CN1143678A

CN1143678A - 编码乳-n-乙糖苷酶的基因

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Publication number: CN1143678A
Application number: CN96108908A
Authority: CN
Inventors: 三田正范; 佐野睦; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc; Takara Holdings Inc
Priority date: 1995-04-27
Filing date: 1996-04-27
Publication date: 1997-02-26
Anticipated expiration: 2016-04-27
Also published as: CN1100878C; KR960037830A; EP0739983B1; US5908772A; EP0739983A3; EP0739983A2; KR100465927B1; DE69638104D1

Abstract

一种分离的DNA，它具有编码有乳-N-乙糖苷酶活性多肽或其功能等同变异体的序列；以及一种使用该分离的DNA借助重组DNA技术生产具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽或其功能等同变异体的方法。

Description

编码乳-N-乙糖苷酶的基因

本发明涉及一种编码具有乳-N-乙糖苷酶(lacto-N-biosidase)活性多肽的基因，以及一种用该基因生产具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽的方法。

近几年来，人们极大关注存在于动物细胞表面的称之为复合碳水化合物，如糖蛋白和糖脂，的糖链的各种生理功能。具有高度特异性的糖苷酶已成为研究糖链结构和生物活性的一种非常有用的工具。在糖蛋白N-和O-连接的糖链中或者在糖脂的糖链中经常会发现两种类型的糖链，I型结构(Galβ1-3GLcNAcβ1-)和2型结构(Galβ1-4Glc NAcβ1-)。在对这些糖链的结构分析中，由于乳-N-乙糖苷酶能够特异性地作用在1型结构上并且能够使乳-N-乙糖(Galβ1-3GlcNAc)从未还原的末端脱离，所以它被作为一种非常有用的试剂。

就乳-N-乙糖苷酶而言，人们已经熟知用链霉菌属菌株生产的乳-N-乙糖苷酶[Proceedings of the National Academyof Sciences of the USA，89，8512-8516(1992)；Journalof Biological Chemistry，268，18560-18566(1993)]。

由于生产乳-N-乙糖苷酶的链霉菌属的细菌也能够生产出其它酶如蛋白酶，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和α-1，3/4-岩藻糖苷酶，所以用培养这种细菌来生产乳-N-乙糖苷酶的方法需要单调耗时的纯化步骤。为了诱发酶的产生，还需要加入L-岩藻糖，猪胃粘蛋白等。所以，现在仍需要一种低成本高纯度地生产乳-N-乙糖苷酶的方法。

尽管人们已知从链霉菌属菌株的培养物中纯化乳-N-乙糖苷酶的方法(日本专利特许公开号6-153944)，但是至今仍然没有阐明乳-N-乙糖苷酶的氨基酸序列和编码该酶的基因序列，因而妨碍了用重组DNA技术生产乳-N-乙糖苷。

本发明的一个目的是提供一种编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽的基因。

本发明的另一个目的是提供一种用本发明的基因以工业规模生产具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽的有益方法。

放线菌纲的基因常常具有高含量的G＋C，由此进行所需基因的分离非常困难。这反映在放线菌纲中已构建序列的基因数明显少于其它微生物中的基因数。

为了阐明乳-N-乙糖苷酶的氨基酸序列和编码乳-N-乙糖苷酶的基因序列，本发明人用生产乳-N-乙糖苷酶的一种放线菌纲菌株(链霉菌sp142)进行了广泛的研究，并且首次成功地建立了该基因的全部碱基序列和乳-N-乙糖苷酶的氨基酸序列。本发明人也成功地开发出一种用本发明基因工业规模生产乳-N-乙糖苷酶的有益方法。基于这些研究，完成了本发明。

本发明的要点与下列有关：(1)一种分离出来的DNA，它含有编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多或其功能等同变异体的序列；(2)一种分离出来的能够杂交到上述(1)中所定义的任一分离DNA的DNA，其中该分离DNA能够编码具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽或其功能等同变异体；(3)一种重组DNA，它含有能够编码具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽或其功能等同变异体的一种DNA序列；(4)一种表达载体，它含有一种重组DNA，这种重组DNA含有一种能够编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽或其功能等同变异体的DNA序列，其中该表达载体在原核细胞或真核细胞中繁殖；(5)一种用表达载体转化的原核细胞或真核细胞，其中该表达载体含有一种能够编码具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽或其功能等同变异体的DNA序列；以及(6)一种生产具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽或其功能等同变异体的方法，包括下列步骤：

(a)培养一种通过把表达载体导入宿主细胞而所得到的转化子，该表达载体含有如上述(1)或(2)中所定义的任何一种分离DNA的DNA序列；并且

(b)从(a)步骤中得到的培养物中分离具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽或其功能等同变异体。

本发明首次提供了全部乳-N-乙糖苷酶的氨基酸序列和编码该酶的基因序列，由此使用重组DNA技术可以有利地以工业规模化地生产具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽。

图1显示了限制性内切酶的遗传基因图谱，(A)是插入pULNBP80的PstI片断的PstI-KpnI区；(B)是插入pULNBP2-17的PstI片断的MluI-PstI区，(A)和(B)中都用粗线表示出了乳-N-乙糖苷酶基因的位置。

本说明书中所用的术语“乳-N-乙糖苷酶”是指一种酶，这种酶能够特异性作用于具有用Galβ1-3GlcNAc β1-R(R是糖残基)表示的结构的糖链，并且只能够特异性催化乳-N-乙糖苷键的水解。本文所用的术语“具有乳-N-乙糖苷酶活性”是指用美国国家科学院学报[Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe USA，89，8512-8516(1992)]中所述的方法测定的乳-N-乙糖苷酶的活性不小于1×10^-7单位。本文所用的术语“具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽”不仅包括天然乳-N-乙糖苷酶而且还包括由于缺失、取代、插入或增加氨基酸等对氨基酸序列的修饰而产生的其变异体，只要它们保留了乳-N-乙糖苷酶活性即可。

本文所用的“天然乳-N-乙糖苷酶”包括(但不限定)由链霉菌属菌株所产生的那些。还包括源于其它微生物如细菌，酵母，真菌，子囊菌类和担子菌纲的那些乳-N-乙糖苷酶，以及源于植物和动物的那些乳-N-乙糖苷酶。

本文所用的术语“功能等同变异体”是如下定义的：

由于体内或纯化过程中以及由于多型现象和编码该蛋白的基因变异、自身蛋白质的修饰等，天然产生的蛋白会出现氨基酸的缺失、插入、加入、替换或者其氨基酸序列中的其它变异。人们众所周知存在着这样一些多肽，它们在生理和生物活性方面几乎等同于没有异变的蛋白。作为功能等同变异体是指与相应蛋白相比尽管结构上不同但没有明显功能差别的多肽。

这同样适用于通过人工手段向蛋白质的氨基酸序列中导入这种变异体而制备的多肽。尽管这样能够获得更多的不同变异体，但只要它们的生理活性基本等同于天然无变异的蛋白活性，就可以把所得到的这些变异体解释为功能等同变异体。

例如，据报导，人们经常用蛋氨酸氨肽酶作用来除去大肠杆菌内表达的蛋白N-末端的蛋氨酸残基，但是这样表达的蛋白一些有蛋氨酸残基，另外一些却没有。尽管如此，大多数情况下，蛋氨酸残基的存在与否都不影响蛋白质活性。人们还知道在人白介素2[IL-2)的氨基酸序列中用丝氨酸替换特定的半胱氨酸残基所得到的多肽仍保留着IL-2的活性[Science，224，1431(1984)]。

此外，在用遗传工程方法生产蛋白质时，常常把所需蛋白质表达为融合蛋白质，例如，把源于其它蛋白质的N-末端肽链加到所需蛋白质的N-末端上来提高所需蛋白质的表达，或者把一个适宜肽链加到所需蛋白的N-或C-末端，表达该蛋白并使用一种对所加肽链具有亲和力的载体来使所需蛋白的纯化变得更加容易。

就决定基因上特定氨基酸的密码子(三联体碱基组合)而言，人们也已知在每种氨基酸上存在1到6种。所以，尽管要取决于氨基酸的序列，但仍会有许多基因编码同一种氨基酸。在自然界中，基因是不稳定的，常常发生核酸的变异。基因上的变异不会影响编码出的氨基酸序列(静止变异)；在这种情况下，人们认为会发生不同基因编码相同氨基酸序列。所以，即使分离出了编码特殊氨基酸序列的基因，随着含有该基因生物体的遗传也会产生编码相同氨基酸序列的不同基因，这种可能性仍是不可避免的。

