CN1424325A

CN1424325A - 重组人甲状旁腺素1－34肽的生产工艺

Info

Publication number: CN1424325A
Application number: CN 01142627
Authority: CN
Inventors: 陈常庆; 修朝阳; 李民
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2001-12-12
Filing date: 2001-12-12
Publication date: 2003-06-18

Abstract

本发明提供了发明涉及人甲状旁腺素1－34肽的生产工艺，包含以下步骤：(a)在适合表达人甲状旁腺素1－34肽的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有Gly－Ser－Pro－PTH1－34肽；(c)用脯氨酸内肽酶酶切Gly－Ser－Pro－PTH1－34肽，形成PTH1－34肽；(d)分离纯化出PTH1－34肽。本发明还提供了相应的编码序列、载体和宿主细胞。本发明可高效、简便地生产高纯度、高活力的人甲状旁腺素1－34肽。

Description

重组人甲状旁腺素1-34肽的生产工艺

技术领域

本发明涉及DNA重组技术。更具体地，本发明涉及人甲状旁腺素1-34肽的生产工艺以及相应的编码序列、载体和宿主细胞。

背景技术

人甲状旁腺素是由甲状旁腺分泌的一种直链多肽激素，由84个氨基酸组成，N-端1-34肽段具有其完整的生物学功能(Potts，J.T.，Jr.，Kronenberg，H.M.，and Rosenblatt，M.Parathyroid hormone：chemistry，biosynthesis and mode ofaction(1982)Adv.Protein Chem.35，323-396.)。

目前，已经克隆得到了两种与PTH有关的受体，从骨细胞和肾脏细胞分离得到的I型受体能够介导多种与PTH相关的信号反应(Hisashi Takasu，Thomas J.Gardella，Michael D.Luck，et al.Amino-Terminal Modification of HumanParathyroid Hormone(PTH)Selectively Alter Phospholipase C Signaling via the Type1 PTH Receptor：Implication for Design of Signal-Specific PTH LigandsBiochemistry 1999，38，13453-13460)。通过受体的介导，PTH能够激活腺苷酸环化酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C等产生cAMP、IP₃、Ca⁺²和二酰基甘油等胞内二级信使。

由于人PTH(1-34)肽能够通过化学合成大量得到，因而人们采用合成的人PTH(1-34)肽进行过大量的结构功能研究。结果表明：hPTH His14-Phe34为受体活性结合区域(Caulfield MP.，McKee R.E.，Goldman M.E.，et al.The bovinerenal parathyroid hormone(PTH)receptor has equal affinity for two different aminoacid sequences：the receptor binding domains of PTH and PTH-related protein arelocated within the 14-34 region(1990)Endocrinology 127，83-87；Lopez-HilkerS.，Martin K.J.，Sugimoto T.，et al.Biologic activities of parathyroidhormone(1-34)and parathyroid hormone-related peptide(1-34)in isolated perfused ratfemur(1992)J.Lab.Clin.Med.119，738-743)，而N-端部分对于依赖cAMP的信号传导途径是必须的(Coleman，D.T.，Fitzpatrick，A.，and Bilezikian，J.P.(1994)in the Parathyroids，pp.239-258，Raven Press，New York；Luck M.D.，CarterP.H.，and Gardella T.J.The(1-14)fragment of parathyroid hormone(PTH)activites intact and amino-terminal truncated PTH-1 Receptors(1999)Mol.Endocrinol.13，670-680)。

由于人PTH在治疗骨质疏松症方面可能具有很好的应用前景。关于PTH制备方法的研究逐渐引起了人们的重视。除了用固相肽方法合成较短的PTH1-34肽及其类似物外，Forsberg G和Brobjer M等还将人PTH 84肽基因和IgG结合蛋白融合后，在大肠杆菌中进行表达，利用Thrombin&H64A两种酶切加工手段，分别得到了5mg/L和8mg/L的最终得率(Forsberg G，Brobjer M，HolmgrenE，et al.Thrombin and H64A subtilisin cleavage of fusion proteins for preparationof human recombinant parathyroid hormone(1991)J Protein Chem Oct；10(5)：517-26)。

Olstad OK、Reppe S等人则利用人PTH 84肽与酵母菌成熟因子-α融合的方式在酵母菌中表达了人PTH(Olstad OK，Reppe S，Gabrielsen OS，etc.Isolation and characterization of two biologically active O-glycosylated forms ofhuman parathyroid hormone produced in Saccharomyces cerevisiae.Identification of anew motif for O-glycosylation(1992)Eur J Biochem Apr 1；205(1)：311-9)。

