导用的IPTG终浓度为0.5mM，诱导时间为3-4h。在此条件下，可使发酵液浓度达到30g细菌湿重/L发酵液以上，目的融合蛋白表达量在25％以上。结果请参见图5。
实施例5  rhPTH(1-34)的纯化
采用连速流离心机(CEPA Z41，B.Braun公司，德国)收集实施例4中的发酵菌体，用缓冲液A(10mM PBS(磷酸盐缓冲液)，500mM NaCl，30mM咪唑，pH8.0)悬浮，然后用APV-1000高压匀浆机(APV Co.丹麦)破菌，将胞内分泌的融合蛋白溶于缓冲液A中，9000rpm离心30min。取上清液依次采用以下方法对rhPTH(1-34)进行纯化：
1.镍离子螯合亲和层析
将高压匀浆破菌上清液上于用缓冲液A平衡的镍离子螯合亲和层析(Chelating Sepharose Fast Flow，GE Healthcare)柱，缓冲液A充分洗涤后，用缓冲液B(10mM PB，500mM NaCl，200mM咪唑，pH8.0)洗脱，收集洗脱峰，得到融合蛋白样品。
2.融合蛋白的酶切
配制酶切反应液，其组成如下：1mg/mL融合蛋白，50mMTris-HCl(pH8.0)，1mM CaCl2，肠激酶(按1mg肠激酶切割5mg融合蛋白的比例加入肠激酶)。25℃酶切20小时。
3.阴离子交换柱层析
将酶切后蛋白溶液上样于用缓冲液C(50mM Tris-HCl，pH8.0)平衡的Q Sepharose High Performance(GE Healthcare)层析柱。rhPTH(1-34)理论等电点为8.29，在pH8.0时带正电荷，不与阴离子交换柱结合，杂蛋白则因带负电荷而与阴离子交换柱结合。收集穿透液，可得到纯度为95％以上的rhPTH(1-34)蛋白样品。
4.反相柱层析
选用反相柱Source 15RPC(GE Healthcare)对按上文所述经离子交换柱层析纯化得到的rhPTH(1-34)蛋白样品进行精细纯化，用24-64％乙醇作梯度洗脱，在40-60％乙醇时出现rhPTH(1-34)蛋白洗脱峰，纯度达到98％以上。
5.阳离子交换柱层析
将反相柱洗脱的样品用缓冲液D(10mM PB，pH7.0)稀释后，上于经缓冲液D平衡的SP Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)层析柱，缓冲液D充分洗涤后，用含400mM NaCl的缓冲液D洗脱，得到纯度大于99％的rhPTH(1-34)蛋白。
用SDS-PAGE电泳分析各步纯化效果(见图6)。
实施例6  rhPTH(1-34)的检定
1、SDS-PAGE纯度分析
采用Tris-Tricine SDS-PAGE系统(郭尧君，蛋白质电泳实验技术，科学出版社，1999)进行非还原型电泳，用Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像系统扫描测定，rhPTH(1-34)纯度为100％(见图6中第7道)。
2、RP-HPLC纯度分析
用HPLC法测定蛋白质和肽类的纯度，准确度高并且其保留时间亦可作为定性的一个指标。层析柱为Delta-Pak C185μm3.9×150(Waters Co.)，缓冲液A(0.1％三氟乙酸(TFA)，在95％dH2O和5％乙腈中)到缓冲液B(0.1％TFA，在95％和5％ dH2O中)线性梯度洗脱70min，流速1ml/min，220nm紫外检测。分析结果表明，上述工艺制备的rhPTH(1-34)的HPLC图谱为单一峰，纯度为100％。RP-HPLC分析结果见图7。
3、N、C末端氨基酸序列分析
采用Edman降解法测定按照实施例5纯化得到rhPTH(1-34)N-末端15个氨基酸序列为：
Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu；采用羧肽酶Y法测定rhPTH(1-34)C-末端3个氨基酸序列为：His-Asn-Phe。N、C末端氨基酸序列分析结果与理论序列完全相同，说明我们制备的rhPTH(1-34)一级结构是正确的。
4、rhPTH(1-34)的质谱分析
采用Finnigan公司的LCQ-Classic质谱仪对纯化的rhPTH(1-34)进行质谱分析，测得rhPTH(1-34)的分子量为4117.5Da(见图9)。与rhPTH(1-34)的理论值(4118.8Da)一致。
5、内毒素及热原质试验
按照《中国生物制品规程》(2000年版)中“生物制品细菌内
毒素试验规程”的规定，用鲎试剂法检测所制备的rhPTH(1-34)样品的
内毒素含量不高于10EU/20μg rhPTH(1-34)。按照《中国生物制品规程》(2000年版)“生物制品热原质试验规程”的规定，采用家兔法测定其热原质为阴性。
实施例7  PTH活性测定
在96孔细胞培养板中接种UMR-106-01细胞(购自ATCC)，接种量为1～2×105个细胞/mL，100μL/孔，37℃，5％ CO2孵育过夜。用无血清培养基洗细胞一次，加入培养基(含20mM Hepes，0.1％牛血清白蛋白，0.2mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Sigma)，pH7.4)180μL，再加入20μL用该培养基稀释成不同浓度的hPTH(1-34)及其标准品(购自WHO生物制品标准品实验室(NIBSC))，同时设含与不含IBMX的对照，都作双复孔，37℃，5％ CO2孵育45min。去除培养基，每孔加200μL 0.1N HC1，温育30min，充分裂解细胞，取上清采用cAMP(low pH)KIT(R&D公司，Cat No.DE0355)测定cAMP值。数据利用计算机软件进行处理，并按下式公式计算结果：