而且，用各种遗传工程技术人工生产编码相同氨基酸序列的各种遗因并不困难。

例如，编码所需蛋白所用的天然基因上的密码子在用遗传工程生产该蛋白所用的宿主体内的生物利用度很低，有时所表达的蛋白量不足，在这种情况下，通过把该密码子人工转化到另外一个不改变所编码氨基酸序列的高生物利用度的宿主内来提高所需蛋白的表达。当然有可能人工生产出编码特定氨基酸序列的各种基因。所以只要能够编码本文所公开的氨基酸序列，这类人工生产的不同多聚核苷酸就包括在本发明的范围内。

另一方面，无论从天然来源分离的或者人工生产的，所需蛋白的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基发生至少一种变化如缺失，加入，插入或者替换所得到的多肽，它一般具有功能上等同于所需蛋白的活性；编码该多肽的基因也包括在本发明的范围内。

一般，在编码它们的基因方面，功能等同变异体常常彼此相似。因此，能够杂交到本发明的基因上，并且能够编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽的基因也包括在本发明的范围内。

下文以源于链霉菌属SP142的乳-N-乙糖苷酶作为参考来详细描述本发明。

菌株链霉菌sp142已以FERM BP-4569的保藏号保藏于国际贸易和工业部，工业科学技术署，国家生物科学和人体科学技术研究所。

1)首先，按照美国国家科学院学报(the Proceedings ofthe National Academy of Science of the USA，89，8512-8516(1992)]中所描述的方法培养链霉菌sp142。然后按照例如在the Journal of Biological Chemistry，268，18560-18566(1993)中所述的方法从培养基中分离并纯化由链霉菌所产生的乳-N-乙糖苷酶。

2)其次，获得有关纯化的乳-N-乙糖苷酶的部分氨基酸序列的信息。用常规方法依据Edman降解法对纯化的乳-N-乙糖苷酶直接进行氨基酸排序(蛋白质顺序仪476A，由Applied Biosystems生产)来测定乳-N-乙糖苷酶的N-末端氨基酸序列中10到20区残基的部分氨基酸序列。或者，用一种高特异性的蛋白水解酶如Achromobacter蛋白酶I或者N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酰基氯甲基酮(-TPCK)-胰蛋白酶作用于纯化的乳-N-乙糖苷酶进行限制性水解，并且用反相HPLC法分离并纯化所得到的肽碎片，这样得到的纯化肽碎片能够有效地进行氨基酸的顺序排列。

3)以这样获得的部分氨基酸序列信息为基础，克隆乳-N-乙糖苷酶的基因。为达到这一目的，使用常用的PCR或杂交方法。

a)以部分氨基酸序列信息为基础，设计用作Southern杂交探针的合成寡核苷酸。

b)分别用适宜的限制性内切酶完全消化链霉菌sp142的基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳，用常规方法把所得到的片段印迹在尼龙膜上。

c)在常用条件下把所分离出的DNA片断与合成的寡核苷酸进行杂交，其中合成的寡核苷酸是以部分氨基酸序列信息为基础设计的。例如在含有鲑精液DNA的预杂交溶液中阻遏尼龙膜，并加入分别用32P-标记的合成寡核苷酸，然后孵育一夜。洗涤该尼龙膜后，拍摄放射自显影照片来测定杂交到合成寡核苷酸探针上的DNA片段。从凝胶中提取并纯化相应于测定谱带上的DNA片段。

d)把这样得到的杂交到合成寡核苷酸探针上的DNA片段以常用方法插入到一种质粒载体中。适用的质粒载体包括(但不限定为)pUC18，pUC19，pUC119和pTV118N

e)然后把重组质粒导入到一种宿主来转化该宿主。当宿主是大肠杆菌时，只要菌株能够转化，它可以是野生菌株或变异菌株。用常用方法如在分子克隆实验室手册[the Molecular cloning，ALaboratory Manual(T.Maniatis等，Cold SpringHarborLaboratory Press，1982)]的第250页中所述的方法能够实现该质粒的导入。

f)接着，筛选含有所需DNA片段的转化体。

为了这一目的，利用该质粒载体的特性。例如，当质粒载体为pUC19时，通过在含氨苄青霉素的平皿上筛选氨苄青霉素抗性菌落，或者在含有氨苄青霉素，5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(X-Gal)和异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)的平皿上筛选氨苄青霉素抗性白色菌落，来筛选具有导入外部基因的菌落。

g)然后从上述种群中选出具有含所需DNA片段的载体的菌落。通过按照载体类型适当选择的菌落杂交法或噬菌斑杂交法完成这种筛选。

h)一旦挑选出含有所需DNA片段的载体，就用一种普通方法如双脱氧链终止法[Proceeding of the National AcademyofSciences of the USA，74，5463(1977)]测定这种载体中插入的所需DNA片段的碱基序列。把这样测定的碱基与乳-N-乙糖苷酶的N-末端序列、部分氨基酸序列、分子量等进行比较来测定该碱基序列是否表示所需乳-N-乙糖苷酶的全部或部分基因。从这样所得到的含有该乳-N-乙糖苷酶基因的DNA片段中测定乳-N-乙糖苷酶基因的结构和乳-N-乙糖苷酶氨基酸的全部序列。

i)当含有所需DNA片段的载体没有含乳-N-乙糖苷酶全部长度的基因时，用其它限制性酶消化链霉菌sp142的基因DNA，通过用上述所得到的部分DNA片段作探针来杂交等方法从该消化液中得到所缺的部分，然后连接所缺的部分得到所需乳-N-乙糖苷酶的全部长度的基因。

为了克隆源于链霉菌sp142的乳-N-乙糖苷酶基因，进行了下列各种方法，但都无法克隆该基因。

1)使用DNA盒的PCR法

这种方法代表了扩增所需DNA片段的一种方法。其中用合适的限制性酶消化基因组DNA(通过常规方法从链霉菌sp142中提取的)，然后连接DNA基因盒，制备一种模板，在该模板存在下，使用一种通过常规方法根据部分氨基酸序列信息而设计的合成寡聚核苷酸引物，和另一种与具有已知序列的合成DNA(DNA基因盒)互补的合成寡聚核苷酸引物(盒式引物)一起进行PCR反应。

这种盒式DNA或盒式引物可以是Takara Shuzo Co.，Ltd.的产品，该盒式DNA含有对应于两种盒式引物的序列。人们已知用远离限制性酶位点的引物进行第一次PCR反应，用部分第一次PCR反应的混合物作模板，用限制性酶位点附近的引物进行第二次PCR反应来有效扩增所需DNA片段。本发明人试图用这种方法得到本发明的基因。首先，在LN-N2(SEQ ID NO：3)的N-末端序列的基础上合成寡核苷酸引物LN-PN2-1(SEQ ID NO：4)和LN-PN2-2(SEQ ID NO：5)。用限制性酶Sau 3AI，BmaHI，PstI和SaII消化用一种常规方法从链霉菌spl42中提取的基因DNA，然后连接相应的盒式DNA(由Takara Shuzo生产的)。以这些连接产物作模板，用LN-PN2-1与C1引物(由Takara Shuzo生产的)的混合物进行PCR反应。按照“PCR Technology”，ed.Erlich，HA，Stockton Press，1989中所述的方法，使用例如由Perkin-Elmor-Cetus仪器生产的基因腺苷酸试剂盒(Gene Amp Reagent Kit)进行PCR。反应30个循环，每个热循环是94℃×30秒，55℃×2分钟和72℃×2分钟。用该反应的部分混合物在上述相同条件下与LN-PN2-2和C2引物(由Takara Shuzo生产的)的混合物进行又一次PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳法分析该反应混合物，并且用一种常用方法测定扩增DNA片段的碱基序列，但除了合成DNAs的序列外，测定不出可能表示所需基因的序列。2)使用盒式DNA PCR方法(2′-脱氧-7-脱氮鸟嘌呤核苷三磷酸(dC⁷GTP)的途径。

以上述1)中所用的那些作模板，用LN-PN2-1和C1引物(由Takara Shuzo生产的)混合物进行PCR反应。用基因腺苷酸试剂盒(Gene Amp Reagent Kif)和替换dNTP混合物的dATP，dCTP，dTTP，dGTP和dc⁷GTP的混合物进行PCR，重复25次94℃×30秒，55℃×2分钟和72℃×3分钟的热循环。用该反应的部分混合物作模板，除了把普通dNTP混合物用作底物外，在上述相同热条件下与LN-PN2-2和C2引物(由Takara Shuzo生产的)混合物以相同循环进行PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳分析该反应混合物，并且用一种常用方法测定扩增的DNA片段的碱基序列。但是除了合成DNAs的序列外测定不出可能表达所需基因的序列。3)合成DNA杂交方法