Yuji Suzuki，Masayuki Yabuta and Kazuhiro Ohsuye则利用β-galactosidasederivative与PTH(1-34)融合后在大肠杆菌中形成包含体，利用Kex2-660和V8蛋白酶对其进行修饰以得到正确加工的人PTH(1-34)肽。然后，通过以下工艺流程是：菌体发酵-洗涤纯化融合蛋白(包含体)-酶解-加乙酸初步去处杂质蛋白-POROS HS50柱纯化-POROS R2 50纯化-去除乙腈-TSK凝胶-120T纯化的纯品。最终，得到了0.5g/l的产量(Yuji Suzuki，Masayuki Yabuta and KazuhiroOhsuye High-level production of recombinant human parathyroid hormone 1-34(1998)Applied and Environmental Microbiology，64(2)，526-529)。

Sung WL，Chan BS，Luk CK，Zahab DM等则利用人PTH(1-34)-Asp-Pro-与胰岛素前体基因融合表达的方式在大肠杆菌中进行表达，采用酸解的方式来获取人PTH(1-34)-Asp-，得到了约300mg/l的产量(Sung WL，Chan BS，LukCK，et al.High-yield expression of fully bioactive N-terminal parathyroid hormoneanalog in Escherichia coli.(2000)IUBMB Life Feb；49(2)：131-5)。

除了PTH(1-34)和PTH(1-84)以外，用基因工程方法表达的其他PTH衍生物还有PTH(1-37)、PTH(1-38)、PTH(3-84)等。一般来说，完整的84肽可采用单独表达的方式进行表达(包括分泌型表达)，而PTH34肽则采用与宿主蛋白融合表达的方式。

然而，到目前为止，PTH(1-34)肽的生产工艺还不能十分令人满意。因此，本领域迫切需要开发新的生产PTH(1-34)肽的工艺。

发明内容

本发明的一个目的就是提供新的人甲状旁腺素1-34肽生产工艺，该工艺可高效、简便地生产高纯度、高活力的人甲状旁腺素1-34肽。

本发明的另一目的是提供相应的编码序列、载体和宿主细胞。

在本发明的第一方面，提供了一种甲状旁腺素前体肽，它包含人甲状旁腺素1-34肽，以及在人甲状旁腺素1-34肽前的脯氨酸内肽酶酶切位点。在一种优选例中，该甲状旁腺素前体肽具有SEQ ID NO：2氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，本发明的人甲状旁腺素前体肽。在优选例中，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。在另一优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明上述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的载体。在一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌pGEX-PT，保藏号为CGMCC No.0631。

在本发明的第五方面，提供了一种人甲状旁腺素1-34肽的制备方法，该方法包含步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的人甲状旁腺素前体肽，即Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽；

(c)用脯氨酸内肽酶酶切Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽，形成PTH 1-34肽；

(d)分离纯化出PTH 1-34肽。

在一优选例中，在本发明的方法中，所述的步骤(b)包括：

通过GST柱分离出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽与GST的融合蛋白；

用凝血酶从所述融合蛋白中切下GST，形成Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽：

通过靡蛋白酶亲和柱分离出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽。

在另一优选例中，在所述的步骤(d)中，通过靡蛋白酶亲和柱分离出PTH 1-34肽。在另一优选例中，所述的步骤(d)还包括C18柱脱盐和冻干。

附图说明

图1显示了PTH融合表达质粒pGEX-PT的鉴定与分析。其中图1A：PTH(1-34)肽前体基因的PCR检测：泳道1为PCR产物123bp；泳道2为DNA分子量标准对照(从上到下依次为657/458/434/328/289/267/174/142/102/80/40)。图1B为融合基因的表达与表达产物可溶性的分析：泳道1为.BL21宿主菌阴性对照；泳道2为BL21/pGEX-PT工程菌株全菌液；泳道3为表达产物上清；泳道4为pGEX空载体表达；泳道5为空载体表达菌株破菌上清；泳道6为中分子量蛋白标准对照。

图2显示了脯氨酸内肽酶(PEP酶)对pH条件的依赖性及最适pH条件下的酶作用曲线。其中图2A对37肽酶切生成34肽的pH依赖关系；图2B：在pH8.5时PEP酶对底物加工的时间作用曲线，34肽产物均采用HPLC检验。

图3显示了凝血酶对Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽的作用。其中图3A凝血酶对37肽作用的时间曲线；图3B凝血酶对37肽酶解产物的HPLC质谱联用分析中的液相图谱。

图4显示了GST-Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)融合蛋白的表达电泳图。其中各泳道分别是1.中分子量标准(96000；64000；41000；30000；17000)2.宿主菌条带对照3.种子在摇瓶中的表达量4-6.连续三批发酵的表达量7.亲和纯化后的融合蛋白。