Figure C200610070995D00171
结果表明，我们制备的rhPTH(1-34)与WHO对照品具有相同的生物活性，其比活性大于1.0×105U/mg rhPTH(1-34)。
实施例8  主要药效学试验
应用大鼠卵巢摘除(ovanceclomiwd，OVX)方法建立模拟原发性骨质疏松症模型，给予rhPTH(1-34)治疗8周后观察骨量、骨生物力学、骨形态计量和骨代谢相关血、尿生化指标综合评价其治疗效果。试验结果表明：
1)卵巢摘除12周组大鼠的子宫湿重明显较假摘卵组降低，骨量(股骨与腰椎骨密度)与骨生物力学性能(股骨三点弯曲载荷、腰椎压缩载荷)均较假摘卵组明显减少，表明雌激素缺乏所致骨质疏松大鼠模型成立；
2)rhPTH(1-34)对OVX诱发骨质疏松大鼠具有明显治疗效果。rhPTH(1-34)治疗8周，低剂量(10μg/Kg)组即对模型骨质疏松大鼠的股骨、腰椎骨量(干重、灰重、骨密度)生物力学性能(股骨三点弯曲最大载荷、腰椎压缩最大载荷)和腰椎骨小梁面积显示明显提高作用，并随治疗剂量增加而提高。
3)本实验中观察到rhPTH(1-34)注射4h时血钙磷有增高和下降波动改变，24h后正常。
因此，rhPTH(1-34)有显著促进成骨细胞骨形成作用，对骨质疏松大鼠具有明显治疗效果。
序列表
<110>深圳市华生元基因工程发展有限公司
<120>含有人甲状旁腺素1-34的融合蛋白及其表达载体
<130>FI-060212-59
<160>2
<170>Patentln version 3.2
<210>1
<211>117
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>肠激酶识别位点—人甲状旁腺素1-34肽的编码序列
<400>1
<210>2
<211>576
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>编码含有硫氧还蛋白和人甲状旁腺素1-34的融合蛋白的核苷酸序列
<400>2
Figure C200610070995D00182
Figure C200610070995D00191

Claims (5)

1.一种编码融合蛋白的重组DNA序列，其中：
所述融合蛋白具有：
(1)硫氧还蛋白的序列；
(2)位于所述硫氧还蛋白下游的甲状旁腺激素1-34肽；和
(3)位于所述硫氧还蛋白和所述甲状旁腺激素1-34肽之间的含有肠激酶识别位点的连接肽，其中所述的肠激酶识别位点的C端直接连接所述甲状旁腺激素1-34肽的N端；
并且，所述重组DNA序列包含编码所述融合蛋白中的所述肠激酶识别位点-甲状旁腺激素1-34肽的下列核苷酸序列：
GACGACGACGACAAGTCCGTTTCCGAAATCCAGCTGATGCACAA
CCTGGGTAAACACCTGAACTCCATGGAACGTGTTGAATGGCTGC
GTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACTTC。
2.权利要求1所述的重组DNA序列，其中所述融合蛋白还具有：
(4)任选的位于所述连接肽中或所述硫氧还蛋白的C端或N端的(His)6-Tag。
3.权利要求2所述的重组DNA序列，其中所述融合蛋白的序列从N端到C端为：硫氧还蛋白-(His)6-肠激酶识别位点-甲状旁腺激素1-34肽。
4.一种表达载体，其含有在启动子控制下的权利要求1-3中任一项所述的重组DNA序列。
5.权利要求4所述的表达载体，其中编码所述融合蛋白的核苷酸序列如下：
ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGAC
ACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTG
GGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGG
ATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAA
CTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCAT
CCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGC
GGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGT
TCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACC
ATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTAT
GAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACA
GCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGTCCGTTTCCGAA
ATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCCATGGA
ACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACT
TC。
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