用一种常规方法根据氨基酸序列信息设计一种合成寡核苷酸，并进行杂交方法来测定该所需DNA也是一种普通的操作方法。本发明人试图用这种方法测定本发明的基因。对Southern杂交法来说，可以用合成的寡核苷酸LN-PN2-2(SEQ ID NO：5)和LN-PN2-3(SEQID NO：6)作为探针，二者均是根据N-末端序列LN-N2(SEQ ID NO：3)合成的。用限制性酶BmaHI，PstI，SacI和SalI完全消化链霉菌sp142的基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后用一种常规方法把得到的片断印迹在一种尼龙膜上。在常用条件下进行杂交。具体来说，在60℃种预杂交溶液中阻遏该尼龙膜。这种预杂交溶液含有6X SSC，0.5％SDS，5X Denhardt氏溶液和100μg/ml的鲑精液DNA，并分别加入用³²P-标记的合成寡核苷酸，然后对LN-PN2-2在40℃或者对LN-PN2-3在50℃孵育一夜。在室温下30分钟内用含有0.1％SDS的2X SSC把该尼龙膜冲洗两次后，拍摄放射自显影照片来测定杂质在相应合成寡核苷酸探针上的DNA片段。当使用这两种探针中的任意一个时，每个限制性酶消化液在泳道(lane)上出现许多谱滞。用一种常规方法从该凝胶中提取杂交在这些探针上的DNA片段，并将各个DNA片段插入一种质粒载体中，然后用一种常用方法测定碱基序列。尽管得到一些与该合成DNAs序列同源的序列，但仍没有测出任何可能表达所需基因的序列。

如上所述，从链霉菌sp142的基因DNA克隆本发明的乳-N-乙糖苷酶基因十分困难。因为链霉菌sp142的基因组基因具有较高含量的G＋C，所以它可能有二级结构，这种结构能够干扰聚合酶反应的进行，并能引起非特异性退火，从而可能在PCR方法中扩增非特异性的DNA片段或在杂交方法中增殖非特异性杂种。在考虑了这些事实后，本发明人进行了广泛的研究。并且，首次发现用特殊合成寡核苷酸作为杂交方法的探针能够杂交所需乳-N-乙糖苷酶基因的一部分，其中该特殊合成寡核苷酸是根据乳-N-乙糖苷酶的一个内部部分氨基酸序列设计并合成的。

更具体地说，分别根据部分氨基酸序列LN-7(SEQ ID NO：8)和LN-46(SEQ ID NO：10)合成了合成寡核苷酸LN-P7(SEQ ID NO：11)和LN-PN 46-2(SEQ ID NO：12)，并且用这些合成寡核苷酸作探针进行杂交。

用限制性酶BmaHI，BstI，SacI SaII完全消化链霉菌sp142的基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后用一种常规方法将其印迹在一种尼龙膜上。在常用条件下进行杂交。例如，在65℃一种预杂交溶液中阻遏该尼龙膜，其中的预杂交溶液含有6XSSC，0.5％SDS，5X Denhardt′s溶液和100μg/ml的太平洋鲱精液DZA，分别加入³²P一标记的合成寡核苷酸，然后在65℃孵育一夜。把该尼龙膜在室温下用6X SSC冲洗10分钟，室温下用含0.1％SDS的2XSSC冲洗10分钟，然后在45℃用含0.1％SDS的0.2X SSC冲洗30分钟后，拍摄放射自显影照片来测定杂交到各个合成寡核苷酸探针上的DNA片段。BamHI消化液在相应于大约8kb的位置上，PstI消化液在相应于大约3kb的位置上，SacI消化液在相应于大约7.5kb的位置上以及SaII消化液在相应于大约1.8kb的位置上出现了许多杂交到各个探针上的谱带。用一种常用方法从该凝胶中提取这些DNA序列，并插入一个质粒载体中，然后用一种常用的方法如二脱氧链终止法对碱基测序。测定相应于乳-N-乙糖苷酶部分氨基酸序列的一段序列，并且成功地获得所需乳-N-乙糖苷酶基因的一部分。当然，用这样获得的基因片段作探针进行另一步杂交方法，能够克隆编码乳-N-乙糖苷酶全部长度序列的基因。

测定这样获得的由链霉菌sp142生产的该乳-N-乙糖苷酶基因的全部碱基序列，如SEQ ID NO：2所示，并且决定了由此推论出的全部氨基酸序列，如SEQ ID NO：1所示。应当注意到除了对应于SEQ ID NO：2的碱基序列外，相应于SEQ ID NO：1的许多碱基序列也都包括在本发明的范围内。本发明的基因包括编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽，并且包括一部分显示在SEQ ID NO：1中的氨基酸序列的基因，编码具有乳-N-2糖苷酶活性多肽并且包括一部分显示在SEQ ID NO：2中DNA序列的基因，以及编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽并且能够杂交到这些基因上的基因。

用如上所述测定出全部碱基序列的乳-N-乙糖苷酶全部基因或部分基因作杂交的探针，能够从源于一种非链霉菌sp142生物体的一种基因组DNA或cDNA文库中筛选出能够编码具有乳-N-乙糖革酶活性多肽并且与该乳-N-乙糖苷酶基因高度同源的DNA。如上所述用常用方法进行杂交，并且通过改变洗涤和其它条件能够得到具有不同程度相似性的基因。

为了用杂交法获得编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽或其功能等同变异体的所需基因，可以使用例如下列方法。

首先，用一种常规方法把从所需基因源得到的染色体DNA或者用反转录酶从mRNA制得的cDNA整合到一种质粒或噬菌体载体中，并导入一种宿主中来得到一个基因。然后在平板上培养该基因库；把所得到的菌落或噬菌斑各自转移到一种硝基纤维素或尼龙膜上，并经过变性处理将DNA固定到膜上。在含有用³²P标记的探针或其他探针的溶液中孵育该膜(所用的探针可以是编码SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的任意基因或其一部分，例如，可以使用SEQ IDNO：2中所示的基因或其一部分)，在该膜上的DNA和探针之间形成一种杂种。例如，在65℃一种溶液中把固定在其上DNA的膜与该探针杂交20小时，其中的溶液含有6XSSC，1％月桂基硫酸钠，100μg/ml鲑精液DNA和5X Denhardt溶液(含有牛血清白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll各0.1％)。杂交后，洗掉非特异性吸附的蛋白，然后用放射白显影法等来鉴别与该探针形成杂种的克隆。重复这种步骤直到只有单克隆形成杂种。这样得到的克隆具有插入其中的编码所需蛋白的基因。

然后用例如下列方法测定所得到的基因碱基序列来确认所得到的基因是否与编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽或其功能等同变异体的基因一致。

当重组体是大肠杆菌时，通过在试管等中培养该大肠杆菌，用一种常规方法提取该质粒，用限制性酶消化提取的质粒，分离该插入物，并将其亚克隆到M13噬菌体载体等中，并且双脱氧法测定该碱基，这样能够完成杂交法得到的克隆的碱基测序。当重组体是一种噬菌体时，能够用与上述基本相同的步骤来测定该碱基序列。例如在《分子克隆，一种实验室手册》[MolecularCloning，A Laboratory Manual，T.Maniatis等，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)]中描述了从培养到碱基排序的基本实验技术。

为了鉴定所得到的基因与所需的编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽或其功能等同变异体相同，把所测定的碱基序列与本发明乳-N-乙糖苷酶基因的碱基序列和序列表中SEQ ID NO：1中所示的氨基酸的序列进行比较。

如果所得到的基因不包括编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽或其功能等同变异体的全部区域，从所得到的基因中制备一种合成DNA引物，并用PCR法扩增缺失区域成用所得到的基因片段作探针筛选DNA库或cDNA库的方法，能够测定出杂交到本发明乳-N-乙糖苷酶基因上的编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽及其功能等同变异体的全部区域的碱基序列。

另一方面，从本发明基因的碱基序列中能够设计PCR反应的引物。用这种引物进行PCR反应能够测定与本发明基因高度同源的一个基因片段或者能够得到整个基因。

用本发明的乳-N-乙糖苷酶基因生产具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽，下列方法是有利的。

首先，用一种含有所需乳-N-乙糖苷酶基因的载体转化一种宿主。然后在常用条件下培养这种转化体来生产具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽。这种情况，可能生产出一种内含体形式的多肽。可用的宿主包括微生物，动物细胞和植物细胞。