图5显示了凝血酶加工检测及亲和柱纯化数据。

其中图5A：融合蛋白加工图谱，各泳道如下1.酶切后的融合蛋白2.酶切前的融合蛋白3.Promega低分子量标准。

图5B：亲和纯化的洗脱图谱，其中峰a为流穿峰，峰b，c，d为洗脱峰。

图5C：亲和纯化的蛋白电泳检测。各泳道如下：1.流穿峰(即峰a)2洗脱前峰(即峰b)3.亲和前样品4.亲和洗脱的PTH前体肽(即峰d)5.Promega低分子量标准。

图6显示了Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽用PEP酶切加工过程中的HPLC数据及最终产物的纯度鉴定结果。

其中，图6A：PEP酶切加工21小时HPLC图谱，其中两个保留时间分别为10.2分钟为产物峰，10.8分钟为样品峰。

图6B显示了产物PTH(1-34)肽的HPLC纯度鉴定；

图6C显示了产物PTH(1-34)肽的毛细管电泳纯度鉴定。

具体实施方式

为了改进人PTH34肽制备的基因工程方法，本文充分利用了已有的能够专一性酶切脯氨酸肽键的脯氨酸内肽酶(PEP)研究结果，并结合修饰靡蛋白酶亲和层析方法，成功的实现了重组人PTH34肽的高效表达，经高密度发酵和酶切加工亲和纯化，每升发酵液至少可达0.5g(最高可达1g)的产物。

具体而言，本发明采用基因工程的方法，将PTH(1-34)肽与谷胱甘肽巯基转移酶融合并采用凝血酶和PEP酶双酶切后加工的方法进行表达，不仅获得了较高的表达量，提供了一种快速纯化PTH(1-34)肽的方法，大大简化了纯化过程，而且避免了化学合成中对人体造成较高毒性的弊端和小肽单独表达后不利于检测、纯化的缺点。sjur Reppe，Odd S.Gabrielsen，Ole Kristoffer Olstad等人[SjurReppe，Odd S.Gabrielsen，Ole Kristoffer Olstad，etc.Characterization of a K26Qsite-directed mutant of human parathyroid hormone expressed in yeast.J Biol Chem.1991 Aug 5；266(22)：14198-201]及Goran Forsberg，Michael Brobjer，Erik Holmgren等人[Forsberg G，Brobjer M，Holmgren E，et al.Thrombin and H64A subtilisincleavage of fusion proteins for preparation of human recombinant parathyroidhormone(1991)J Protein Chem Oct；10(5)：517-26]在表达获取PTH(1-84)肽时曾报道过，PTH84肽内部的某些位点在表达和纯化过程中，易于被蛋白酶降解而造成损失，回收率降低。

为了检验双酶切工艺的效果及PTH(1-34)肽内部是否存在潜在的作用位点，本发明特意设计了利用化学合成的Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)前体肽与Thrombin酶及PEP酶共同作用的实验，结果可以看出，这种内部酶切反应在最初的几小时内并不明显，而且在采用了相应正确的酶反应条件之后，这种现象在本发明中得到了有效的控制，一方面可能是由于融合蛋白造成的空间效应阻碍了酶的识别；另一方面可能是由于内部位点并非凝血酶的最适位点，因此在采用了正确的酶切策略后，这种效应降到最低。这也从另一个角度验证了双酶切工艺的必要性，因为如果在PTH(1-34)与融合蛋白之间加入一个Gly-Lys-X的非最适位点，酶切时间就必须相应的延长，从而加剧凝血酶对PTH内部位点的降解，降低产率。另外，通过对化学合成底物及基因表达底物的对比，发现PEP酶对两种来源的肽段的加工动力学基本一致。

另外，本发明由于采用了大肠杆菌自身的宿主蛋白，不仅使mRNA的翻译效率提高，而且也有效的避免了宿主菌蛋白酶的攻击。由于PTH(1-34)肽内部即存在Met位点又存在Asp位点，因此相应的化学降解手段并不可行。根据PTH(1-34)肽中不存在Pro-位点的独特的序列特征，充分利用了本发明室克隆的PEP酶已知的性质特征和酶反应条件，在PTH(1-34)肽N-端加入了一个脯氨酸位点，从而较好的解决了由于融合表达而导致的后加工问题。但PEP酶本身并不能直接加工大的蛋白分子，当PEP酶与融合蛋白直接作用时，PEP酶对于蛋白内部的Pro位点基本上没有修饰加工作用。这也从一个侧面证明了，利用凝血酶和PEP双酶切加工工艺的必要性。对于PEP酶的其他加工特性将在以后的实验中作进一步的阐述。