例如用测定乳-N-乙糖苷酶活性的方法有利于鉴定表达。如上所述，用大肠杆菌细胞提取物作为酶溶液，采用美国国家科学院学报[the Proceedings of the National Academy of Sciencesof thd USA，89，8512-8516(1992)]中所描述的方法能够测定活性。

当所需的乳-N-乙糖苷酶的表达显著时，如果转化体为大肠杆菌，可以通过设定乳-N-乙糖苷酶表达的最佳条件，如培养基的组分，培养基的pH，培养温度，所用诱导物的用量，诱导时间，培养时间等能够有效生产乳-N-乙糖苷酶。

用一种普通方法从转化体培养物中能够纯化乳-N-乙糖苷酶。当培养后转化体，如大肠杆菌，在细胞内富集乳-N-乙糖苷酶时，离心收集转化体细胞，用超声波处理法破碎细胞，并且再进行离心分离等来得到无细胞的提取物，用蛋白纯化的一般方法，如盐析和各种层析法，包括离子交换，凝胶过滤，疏水和亲和层析法，能够将其纯化。根据所用宿主—载体体系的不同，转化体能够在细胞外分泌表达产物；在这种情况下，用如上所述的相同方法从培养物的上清液中能够纯化该产物。

当转化体在细胞内生产乳-N-乙糖苷酶时，细胞内也存在着各种酶，但是乳-N-乙糖苷酶的纯化是非常容易的，这是因为与乳-N-乙糖苷酶的含量相比这些酶是以微量存在的。当在细胞外分泌乳-N-乙糖苷酶时，也存在培养基的组分等等。尽管如此，这些共同存在的物质一般几乎不含干扰乳-N-乙糖苷酶纯化的蛋白质成分；这种方法的优点是不需要那些从链霉菌sp142培养物(含有2-1，3/4-岩藻糖苷酶，β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶等，这些很难与乳-N-乙糖苷酶分离)纯化乳-N-乙糖苷酶的艰苦分离操作[Journalof Biological Chemistry，257，8205-8210(1982)]。

当宿主是大肠杆菌时，有时形成一种不溶的内含体式的表达产物。在这种情况下，在培养后用离心法收集细胞，用超声波处理法等破碎这些细胞，然后进行离心分离等来分离出含有内含体的不溶部分。把该内含体冲洗后，用一种常用的蛋白质增溶剂，如脲或盐酸胍，增溶该内含体，然后用各种色谱法如离子交换，凝胶过滤，疏水和亲和层析法纯化，如果需要的话，通过透析或稀释进行再折迭(refolding)处理，从而得到保留乳-N-乙糖苷酶活性的所需多肽。用各种色谱法可以纯化这种标准制品，从而得到高纯度具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽。

如上所述，本发明提供了源于链霉菌sp142的乳-N-乙糖苷酶的初级结构，以及它的基因结构。本发明基因结构的阐明使生物技术生产具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽成为可能。使用重组DNA技术的本发明方法，能够低成本地生产高纯度的具有乳-N-2糖苷酶活性的多肽。

实施例

下列实施例详细阐明了本发明而不是对本发明的任何方面加以限定。实施例1：乳-N-乙糖苷酶构件基因的克隆(1)基因组DNA的提取和纯化

把链霉菌sp142(FERM BP-4569)菌株，一种乳-N-乙糖苷酶生产菌株，接种到20ml的一种培养基上，并在30℃培养44小时，其中的培养基是由1％ L-岩藻糖，0.01％酵母提取物，0.03％胨，0.05％Mg SO₄·7H₂O和0.1％KH₂PO₄组成，PH为7.8。培养后，离心分离该培养基的肉汤来收集细胞，然后将其浸泡在液氮中，并在研缸中完全研碎。把研碎的细胞在轻轻搅拌下一点一点地加到10倍体积(相对于湿细胞体积)的提取缓冲液中[10mM Tris-HCl(pH8.0)，100mMEDTA，2μg/ml RNase A，0.5％SDS]；然后加入100μl10mg/ml的蛋白酶K，在37℃下孵育1小时。使该混合物冷却到室温后，加入等体积的苯酚和氯仿1∶1的混合物，该混合物已用TE缓冲液[10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0]饱和过，然后轻轻搅拌。把该混合物在3,000rpm下离心10分钟后，回收上清液(本文以下称之为苯酚提取物)。把这个步骤重复循环2次；向水层中加入0.6倍体积的异丙醇，然后在14,000rpm下离心1分钟，之后用70％的乙醇漂洗该混合物，并在空气中渐渐干燥。这样得到了大约440μg的基因组DNA。(2)乳-N-乙糖苷酶的部分氨基酸序列的测定

把用生物化学杂志[the Journal of Biological Chemistry，268，18560-15866(1993)]中描述的方法纯化的链霉菌sp142乳-N-乙糖苷酶用气相Edman降解常规方法直接进行氨基酸排序(蛋白质顺序仪476A，由Applied Biosystems生产的)来测定N-末端氨基酸序列LN-N2(SEQ ID NO：3)。在吡啶乙基化后[把1nmol乳-N-乙糖革酶蛋白加到一只脱盐柱上(快速脱盐柱PC3.2/10，Pharmacia)，该柱提前用450mM N-乙基吗啉/甲酸盐缓冲液(pH8.5)平衡过，然后用相同的缓冲液洗脱；用一管形玻璃瓶收集所得到的洗脱液并将其浓缩至干；分别把10μl吡啶，2μl的4-乙烯吡啶，2μl的三-N-丁基膦和10μl水加到一只直径大于管形玻璃瓶的玻璃试管中；把含有样品的管形玻璃瓶放在这种玻璃试管中；密封该玻璃试管后，在100℃反应5分钟；反应结束后，从试管中拿出管形玻璃瓶并将其彻底干燥；把这样得到的吡啶乙基化产物用于胰蛋白酶的消化]，用TPCK胰蛋白酶消化该酶蛋白[把40μl含4M脲的10mATris-HCl缓冲液(pH7.5)，50μl10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，10μl0.1m氯化钙和2pmol的TPCK胰蛋白酶加到该管形玻璃瓶中，然后在37℃反应过液]；从所得到的消化液中分离肽片段，并用HPLC纯化(Smart System，由Pharmacia生产；柱，mRPC C2/C18，SC2.1/10；流速1ml/分钟；洗脱液A，0％三氟乙酸溶液；洗脱液B，含0.1％三氟乙酸的乙腈；加样时洗脱液B为0％到加样完时洗脱液B为10％的密度梯度进行洗脱，之后把洗脱液B的浓度在85分钟期间内增加到60％)。把各自肽片段进行氨基酸测序来测定出部分氨基酸序列LN-6(SEQ ID NO：7)，LN-7(SEQ IDNO：8)，LN-29(SEQ ID NO：9)和LN-46(SEQ ID NO：10)。(3)克隆含有乳-N-乙糖苷酶基因的DNA片段

用限制性酶BamHI，PstI，SacI和SalI，各120U的用量在37℃把上述(1)中制得的50毫克基因组DNA消化2小时，随后每种酶又加60U，反应4小时。把这种反应混合物进行苯酚提取；把相当于10mgDNA的一部分所得到的提取物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，然后通过Southern印迹分析(参见I denshi Kenkyuho II，pp.218-221，Tokyo Kagaku Dojin)把DNA转换到一种Amersham公司的尼龙膜上(商品名Hybond-N+)制备两份这种滤膜。

所用的杂交探针是根据上述(2)中测定的部分氨基酸序列LN-7(SEQ ID NO：8)和LN-46(SEQ ID NO：10)分别合成的合成寡核苷酸LN-P7(SEQ ID NO：11)和LN-P46-2(SEQ ID NO：12)。用MEGALABEL药盒(由Takara Shuzo生产)把5pmol各种合成寡核苷酸用³²p标记。

在含有6XSSC(1XSSC是1000ml水中8.77g NaCl和4.41g枸橼酸钠的溶液)，0.5％SDS，100μm/ml太平洋鲱精液DNA和5XDenhardt′s溶液(含有牛血清白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll各0.1％)的溶液中于65℃把上述制成的一对滤膜进行预杂交3小时，之后加入每种标记的探针到0.5pmol/ml浓度，然后在65℃杂交过夜。把每个滤膜在室温下用6XSSC冲洗10分钟，室温下用2XSSC和0.1％SDS冲洗10分钟，并且在45℃用0.2XSSC和0.1％SDS冲洗30分钟；除去剩余水后，把该滤膜暴光在一种成象板上(由Fuji Photofilm生产的)45分钟，用一台BAS2000成象分析仪(由Fuji Pbotofilm生产)测定。结果，BamHI消化液在相应于大约8kb位置，PstI消化液在大约3kb的位置，SacI消化液在大约7.5kb的位置以及SaII消化液在大约1.8kb的位置上出现了许多杂交在各个相应探针上的谱带。

因为PstI和SalI消化液容易处理，所以用它们进行下列试验。把提前已用限制性酶消化过的10毫克基因组DNA进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，并切割对应于上述杂交反应所得到的谱带的部分。把这部分用一种EASYTRAP试剂盒(由Takara Shazol产生的)提取和纯化；把所得到的DNA片段插入pUc19的PstI或Salz位点。

用这种质粒转化大肠杆菌JM109，并在3只直径为8.5cm的圆形陪氏培养皿上培养过夜,每个培养皿上生成了200到1,000个菌落，然后将这些菌落转移到放在培养基平皿上的一种Amersham公司的尼龙膜上(商品名Hybond-N)。在37℃将其孵育4.5小时后，将该尼龙膜在滤纸上进行变性处理5分钟，其中滤纸已提前在0.5MNaOH和15M NaCl的溶液浸泡过，然后，在另一种滤纸上中和处理5分钟，该滤纸事先已在0.5M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)和3M NaCl的溶液中浸泡过，接着再用2XSSC漂洗，在如上所述的相同条件下用这种尼龙膜和合成寡核苷酸LN-P7(SDQ ID NO：11)进行杂交；得到各培养皿的几个阳性信号，接下来，从原平皿中把阳性信号上及其附近的大肠杆菌细胞转移到一个新平皿中，使其生成菌落，然后重复与上述相同的操作，由此分离出6个具有阳性信号的菌落。这6个菌落中，2个含有PstI片段(命名为P44和P80)，另外4个含有SalI片段(命名为S6，S39，S63和S100)。

用碱溶胞法从上述得到的菌落中制得质粒DNAs，并分别命名为pULNBP44，pULNBP80，pULNBS6，pULNBS39，pULNBS63和pULNBS100。用几种限制性酶消化这些质粒DNAs，并进行电泳来分析这些断裂型。结果发现pULNBP44和pULNBP80总共具有14个限制性酶位点，包括了HincII，KpnI和SalI的位点。也发现pULNBS6，pULNBS39，pULNBS63和pULNBS100具有象HincII，KpnI和SaII那些限制性酶的位点。这种分析证实了质粒pULNBP4与pULNBP80，pULNBS6，pULNBS39，pULNBS63和pULNBS100在DNA插入物方面是相同的，并且PstI片段和SalI片段几乎整个长度相互重叠。从这一结论考虑，主要对pULNBP80进行顺序分析，至于pULNBP80没有覆盖的其它区域，则使用pULNBS6。用适当的限制性酶消化这些克隆，并用一种试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行自身连接，从而得到各种缺失变异体。用双脱氧法进行这些变异体的碱基测序发现一种编码部分乳-N-乙糖苷酶的序列，包括2个克隆的插入物。具体来说，在其中发现了编码部分氨基酸序列LN-7(SEQ ID NO：8)，LN-29(SEQ ID NO：9)和LN-46(SEQ ID NO：10)的碱基序列，但是没有发现编码N-末端氨基酸序列LN-N2(DEQ ID NO：3)或部分氨基酸序列LN-6(SEQ ID NO：7)的碱基序列。(4)克隆含有乳-N-乙糖苷酶酶整个长度基因的DNA片段。

为了筛选编码pULNB80中缺失的N-端附近部分的DNA片段以覆盖乳-N-乙糖苷酶基因的整个长度区域，用与上述(3)中所述的相同方法再进行Southern杂交。

因为碱基测序已经发现pULNBS6含有比pULNBP80中所含的乳-N-乙糖酶基因N-末端附近的DNA序列长大约100bp的序列，所以用大约100bp部分作探针。

具体地说，用PstI和SalI消化pULNBS6，并进行3％琼脂糖凝胶电泳；切割所得到的大约100bp长的DNA片段。用Suprec01(由Takara Shuzo生产)提取并纯化该DNA片段，并用一种MEGALABEL试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行³²P标记。把由与上述(3)中所述相同方法制得的一对滤纸在一种溶液中于68℃进行预杂交3小时，其中所述的溶液含有6XSSC[1XSSC是1L水中8.77gNaCl和4.41g构橼酸钠的溶液]，0.5％SDS，100μg/ml太平洋鲱精液DNA和5XDenhardts溶液(含有牛血清白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll各0.1％)，之后1％0.1pmol/ml的浓度加入每种标记的探针，在68℃杂交过夜。然后把各个滤纸室温下用6XSSC冲洗10分钟，室温下用2XSSC和0.1％SDS冲洗10分钟，以及50℃下用0.2XSSC和0.1％SDS冲洗20小时；除去剩余的水后，把该滤纸暴光于一种成像平片(由Fuji Photofilm生产)45分钟，然后用一台BAS2000成象分析仪(由Fuji Photofilm生产)测定。结果，BamHI消化液在对应于8kb左右，PstI消化液在3kb左右，SacI消化液在7.5kb左右以及SalI消化液在1.8kb左右的位置上出现了杂交在各个相应探针上的许多谱带。因为PstI消化液易于处理，所以用它进行下列试验。

把事先已用与上述(3)中相同的方法用PstI消化的10毫克基因组DNA进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，并切割对应于上述杂交反应所得到的谱带的部分。用一种EASYTRAP试剂盒(由Takara Shuzo生产)提取和纯化这一部分；把所得到的DNA片段插入到pUC19的PstI位点。

用这种质粒转化大肠杆菌JM109，并在3个直径为8.5cm的圆开陪氏培养皿上培养过夜，从而在每个培养皿中生成了200到1,000个菌落，然后将这些菌落转移到放在一个培养基平皿中的尼龙膜(Amersham Corporation出品，商品名为Hybond-N)上。在37℃孵育该尼龙膜4.5小时后，将其在事先已于0.5mNaOH和1.5M NaCl溶液中浸泡过的滤纸上进行5分钟的变性处理，然后在事先于0.5MTris-HCl缓冲液(pH7.0)和3M NaCl的溶液中浸泡过的滤纸上进行5分钟的中和处理，接着用2XSSC漂洗。在与上述相同条件下用这种尼龙膜和大约100bp的pULNBS6的PstI-SalI DNA片段进行杂交；每个平皿中都得到了几个阳性信号。接下来，把该阳性信号上和附近的大肠杆菌细胞从原始平皿转移到一个新平皿上，并使其生成菌落，然后重复与上述相同的步骤，由此分离出了6个具有阳性信号的菌落(命令为P2-17，P2-37，P2-47，P2-67，P2-77和P2-87)。

用碱溶胞法从这样得到的菌落中制备质粒DNAs，并分别命令为pULNBP2-17，pULNBP2-37，pULNBP2-47，pULNBP2-67，pULNBP2-77和pULNBP2-87。把这些质粒DNAs用几种限制性酶进行消化，并进行电泳来分析这些分裂型。结果发现这些质粒的PstI插入物总共具有15个限制性酶的位点，包括了HincII，SacI，SalI，SmaI和XhoI的位点。还发现pULNBP2-17，pULNBP2-37，pULNBP2-67和pULNBP2-87具有分别与pULNBP2-47，pULNBP2-67和pULNBP2-77完全相同限制性酶断裂型，但是PstI片段插入的方位是相反的。这些发现表明前者基因片段与后者相同。因此只对pULNBP2-17进行下列分析。

用适当的限制性酶消化pULNB-P17或从两端消化pULNBP2-17；然后用一种连接试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行自身连接来获得各种缺失变异体。用双脱氧法进行这些变异体的碱基测序发现在pULNBS6的PstI和SalI位点之间存在大约100bp的碱基序列，并且还存在编码N-末端氨基酸序列LN-N2(SEQ ID NO：3)和部分氨基酸序列LN-6(SEQ ID NO：7)的碱基序列。而且，在上述(3)中测定的pULNBP80的PstI插入物和pULNBP2-17的PstI插入物之间发现一段1920bp的解读框架。在这些解读框架中发现了上述(2)乳-N-乙糖苷酶的氨基酸排序中测定的全部碱基序列。在图1中给出了结果，图1表示乳-N-乙糖苷酶基因位置的限制性酶基因图谱，其中用A表示pULNBP80的PstI插入物中PstI-kpnI区域，用B表示pULNBP2-17的PstI插入物中MluI-PstI区域，图1中箭头表示乳-N-乙糖苷酶的翻译起点；粗线表示编码乳-N-乙糖苷酶的区域。结合“A”和“B”，能够知道乳-N-乙糖苷酶的全部长度的基因。在SEQ ID NO：2中显示了编码乳-N-乙糖苷酶的碱基序列的一个例子；SEQ ID NO：1中显示了这种碱基序列编码的氨基酸序列。实施例2：构建乳-N-乙糖苷酶表达质粒(1)含有全部长度的乳-N-乙糖苷酶基因质粒的构建