另外，本发明还利用靡蛋白酶在脱水后，其底物降解活性基本消失，而底物结合活性并不丢失的特点，设计了利用脱水靡蛋白酶-Sepharose 4B亲和介质，快速、高效纯化PTH(1-34)肽及其前体肽的方案。这种亲和介质最早被用作一种肽谱分析手段，它可以专一的从靡蛋白酶处理液中结合被降解肽段[12]，用作规模化生产尚未见报道。靡蛋白酶经处理后，其活性中心的Ser位点会由于脱水转变为脱水丙氨酸(dehydroalanine)，而破坏了底物降解活性所必需的电子传递链，导致靡蛋白酶的降解活性丢失，但并不影响靡蛋白酶对于相应底物的结合。这使得脱水靡蛋白酶有利于作为一种亲和配体而被采用。对于那些反应性底物而言，由于其芳香簇氨基酸C-端存在其他种类的氨基酸或氨基酸组成的肽链，空间位阻的作用同样使得它们在与产物性底物的竞争中处于劣势，因此有条件将这两种底物分开。由于酶的空间构象随pH的变化会发生较大的变动，而这些变动使得结合的底物与酶分离，利用这一原理，可以采用pH梯度洗脱的方法进行洗脱。由于这种亲和树脂具有很高的专一性，因此它还具有将产物与后加工酶分离的作用，给纯化带来方便。

本发明解决了PTH研究中的大量样品来源问题，为今后研究和利用PTH及其衍生物打下了良好的基础。同时由于本发明是一个较普遍的多肽表达体系，因此本发明同样适用于其他符合凝血酶和PEP双酶切加工条件的多肽。

本发明提供了一种甲状旁腺素前体肽，其中引入了在PTH 1-34肽前引入了PEP酶切位点。一种优选的前体肽包含SEQ ID NO：2氨基酸序列。

本发明还提供了相应的编码该前体肽的核苷酸序列，一种优选的多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了含有上述多核苷酸的载体。适用于本发明的载体包括本领域中熟知的各种表达载体，一种优选的载体是pGEX载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，含有上述的载体，从而可以表达甲状旁腺素前体肽，或者表达甲状旁腺素前体肽与其他蛋白的融合蛋白，例如甲状旁腺素前体肽-GST融合蛋白。

本发明还提供了生产PTH 1-34肽的方法。通常，该方法包括以下步骤：

(a)表达甲状旁腺素前体肽

该步骤就是在适合表达的条件下，培养本发明上述转化的、携带表达载体的宿主细胞，而所述表达载体中含有编码甲状旁腺素前体肽或其融合蛋白的DNA序列。

一种优选的发酵条件是：NBS Bioflo3000型5升自动发酵罐中进行，选取表达量达25％以上的种子液，按照1％的接种量接种到含有120ml基础培养液的500ml摇瓶中，37℃过夜培养。将过夜培养物转接入5L的发酵罐中于37℃进行恒溶氧分批补料培养，当OD₆₀₀达到60左右时，加入终浓度为0.4mmol的IPTG，诱导3小时后终止发酵。

(b)从培养物中分离Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽

一种方法是直接分离Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽，如果表达产物就是Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽的话。

另一种方法是表达Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽的融合蛋白，例如Gly-Ser-Pro-PTH1-34肽-GST融合蛋白，然后通过GST柱分离出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽与GST的融合蛋白；再用凝血酶从所述融合蛋白中切下GST；最后通过靡蛋白酶亲和柱分离出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽。

一种优选的分离纯化融合蛋白的条件是：纯化：将发酵结束后，离心收集的菌体重新悬浮于1×PBS缓冲液中，超声破碎。15000rpm离心15分钟收集上清。将收集到的上清液通过用1×PBS平衡好的GST亲和柱，用10倍柱体积的1×PBS重新平衡亲和柱至没有蛋白洗脱为止，用洗脱液(10mmol谷胱甘肽，50mmol Tris(pH 8.5))洗脱融合蛋白并收集。亲和柱用溶液A(pH 8.5 50mmolTris-HCl，0.5N NaCl)和溶液B(pH4.5 50mmol HAc-NaAc 0.5N NaCl)交替淋洗再生。

一种优选的凝血酶酶切条件是：按每2mg GST-PTH(1-34)融合蛋白加入1U的凝血酶(Thrombin)于50mM Tris-HCl(pH8.4)22℃进行酶切。