为了构建含有全部长度的孔-N-乙糖苷酶基因，用PstI消化实施例1中所得到的质粒pULNBP2-17，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳；切割PstI片段并将其提取纯化，接下来，用KpnI消化实施例1中所得到的质粒pULNBP80，并用一种连接试剂盒(由Takara Shuzo生产)进行自身连接，然后转化到大肠杆菌JM109菌株中。用碱性溶胞法从该细胞培养物中制备质粒DNA pULNBP80kpn。用PstI消化这种DNA 。把从质粒pULNBP2-17中得到的PstI片段插入所得到的PstI消化液中，然后转化到大肠杆菌JM109菌株中。用碱性SDS法从该细胞培养物中分离出质粒DNA；用PstI消化液确定该插入物的存在，并用SacI消化液确定该插入物的位置。把这样得到的含有全部长度乳-N-乙糖苷酶基因的质粒命名为pLNBP-K。

把整合上pLNBP-K的大肠杆菌JM109称作大肠杆菌JM109/pLNBP-K，并且已经以保藏号FERM BP-5333保藏于国际贸易和工业部，工业科学技术署，国家生物科学和人体科学技术研究所。(2)构建乳-N-乙糖苷酶表达质粒

接着，为构建乳N-乙糖苷酶的一种表达粒，设计并合成合成寡核苷酸引物LNBP-M(SEQ ID NO：13)和LNB-SRV(SEQ ID NO：14)。引物LNBP-M是一个39聚合体，它在5′-3′方向对应于SEQ ID NO：2的106-129位碱基序列的24聚合体的上游具有一个Hind III位点和NCoI位点，而引物LNB-SRV是一个在3-5′方向对应于SEQ ID NO：2的301-321位置的碱基序列的21聚体合成DNA。

把大约10ng的实施例1中所得到的质粒pULNBP2-17MluE作模板(pULNB2-17MluE是用MluI和EcoRI消化实施例1的质粒pULNB2-17，使两端变钝并进行自身连结得到的)，与10μl10倍稀释的缓冲液(Gene Amp试剂盒中提供的)，16μl1.25mMdNTP混合物，20pmol引物LNBP-M，20pmol引物LNB-SRV和2.5U的Takarataq混合，然后加无菌水得到100μl的溶液。用一种自动基因扩增仪(DNA热循环仪480，由Takara Shuzo生产)使混合液进行一种扩增反应。重复94℃变性处理1分钟，60℃引物退火2分钟和72℃合成1.5分钟的循环25次进行PCR反应。把10μl反应混合物进行3％琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭给DNA染色；如同所预料的测定出扩增的231bp DNA片段。用乙醇沉淀法浓缩剩余部分PCR反应混合物，之后用HindIII和SmaI消化它，然后插入到实施例2-(1)中所得到的质粒pLNBP-K的HindIII-SmaI位点，接着转化到大肠杆菌JM109菌株中。用碱性SDS法从该细胞的培养物中分离出质粒DNA；用HindIII和SmaI消化液鉴定插入物的存在，用双脱氧法鉴定插入物的碱基序列。把这样得到的乳-N-乙糖苷醇表达质粒命名为pLNBM。

把这样得到的大肠杆菌JM109/pLNBM接种到每升培养基含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml培养基上，并在37℃进行振荡培养；达到混浊度O.D.600＝0.5时，加入IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷)到最终浓度为1mM，然后在37℃振摇培养过夜。培养后，离心分离1ml培养液；用50mM磷酸钾缓冲液pH6.0洗涤收集的细胞。然后用0.5ml的相同缓冲液悬浮这些细胞并用超声波处理法破碎。离心分离后，回收上清液得到大肠杆菌提取物。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析该提取物和沉淀物，没有测出相应于乳-N-乙糖苷酶的谱带；用美国国家科学院学报[the Proceedings of theNational Academy of Sciences of the USA，89，8512-8516(1992)]所述的方法测定该提取物的活性，但没有测出乳-N-乙糖苷酶活性。

曾试图构建其它表达质粒。用KpnI消化质粒pLNBM后，使其端变钝，然后再用HindIII消化并接着进行1％琼脂糖凝胶的电泳；切割HindIII-KpnI片段并将其提取纯化。在pET23d(由Novagen生产)之后，用NotI消化整合有T7启动子的表达载体，使其两端变钝，然后再用HindIII消化。把质粒pLNBM的Hind III-KpnI片段插入到所得到的消化液中，然后转化到大肠杆菌HB101菌株中(由TakaraShuzo生产)。用碱性SDS法从这种细胞培养基中分离出质粒DNA；用HindIIIt XhoI消化液鉴定插入物的存在，并用双脱氧法鉴定该插入物的碱基序列。把这样获得的乳-N-乙糖苷酶表达质粒命名为pELNB101 。

把这样获得的质粒pELNB101转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。把所得到的大肠杆菌BL21(DE3)/pELNB101接种到5ml的每升含有100μg/ml氨苄青霉素的培养基中，并在37℃进行振摇培养；一旦浊度达到O.D.600＝0.5，就加入IPTG到最终浓度为1mM，然后在37℃振摇培养一夜。培养后，离心分离1ml该培养液；收集细胞并用50mM的pH6.0磷酸盐缓冲液冲洗。然后把这些细胞悬浮于0.5ml的同一缓冲液，并用超声波处理法破碎。离心分离后，回收上清液得到大肠杆菌提取物。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析这种提取物和沉淀物测得了可确定分子量为60,000的乳-N-乙糖苷酶的谱带；在这种提取物中也测得了乳-N-乙糖苷酶活性。这些发现证实了大肠杆菌BL21(DE3)/pELNB101能够表达乳-N-乙糖苷酶蛋白。

有这样一种可能性，即由大肠杆菌BL21(DE3)/pELNB101生产的乳-N-乙糖苷酶大多数是一种不溶性内含体形式。(3)大肠杆菌中乳-N-乙糖苷酶的表达和内含体的纯化

把大肠杆菌BL21(DE3)/pELNB101接种到各装有5ml的每升含有100μg/ml氨苄青霉素的培养基的2只试管中，并在37℃振荡培养5小时；把5ml的这种细胞培养物接种到2只各含500ml2XYT培养基的2,000ml圆锥瓶，并且在37℃和100rpm旋转振摇培养过夜。培养后，用离心分离法收集细胞，并将该细胞悬浮于25ml含有01m.NaCl和1mMEDTA的10nMris-HCl缓冲液(STE)，并用超声波处理法破碎。离心分离破碎细胞悬浮液后，收集含有内含体的不溶部分，用30ml STE冲洗，并且离心分离；把所得到的沉淀物悬浮于30ml的1M蔗糖溶液。在18,000×g把所得到的悬浮液离心30分钟得到含有内含体的沉淀物。把该沉淀物悬浮于40ml含有10mMEDTA的2％TritonX-100溶液，并在40℃保留过夜。用离心分离法收集不溶物质，重复与上述相同的步骤来冲洗该内含体。这样得到的内含体的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证实多半蛋白移动到了相应于60,000左右分子量的位置，这表明所得到的内含体部分的多半蛋白是重组体乳-N-乙糖苷酶。如与同时分析的牛血清白蛋白的谱带密度相比所估计的，这种重组体乳-N-乙糖苷酶蛋白的量被估计为每100ml培养液中大约10mg。(4)内含体的增溶及其蛋白质的再折叠

把所得到的内含体10mg左右(相当于100ml培养液)悬浮于3ml含有8M脲，10mM二硫苏糖醇和0.5MKCl的一种20mM醋酸钾缓冲液(pH5.5)，并在室温下搅拌溶解1小时。用离心分离法除去残余的不溶物后，用5ml20mM醋酸钾缓冲液(pH5.5)稀释50μl的上清液，并在15℃保留过夜。(5)乳-N-乙糖苷酶活性的测定

按照文献[Proceeding of the National Academy ofSciences of the USA,89,8512-8516(1992)]中所述的方法用所得到的溶液测定乳-N-乙糖苷酶活性。