靡蛋白酶(chymotrypsin)亲和层析方法是一种较为常用的纯化方法，在例如下列文献中有描述：Weiner H，White W.N.，Hoare D.G.，etc.The formation ofanhydrochymotrypsin by removing the elements of water from the serine at the activesite(1966)J.Am.Chem.Soc.88，3851-3859；Takashi Kumazaki，Asamichi Fujitani，Kumiko Terasawa，etc.(1988)J.Biochem.103，297-301；Rolf Axen and SverkerErnback Chemical fixation of enzymes to cyanogen halide activated polysaccharidecarriers(1971)Eur J Biochem.18，351-360。

一种亲和纯化人PTH(1-34)前体肽的优选条件是：将凝血酶切后产物对L缓冲液(20mM NaH₂PO₄，20mM硼酸，20mM乙酸，0.1M NaCl pH5.0)透析过夜，与亲和树脂(即脱水靡蛋白酶亲和柱)室温下结合；用L缓冲液平衡柱子；将L缓冲液对Vs H缓冲液(20mM Na₃PO₃，20mM四硼酸钠，0.2M NaCl，pH 10)进行pH梯度洗脱。收集样品峰。

(c)用脯氨酸内肽酶酶切Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽，形成PTH 1-34肽；

一种优选的反应条件是：将PEP酶与样品按照1：50(w/w)的比例混合后，于20mM Tris-HCl(pH8.5)34℃条件酶切30小时，同时酶切过程用HPLC监测。

(d)分离纯化出PTH 1-34肽。

一种优选方法是通过靡蛋白酶亲和柱分离出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽。此外，所述的步骤(d)还包括C18柱脱盐和冻干。

一种亲和纯化人PTH(1-34)肽的优选条件是：将酶切后产物对L缓冲液(20mMNaH₂PO₄，20mM硼酸，20mM乙酸，0.1M NaCl pH5.0)透析过夜，与亲和树脂室温下结合；用L缓冲液平衡柱子；将L缓冲液对Vs H缓冲液(20mM Na₃PO₃，20mM四硼酸钠，0.2M NaCl，pH 10)进行pH梯度洗脱。收集样品峰。

由于本发明改进了人甲状旁腺素的编码序列，并采用凝血酶和PEP酶双酶切和靡蛋白酶亲和层析法的工艺，因此本发明工艺可高效、简便地生产高纯度、高活力的人甲状旁腺素1-34肽。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

一.材料

菌种与质粒：大肠杆菌BL-21(supE hsdΔ5 thiΔ(lac-proAB)F′[traD36proAB′lacZ⁹ lacZ ΔM15]。pGEX-4T-3质粒购自Pharmacia公司。

酶类：T₄DNA激酶，T₄DNA连接酶，限制性内切酶，购自宝灵曼公司，靡蛋白酶为上海第一生化药业公司产品粗品进一步纯化。

主要试剂：PTH(1-34)肽和Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)前体肽由采用Fmoc/tBu固相肽合成方法合成。谷胱甘肽Sepharose 4B和和Sepharose fast flow 4B树脂购自Pharmacia公司，低分子量标准购自Promega公司，中分子量蛋白标准购自丽珠东风公司，Prosphere 300A C₁₈反相多肽柱购自Alltech公司。

实施例1

基因的合成

根据Gly-Ser-Pro-hPTH34肽的氨基酸序列，选用大肠杆菌优选密码子，设计并在ABI 391核酸合成仪上合成了如下6个片段(P1-P6)：

P1.5′-cc gga tcc ccg tct gtt tct gaa atc-3′(26bp)(SEQ ID NO：5)

P2.5′-cag ctg atg cac aac ctg ggt aaa cac ctg aac tct atg gaa cgt gtt gaa tgg-3′(54bp)(SEQ ID NO：6)

P3.5′-ctg cgt aaa aaa ctg cag gac gtt cac aac ttc taa tag c-3′(40bp)(SEQ ID NO：7)

P4.5′-cag ctg gat ttc ag-3′(14bp)(SEQ ID NO：8)

P5.5′-t acg cag cca ttc a-3′(14bp)(SEQ ID NO：9)

P6.5′-cg ctc gag cta tta gaa gtt gtg aac-3′(26bp)(SEQ ID NO：10)

P1、P2、P3组成基因的上链部分。P4和P1的3′末端及P2的5′末端各有7个碱基互补。P5和P2的3′末端及P3的5′末端各有7个碱基互补。P6则与P3在3′末端由19个碱基互补。

将合成的P₂、P₃片段5′磷酸化后，通过以P₄、P₅为补丁的连接方式得到P₁、P₂和P₃连接成的基因上链，再以P₁和P₆为引物，PCR扩增得到目的基因。DNA序列分析由上海基康公司代为测定。测序结果证实了人工合成的基因的序列如下：

gga tcc ccg tct gtt tct gaa atc cag ctg atg cac aac ctg ggt aaa 48

cac ctg aac tct atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aaa aaa ctg cag 96

gac gtt cac aac ttc 111

(SEQ ID NO：1)

编码的具有SEQ ID NO：2所示的蛋白质：

Gly Ser Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys

1 5 10 15

His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln

20 25 30

Asp Val His Asn Phe

35

实施例2

工程菌的构建

然后将实施例1中构建的目的基因用BamHI/XholI双酶切后，与经同样处理的pGEX-4T-3质粒连接，转染宿主菌BL21。抗性平板筛选阳性克隆，挑选单菌落进行培养。当菌体密度达到0.6OD₆₀₀时，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导表达筛选，从表达目的产物的阳性菌株中挑选出一株，抽提其质粒，以基因片段P₁、P₆为引物，进行PCR反应，可见到预期长度的PCR扩增片段。DNA序列分析也与预期的相符(PCR结果与基因测序结果见图1A)。该菌株命名为大肠杆菌pGEX-PT，其表达结果见图1B，在分子量为30000道尔顿处，可见到明显的融合蛋白表达条带，表达量与空载体的GST蛋白表达量相近，并为完全可溶性蛋白。

该工程菌pGEX-PT于2001年9月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.0631。

实施例3

凝血酶酶切预实验和PEP酶切条件条件的摸索

(1)PEP酶切条件条件的摸索

为了确定所设计的融合蛋白中的Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽是否能够被脯氨酸内切酶顺利的进行加工，首先采用了化学合成的前体37肽进行了条件实验。将PTH(1-34)肽前体37肽，分别溶于20mM的pH值为5.8、6.8、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10的适当缓冲液中(其中pH5.8为磷酸盐缓冲液，其余pH值均为Tris-HCl缓冲液)，配成1mg/ml的底物反应液。按照1∶50(w/w)比例加入PEP酶。在34摄氏度条件下对底物作用7小时后，HPLC分别检测34肽产物的含量，实验结果表明：PEP对37肽作用的最适pH为8.5(图2A)。但酶切反应的速度较慢，在pH8.5条件下，初始的7小时内，酶切反应的产物量基本上呈线性关系(图2B)。

(2)凝血酶作用实验

在PTH(1-34)肽序列中，存在这一个潜在的可能的凝血酶作用位点(Leu-Gly-Lys-His-Leu(11-15))。为了确定是否可以用凝血酶进行融合蛋白的酶切后加工，采用了化学合成的PTH(1-34)肽前体进行凝血酶切加工预实验。酶切反应条件为pH8.0的20mM Tris-HCl反应液，底物浓度为1mg/ml。按每毫克底物加入1单位的凝血酶于22摄氏度进行反应，每2小时取样一次。

结果见图3A。从图中可以看出，虽然前体肽中存在着可能的凝血酶加工位点，但这种加工在最初的几个小时内并不明显，只是在作用时间延长后，才逐渐的表现出加工产物的积累(见图3A)。在初始的4小时内，降解的量不超过5％，选用最佳酶切位点、加大合适酶量和减少作用时间的反应条件有可能是可行的。

用HPLC-质谱联用分析凝血酶对37肽作用14小时后的结果见图3B，峰a和峰b的分子量分别为1660和2697，推测可能是PTH(1-34)肽前体的Gly-Ser-Pro-PTH(1-13)和PTH(14-34)肽，峰c分子量为4358，为未降解的37肽前体。因此PTH(-34)肽分子内部确实存在一个凝血酶作用位点。这在采用以凝血酶加工融合表达的PTH(1-34)肽时，应该加以注意。

实施例4

GST-PTH(1-34)融合蛋白工程菌的高密度发酵

(1)工程菌发酵的菌体量和表达量

为了检验在高密度发酵时，菌体密度的高低对最终产物表达的影响，分别在NBS Bioflo3000 5升自动发酵罐上进行了不同密度的连续三批发酵，分别在菌体密度达到15、30及60 OD₆₀₀左右时，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，三批发酵的最终密度分别为21.5、46.5和98 OD₆₀₀。湿菌体回收量分别约61.49、133和280g/L湿重，种子及三批发酵液表达量如图4。电泳结果显示，在pH、温度、溶氧及补料速度等条件相同的情况下，发酵密度对增加产物的表达量无明显影响。