具体来说，在37℃把该酶的样品溶液与2μmPA-乳-N-四糖(Galβ1-3Glc NAcβ1-3Galβ1-4Glc-PA；由Takara Shuzo生产；下文称作PA-寡糖)在10μl的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)中孵育20分钟。然后，把40μl的1％三氟乙酸加到该反应混合物中中止反应。

用一只氨基-硅胶柱或一只C₁₈-硅胶柱进行HPLC分析一份含10pmol PA-寡糖溶液，并用荧光测定有标记的产物。

通过该底物与此产物的峰区和与相应标准PA-寡糖的峰区比较计算水解程度。

把一个单位的活性定义为在上述条件下每分钟释放1μmol产物所需的酶量。

分析结果发现该溶液的乳-N-乙糖苷酶活性为0.06mu/ml。这是指从1L含有本发明基因的大肠杆菌(BLZ1(DE3)/pEL NB101的培养液中得到大约180mU的重组体乳-N-乙糖苷酶。

对本领域熟练技术人员显而易见的本发明上述实施例的其它改进都将包括在权利要求的范围内。

序列表(1)一般资料：(iii)序列数：14(2)SEQ ID N0：1的资料：(i)序列特征：

(A)长度：639个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：1Met Asp Met Arg Met Ala Arg Arg Arg Thr Ile Gly Ala Val Val1 5 10 15Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Leu Pro Trp Gln Ser Ala Thr Ala

20 25 30Glu Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Pro Pro Glu Val Leu Pro Thr

35 40 45Leu Arg Glu Trp Gln Gly Gly Gln Gly Glu Phe Thr Leu Thr Asp

50 55 60Arg Ala Gly Ile Val Leu Asp Gly Val Arg Asp Ser Arg Thr Ala

65 70 75Ala Asp Ala Arg Arg Phe Ala Gly Glu Leu Asn Gly Lys Ala Ser

80 85 90Val Ser Gln Gly Arg Ala Ala Arg Pro Gly Asp Ile Val Leu Arg

95 100 105Gln Asp Pro Ala Gln Lys Gly Leu Leu Gly Ala Glu Gly Tyr Arg

110 115 120Leu Thr Val Gly Thr Arg Ile Thr Val Thr Ala Ala Thr Ser Thr

125 130 135Gly Val Phe Tyr Gly Thr Arg Thr Val Leu Gln Leu Leu Asn Asp

140 145 150Asp Gly Arg Ala Ala Arg Gly Ser Ala Thr Asp Val Pro Ala Tyr

155 160 165Arg Glu Arg Gly Val Gly Val Cys Ala Cys Tyr Ile Asn Ile Ser

170 175 180Thr Gln Trp Phe Glu Arg Leu Met Lys Asp Met Ala Ser Gln Lys

185 190 195Leu Asn Gln Leu Trp Ile Glu Ala Lys Val Lys Ser Asp Thr Asp

200 205 210Pro Ala Ser Ala Phe Trp Gly Tyr Tyr Thr Lys Pro Gln Val Arg

215 220 225Thr Leu Val Ala Met Ala Arg Lys Tyr His Ile Glu Leu Val Pro

230 235 240Glu Ile Asn Ser Pro Gly His Met Asp Thr Tyr Leu Glu Asn His

245 250 255Pro Glu Leu Gln Leu Lys Asp Arg Asp Gly Val Ala Ser Pro Pro

260 265 270Arg Leu Asp Ile Ser Arg Pro Glu Ala Leu Ala Tyr Tyr Thr Ser

275 280 285Met Val Asp Glu Ala Leu Lys Val Trp Asp Ser Arg Tyr Trp His

290 295 300Met Gly Ala Asp Glu Tyr Met Ile Gly Ser Ser Tyr Pro Asp Tyr

305 310 315Pro Gln Leu Gln Ala Ala Ala Arg Ala Lys Phe Gly Ala Ser Ala

320 325 330Thr Pro Asp Asp Leu Phe Thr Asp Phe Ile Asn Gln Val Asn Ala

335 340 345His Val Lys Ala Asp Gly Arg Ser Leu Arg Ile Trp Asn Asp Gly

350 355 360Leu Ala Gly Lys Asn Ala Val Val Pro Leu Asp Arg Asp Ile Thr

365 370 375Val Glu His Trp Leu Ser Gly Gly Ser Ile Gln Gln Pro Ser Ser

380 385 390Leu Leu Ala Glu Gly Arg Pro Val Met Asn Ser Ala Tyr Ser Leu

395 400 405Tyr Leu Val Arg Gly Gly Phe Thr Met Gln Thr Gln Lys Leu Tyr

410 415 420Glu Ser Asp Trp Thr Pro Leu Arg Phe Glu Gly Gln Thr Leu Thr

425 430 435Gln Gly Ala Ala Asn Leu Thr Gly Ala Lys Ile Ser Leu Trp Pro

440 445 450Asp Ser Ala Ala Ala Glu Thr Glu Asn Glu Val Glu Thr Lys Val

455 460 465Phe Met Pro Leu Arg Phe Val Ala Gln Ala Thr Trp Gly Gly Pro

470 475 480Lys Pro Ser Pro Thr Tyr Ala Gly Phe Glu Ala Leu Ala Arg Lys

485 490 495Ile Gly His Ala Pro Gly Trp Glu Asn Thr Asp Arg Thr Pro Leu

500 505 510

Ala Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Thr Thr Gly Ala Lys Ala Leu Ala