(2)高密度发酵

高密度发酵是在NBS Bioflo3000型5升自动发酵罐中进行，选取表达量达25％以上的种子液(工程菌是大肠杆菌pGEX-PT)，按照1％的接种量接种到含有120ml基础培养液的500ml摇瓶中，37℃过夜培养。将过夜培养物转接入5L的发酵罐中于37℃进行恒溶氧分批补料培养，当OD₆₀₀达到60左右时，加入终浓度为0.4mmol的IPTG，诱导3小时后终止发酵。

实施例5

融合蛋白的纯化

发酵结束后，离心收集的菌体重新悬浮于1×PBS缓冲液中，超声破碎。15000rpm离心15分钟收集上清。将收集到的上清液通过用1×PBS平衡好的GST亲和柱，用10倍柱体积的1×PBS重新平衡亲和柱至没有蛋白洗脱为止，用洗脱液(10mmol谷胱甘肽，50mmol Tris(pH 8.5))洗脱融合蛋白并收集。亲和柱用溶液A(pH 8.5 50mmolTris-HCl，0.5N NaCl)和溶液B(pH4.5 50mmol HAc-NaAc0.5N NaCl)交替淋洗再生。

取40g湿菌超声破碎后，15000rpm离心15分钟收集上清，与20ml谷胱甘肽GST亲和树脂进行亲和纯化，得到50ml样品，经Bradford法测蛋白含量，约为33.3mg/ml，总计约1600mg蛋白，合11.2克融合蛋白/升发酵液。

实施例6

GST融合蛋白的凝血酶酶切分离

A.无水靡蛋白酶-Sepharose 4B亲和柱的制备

(1)无水靡蛋白酶的制备：取1g靡蛋白酶溶于30ml pH 7.0的50mM磷酸缓冲液中，加入100ul 1M PMSF的二氧六环溶液，充分混匀，室温下静置15′(重复3次)；用0.1N NaOH将酶稀释至8mg/ml于0度静置4h依脱去Ser位点上的修饰基团；用盐酸将溶液pH调至7.0，分子筛回收后即为脱水靡蛋白酶。

(2)Sepharose 4B的CNBr活化：称8克(湿重)Sepharose 4B，依次用1M NaCl溶液、双蒸水洗，虑干后转移至100ml小烧杯内。在通风橱内加入10ml 0.2NNa₂CO₃溶液，放置冰浴中，电磁搅拌，反应器内的温度保持在5摄氏度左右。小心称取2克CNBr置于另一烧杯内，加入5ml乙腈使之完全溶解。用滴管将CNBr溶液滴加到装有树脂的烧杯内，并同时滴加5N NaOH溶液，使反应液的pH值保持在pH10.5(用酸度计测量)，直到CNBr加完后继续反应5分钟，停止反应(加入一定量的固体FeSO₄以破坏未反应的CNBr)。虑干树脂，200ml预冷的双蒸水淋洗，再用适量0.2N Na₂CO₃-Na₂HCO₃(PH9.5)缓冲液洗。抽干后立即偶联。CNBr活化使用过的器具都要经过硫酸亚铁溶液处理。

(3)靡蛋白酶的偶联：将靡蛋白酶溶于0.1N NaHCO₃(pH8.0)，加入活化的树脂，于4摄氏度偶联过夜；分别用10倍体积0.1M NaHCO₃、1mM HCl、0.5MNaCl、H₂O依次各浸泡3次，每次1小时；最后保存于50％乙醇中。

B.靡蛋白酶亲和层析

将凝血酶切后产物对L缓冲液(20mM NaH₂PO₄，20mM硼酸，20mM乙酸，0.1M NaCl pH5.0)透析过夜，与亲和树脂室温下结合；用L缓冲液平衡柱子；将L缓冲液对VsH缓冲液(20mM Na₃PO₃，20mM四硼酸钠，0.2M NaCl，pH 10)进行pH梯度洗脱。收集样品峰。

将500mg融合蛋白经凝血酶酶切3小时后，多肽电泳检测证实酶切基本完全，并看到了约4500道尔顿的目的产物条带(如图5A.)。将酶切后的样品，用脱水靡蛋白酶亲和柱(实施例6中制备的亲和柱)纯化回收前体肽段，经电泳检测，其纯度达到了90％以上(如图5B和C.)。前体肽回收量50mg，回收率为75％。亲和纯化后的前体肽用C18反相柱脱盐后，冷冻干燥获得干品即Gly-Ser-Pro-PTH1-34肽，备用。

实施例7

前体肽的PEP酶切和产物的纯化

称取PTH前体肽约14mg溶于20mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液中，配成1mg/ml底物反应液，按照1∶50(w/w)的比例将PEP酶与前体肽进行反应，反应过程用HPLC数据跟踪检测。Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽和产物PTH(1-34)肽在HPLC图谱上的定位通过质谱检测分子量来确定(见图6A)。