515 520 525Pro Thr Ala Asp Ala Gly Val Ser Leu Val Lys Asn Ser Ala Ala

530 535 540Ser Trp Ala Leu Thr Ala Thr Ala Asp Gly Tyr Tyr Thr Val Arg

545 550 555Ser Thr Glu Ser Gly Gln Cys Leu Asp Ala Val Arg Gly Lys Lys

560 565 570Tyr Leu Gly Ala Pro Leu Glu Val Gly Ala Glu Leu Ser Leu Ala

575 580 585Asn Cys Ser Thr Thr Ala Arg Thr Gln Arg Trp Gln Leu Asp Thr

590 595 600Gly Ala Gly Ala Leu Thr Leu Arg Asn Ala Ile Ser Gln Leu His

605 610 615Leu Thr Glu Arg Ala Ser Asp Gly Ala Ala Val Gln Thr Thr Gly

620 625 630Ala Thr Arg Leu Thr Ala Arg Ala Ala

635(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征：

(A)长度：1917个碱基对

(B)类型：核酸

(C)股数：双股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：基因组DNA(vi)来源：

(A)微生物：链霉菌属

(B)菌株：142(ix)特点：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..1917

(C)识别法：E(xi)序列描述：SEQ ID NO：2ATGGACATGC GGATGGCAAG ACGAAGGACC ATCGGAGCCG TGGTGACGGC GCTCGCCGCC 60GCGCTGCTGC CCTGGCAGAG CGCGACGGCC GAGGGCGGCT CGGCCGCCGC GGCCCCGCCC 120GAGGTGCTGC CCACGCTCCG CGAATGGCAA GGCGGTCAGG GCGAGTTCAC GCTCACCGAT 180CGGGCCGGAA TCGTGCTGGA CGGGGTGCGG GACAGTCGTA CGGCCGCCGA CGCACGCCGA 240TTCGCCGGCG AACTGAACGG CAAGGCGTCG GTGTCACAGG GCCGCGCGGC CCGTCCCGGG 300GACATCGTGC TGCGCCAGGA CCCGGCCCAG AAGGGTCTGT TGGGCGCGGA AGGCTACCGG 360CTCACGGTCG GCACCCGTAT CACTGTCACC GCCGCGACCT CCACCGGCGT GTTCTACGGC 420ACCCGGACCG TCCTCCAGCT GCTGAACGAC GACGGCCGCG CCGCGCGGGG TTCGGCGACC 480GACGTACCCG CGTACCGCGA GCGCGGAGTC GGGGTCTGCG CCTGCTACAT CAACATATCG 540ACACAGTGGT TCGAGCGGCT GATGAAGGAC ATGGCGTCGC AGAAGCTCAA CCAGCTGTGG 600ATCGAGGCCA AGGTCAAGAG CGACACCGAC CCGGCTTCGG CGTTCTGGGG CTACTACACC 660AAGCCGCAGG TCCGCACGCT GGTCGCGATG GCCCGGAAGT ACCACATCGA GCTCGTGCCG 720GAGATCAACT CGCCCGGCCA CATGGACACC TACCTGGAGA ACCACCCGGA GCTCCAGCTC 780AAGGACCGGG ACGGTGTCGC CTCCCCGCCC CGGCTCGACA TCTCCCGGCC CGAGGCGCTG 840GCGTACTACA CCTCGATGGT CGACGAGGCG CTGAAGGTCT GGGACAGCCG GTACTGGCAC 900ATGGGCGCCG ACGAGTACAT GATCGGCTCC TCCTACCCGG ACTACCCCCA GCTGCAGGCC 960GCGGCACGCG CGAAGTTCGG TGCGTCGGCG ACCCCCGACG ATCTCTTCAC CGACTTCATC 1020AACCAGGTCA ACGCGCATGT GAAGGCGGAC GGCAGGTCGC TGCGGATCTG GAACGACGGG 1080CTCGCCGGCA AGAACGCCGT TGTCCCGCTG GACCGTGACA TCACCGTCGA GCACTGGCTG 1140AGCGGCGGCT CCATCCAGCA GCCGTCCTCG CTGCTCGCCG AGGGGCGGCC GGTCATGAAC 1200TCCGCCTACT CCCTCTACCT GGTGCGCGGC GGATTCACGA TGCAGACCCA GAAGCTGTAC 1260GAGAGCGACT GGACGCCGTT GCGCTTCGAG GGGCAGACGC TGACCCAGGG GGCGGCGAAC 1320CTCACCGGCG CGAAGATCAG CCTGTGGCCG GACAGTGCGG CGGCCGAGAC GGAGAACGAG 1380GTCGAGACGA AGGTCTTCAT GCCGCTGCGT TTCGTGGCGC AGGCGACCTG GGGCGGCCCG 1440AAGCCGAGCC CGACGTACGC CGGTTTCGAG GCGCTCGCCC GGAAGATCGG TCACGCGCCG 1500GGCTGGGAGA ACACCGACCG CACGCCGCTC GCCGACGGTA CGTACCGGCT GACCACGGGC 1560GCGAAGGCGC TGGCCCCCAC GGCGGACGCG GGCGTGTCCC TGGTCAAGAA CAGCGCGGCC 1620TCCTGGGCGC TGACGGCGAC CGCCGACGGG TACTACACGG TGCGGTCCAC GGAGAGCGGT 1680CAGTGCCTGG ACGCGGTGCG CGGCAAGAAG TACCTGGGCG CGCCGCTGGA GGTGGGGGCG 1740GAGCTGTCAC TCGCGAACTG CTCGACGACG GCACGTACCC AGCGCTGGCA GCTGGACACC 1800GGGGCGGGTG CGCTGACGCT GCGCAACGCG ATCTCGCAGC TGCATCTGAC GGAGCGGGCG 1860TCGGACGGCG CCGCGGTGCA GACGACGGGA GCGACCCGGC TGACGGCGCG CGCCGCC 1917(2)SEQ ID NO：3的资料：(i)序列特征：

(A)长度：18个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：N-末端片段(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Ala Ala Arg Pro His Glu Val Leu Pro Thr Leu Arg Glu Trp1 5 10Gln Gly Gly Thr15(2)SEQID NO：4的资料：(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GCSMGSCCSC AYGARGT 17(2)SEQ ID NO：5的资料：(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CCSCAYGARG TSCWNCC 17(2)SEQ ID NO：6的资料：(i)序列特征：

(A)长度：44个碱基对

(B)类型：核酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GCCGCCCGCC CSCACGARGT CCTSCCSACC CTSGACGAGGCCCA 44(2)SEQ ID NO：7的资料： (i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部片段(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Ala Ala Arg Pro Gly Asp Ile Val Leu Arg1 5 10(2)SEQ ID NO：8的资料：(i)序列特征

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：肽(V)片段类型：内部片段(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Gln Trp Asn Asp Gly Leu Ala Gly Lys1 5(2)SEQ ID NO：9的资料：(i)序列特征：

(A)长度：12个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：中间片段(xi)SEQ ID NO：9：Ser Gln Leu Asp Thr Gly Ala Gly Ala Leu Thr Leu1 5 10(2)SEQ ID NO：10的资料(i)序列特征：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：中间片段(xi)SEQ ID NO：10：Asp Ile Thr Val Glu His Ala Leu Ser Gly Gly Ser Ile Gln1 5 10Gln Pro Ser Ser Leu Leu Ala Glu Gly Pro15 20(2)SEQ ID NO：11的资料：(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：CARTGGAAYG AYGGNYTNGC NGGNAAR 27(2)SEQ ID NO：12的资料(i)序列特征：

(A)长度：72个碱基对

(B)类型：核酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GAYATHACNG TNGARCAYGC NYINWSNGGN GGNWSNATHCARCARCCNWS NWSNYTNYTN 60GCNGARGGNC CN 72(2)SEQ ID NO：13的资料：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：AGAAGCTTGG CCATGGCCGC GGCCCCGCCC GAGGTGCTG.39(2)SEQ ID NO：14的资料(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)股数：单股

(D)拓扑学结构：线性(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：GTCCTGGCGC AGCACGATGT C 21

Claims

1.一种分离的DNA，它含有编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽及其功能等同变异体的序列。

2.根据权利要求1的方离的DNA，其中的多肽源于链霉菌属的菌株。

3.根据权利要求2分离的DNA，其中的多肽源于链霉菌SP142，该菌株保藏于FERM，保藏号BP-4569。

4.根据权利要求1的分离的DNA，其中的多肽具有列于序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

5.根据权利要求4的分离的DNA，其中它具有列于序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列。

6.根据权利要求1的分离的DNA，其中的多肽具有至少一部分列于序列表中的SEQ ID NO：1氨基酸序列，这部分氨基酸序列足以提供具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽或其功能等同变异体。

7.根据权利要求1的分离的DNA，它具有至少一部分列于序列表中的SEQ ID NO：2 DNA序列，这部分DAN序列足以表达具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽及其功能等同的变异体。

8.根据权利要求1的分离的DNA，其中多肽或其功能等同的变异体具有在序列表中列出的SEQ ID NO：1氨基酸序列中删除，增加，插入或取代一个或多个氨基酸所得到的氨基酸序列。

9.一种能够与权利要求1到8中所定义的任何一个分离的DNA杂交的分离DNA，其中分离的DNA能够编码具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽或其功能等同变异体。

10.一种重组DNA，它含有一个编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽或其功能等同变异体的DNA序列。

11.根据权利要求10的重组体DNA，其中的多肽具有序列表中列出的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

12.根据权利要求10的重组体DNA，它包括序列表中列出的SEQ ID NO：2的DNA序列。

13.根据权利要求10的重量组体DNA，其中的多肽具有至少一部分列于序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列，这部分氨基酸序列足以提供具有孔-N-乙糖苷酶活性的多肽。

14.根据权利要求10的重组体DNA，它包括至少一部分列于序列表中的SEQ ID NO：2的DNA序列，这部分DNA序列足以表达具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽。

15.一种表达载体，它含有一种重组DNA，该重组DNA含有编码乳-N-乙糖苷酶活性的多肽或其功能等同变异体的DNA序列，其中该表达载体能够在原核细胞或真核细胞中繁殖。

16.根据权利要求15的表达载体，其中的多肽具有列于序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

17.根据权利要求15的表达载体，它含有列于序列表中的SEQ ID NO：2的DNA序列。

18.根据权利要求15的表达载体，其中的多肽有至少一部分列于序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列，这部分氨基酸序列足以提供具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽。

19.根据权利要求15的表达载体，它含有至少一部分列于序列表中的SEQ ID NO：2的DNA序列，这部分DNA序列足以表达具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽。

20.用一种表达载体转化的原核细胞或真核细胞，其中这种表达载体含有编码具有乳-N-乙糖苷酶活性多肽或其功能等同变异体的DNA序列。

21.根据权利要求20的细胞，其中的多肽具有列于序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

22.根据权利要求20的细胞，其中的表达载体含有列于序列表中SEQ ID NO：2的序列。

23.根据权利要求20的细胞，其中的多肽具有至少一部分列于序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列，这部分氨基酸序列足以提供具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽。

24.根据权利要求20的细胞，其中的表达载体含有至少一部分列于序列表中的SEQ ID NO：2的DNA序列，这部分DNA序列足以表达具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽。

25.一种生产具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽或其功能等同变异体的方法，它含有下列步骤：

(a)培养一种把表达载体导入宿主细胞所得到的转化体，其中该表达载体含有如权利要求1到9中任何一个分离DNA的DNA序列；而且

(b)从步骤(a)中所得到的培养基中分离具有乳-N-乙糖苷酶活性的多肽或其功能等同变异体。