结果表明在酶底物作用35小时后反应基本进行完全。产物和底物峰的保留时间分别为10.2(分子量4117)和10.8(分子量4358)分钟。这一结果与PEP酶对化学合成的37肽前体的加工行为基本一致。酶切所得产物再HPLC柱上的洗脱位置也与化学合成的PTH(1-34)肽相同。

PEP酶切产物经脱水靡蛋白酶亲和柱一次纯化亲和纯化、C18柱脱盐和冻干后，即可得到PTH(1-34)肽纯品，约10毫克(0.694克PTH(1-34)/升发酵液)，酶切回收率约71.6％左右。

在另一次采用相同程序的制备例中，产率为0.923克PTH(1-34)肽纯品/升发酵液。

实施例8 PTH 1-34肽的鉴定

(1)PTH 1-34肽的HPLC纯度鉴定

将样品上HPLC反向柱(Prosphere 300 C₁₈)采用溶液A对溶液B(B由0-100％)35分钟线性梯度洗脱。溶液A液为：20％CH₃CN；80％H₂O；0.1％TFA；溶液B液为：95％CH₃CN；5％H₂O；0.1％TFA。

HPLC鉴定纯度为98％(图6B)，毛细管电泳鉴定纯度为97％(图6C)。

(2)N-端氨基酸序列分析

委托中科院上海生科院生化细胞所进行。N端10个氨基酸的序列分析结果为：SVSEIQLMH(SEQ ID NO：11)，与预期的天然肽段序列相符。

(3)HPLC-质谱联用分析

由上海市计量所承担，HPLC操作条件参考方法9。毛细管电泳纯度分析由中科院上海生科院生化细胞所完成，条件为：50mM PBS(pH2.5)/20KV电压/40cm管程。

测得重组制备的PTH1-34肽分子量为4117道尔顿，前体肽的分子量为4358道尔顿。

微生物保藏

实施例1中获得的工程菌大肠埃希氏菌(即大肠杆菌)pGEX-PT于2001年9月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.0631。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表<110>中国科学院上海生物工程研究中心<120>重组人甲状旁腺素1-34肽的生产工艺<130>016840<160>11<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>111<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<223>人工合成的Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽编码序列<220><221>CDS<222>(1)..(111)<400>1gga tcc ccg tct gtt tct gaa arc cag ctg atg cac aac ctg ggt aaa 48Gly Ser Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys1 5 10 15cac ctg aac tct atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aaa aaa ctg cag 96His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln

20 25 30gac gtt cac aac ttc 111Asp Val His Asn Phe

35<210>2<211>37<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽<400>2Gly Ser Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys1 5 10 15His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln

20 25 30Asp Val His Asn Phe

35<210>3<211>102<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(102)<220><221>misc_feature<222>(1)..(102)<223>人工合成的PTH(1-34)肽编码序列<400>3tct gtt tct gaa atc cag ctg atg cac aac ctg ggt aaa cac ctg aac 48Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15tct atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aaa aaa ctg cag gac gtt cac 96Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30aac ttc 102Asn Phe<210>4<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(102)<223>PTH(1-34)肽<400>4Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Ash Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30Asn Phe<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO：1的片段<400>5ccggatcccc gtctgtttct gaaatc 26<210>6<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO：1的片段<400>6cagctgatgc acaacctggg taaacacctg aactctatgg aacgtgttga atgg 54<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO：1的片段<400>7ctgcgtaaaa aactgcagga cgttcacaac ttctaatagc 40<210>8<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO：1的片段<400>8cagctggatt tcag 14<210>9<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO：1的片段<400>9tacgcagcca ttca 14<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID N0：1的片段<400>10cgctcgagct at tagaagtt gtgaac 26<210>11<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>11Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His1 5

Claims

1.一种甲状旁腺素前体肽，其特征在于，它包含SEQ ID NO：2氨基酸序列。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，它是大肠杆菌pGEX-PT，保藏号为CGMCC No.0631。

7.一种人甲状旁腺素1-34肽的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；

(c)用脯氨酸内肽酶酶切Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽，形成PTH 1-34肽；

(d)分离纯化出PTH 1-34肽。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括：

通过GST柱分离出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽与GST的融合蛋白；

用凝血酶从所述融合蛋白中切下GST，形成Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽；

通过靡蛋白酶亲和柱分离出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(d)中，通过靡蛋白酶亲和柱分离出PTH 1-34肽。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤(d)还包括C18柱脱盐和冻干。