CN1279289A - 人p47蛋白及其编码序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在人体正常肾上腺组织中表达的新的人P47蛋白hP47及其编码序列,本发明还提供了该蛋白和核酸序列的制备方法,以及在样品中检测hP47核酸序列和多肽的方法。

Description

人P47蛋白及其编码序列

本发明涉及分子内分泌学、神经生物学、生殖生物学、肿瘤学和基因工程领域。具体地，本发明涉及一种在人类肾上腺中表达的P47蛋白及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。

无论是外分泌如唾液或胰消化酶原的分泌，还是内分泌过程如儿茶酚氨从肾上腺髓质嗜酪细胞的释放，胰岛素从胰岛β细胞的分泌，催乳素等多肽激素从垂体前叶的释放以及神经递质从神经末稍的释放，它们均涉及一个共同的过程，即可调性胞吐过程，该过程涉及细胞的分泌颗粒包被膜与细胞质膜的搭联及融合。1993年Soller(Soller T et al Nature 1993 362：318-314)等人提出SNARE假说，该假说认为(突触)小泡相关膜蛋白VAMP(Vesicle associated membrane protein)与细胞质突触融合蛋白(syntaxin)及25kD的突触小体相关蛋白SNAP-25(synaptosome-associated protein of 25KD)形成一个蛋白复合，成为胞浆可溶性膜融合蛋白NSF(N-ethylmaleimide sensitivefactor，N-乙基马来酰亚胺敏感因子)和SNAP(soluble NSF attachment protein，可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白)受体(SNARE)。SNAP受体(SNAPreceptor，简称为“SNARE”)蛋白复合物的形成及其与NSF、SNAP的相互作用，直接导致分泌颗粒与细胞质膜的搭联及融合，也即胞吐作用的发生。

众所周知，蛋白质的合成发生在细胞的内质网，而加工和分泌过程则往往通过高尔基体，从横向角度讲，从内质网到高尔基体的运输也是一个泡运输过程，需要内质网的出泡以及泡膜与高尔基体膜的搭联和融合。而从纵向角度讲，细胞的每一次分裂过程中，内质网和高尔基体均形成大量的碎片，以便它们重新分配在两个子细胞中，在子细胞中，这些碎片需要重新聚集形成新的内质网和高尔基体，而碎片膜系统之间的搭联和融合是形成新高尔基体的一个重要环节，在这个环节中，ATP被用来提供能量，分别由ATP酶P97和NSF催化的膜融合细节已基本清楚，即α-SNAP与高尔基体碎片上的syntaxin 5结合后，由NSF催化ATP水解释放能量，导致新的高尔基池形成。目前对P97所催化的融合途径研究不多，实验证实(Kondo H et al nature1998 Vol 388(3)75-78)：在P97融合途径中，P47三聚体和P97六聚体形成一个定量复合物，再与syntaxin 5结合而导致融合事件的发生从而形成新的高尔基体。在缺乏P47的细胞内，P97不能与syntaxin 5结合也不能发生由P97介导的高尔基池再生，说明P47在细胞分裂后高尔基体再生过程中起重要作用，也对随后由高尔基体发生的胞吐作用发生重要的影响。

虽然NSF途径和P97途径都能介导高尔基池的再生，但两者功能并不一致。NSF存在于高尔基池的周边，而P97则主要存在于高尔基池的内核。目前认为NSF途径主要控制高尔基池内外货物的流动，而P97途径则与高尔基体的形态发生有关。两条途径存在着一定的竞争关系，其比率取决于细胞类型，一种极端类型是在高度分化的分泌细胞内存在着较高的物质流动，但仅存在较少的细胞器生成，另一类则是处于迅速分裂的肿瘤细胞，其内具有较低的物质流动但却有较多的细胞器生成。通过控制P47的量，可以调整这两条途径的相对比例，从而控制分泌细胞的分泌以及肿瘤细胞的恶性分裂，因此P47可以作为治疗肿瘤和内分泌相关疾病的靶基因。

从内质网到高尔基体的转运以及高尔基体的再生是胞吐作用的生物学基础，胞吐作用是生物体内的普遍现象，具有重要的生物学意义。

神经信号传输：神经信号的传递有赖于神经递质的释放，而神经递质的释放是通过胞吐作用进行的(Jacobsson G et al Endocrinology 1996 137(2)5344-56．实验证实，在老年痴呆症的神经衰老斑中一些控制胞吐作用和神经传输的蛋白是缺乏的(Ferrer I et al J．Neuropathol．Exp．Neurol．1998 57(3)218-25．)一些神经毒素如破伤风毒素(TeT)，肉毒毒素(BoT)A，B，Cl，D，E，F，G是Zn²⁺依赖性蛋白水解酶，它们特异的神经毒性是因为其对胞吐蛋白复合体中SNARE的水解而阻断了乙酰胆碱(指BoT)或抑制性神经递质(指TeT)的释放，这些多肽内切酶有高度特异性，对SNARE复合体的不同部分具有不同的亲和力(Hunter WB Nature 1993 365：104-105)．

组织分泌：体内存在着很多分泌酰，它们均与胞吐作用有关，胰岛素的释放是一个重要的例子，已经证实其胞吐作用依赖于葡萄糖的浓度(Martin F et al Biochem．Biophys．Res．Commun 1998 248：83-6，Jacobsson G et al PNAS USA 1994 91：12487-91)．同样胞吐作用也存在于胃酸分泌的细胞(Zhao CM Cell Tissue Res．1997 290：539-51)以及脑垂体(Aguado F Eur．J．Cell Biol．1996 69：351-9)．相应地这些组织中胞吐作用的缺乏会导致一系列与之相关的疾病。

减数分裂：除参与细胞的胞吐作用外，P47的另一个作用与男性精子生成有关，在整个哺乳动物精子生成过程中，其性染色体都形成一种被叫作xy小体的结构(又称性泡〕，该结构位于粗线期精母细胞的核周边。和常染色体不同，xy小体伴有染色质浓缩和转录灭活。分析显示，在精子生成过程中，编码P47蛋白的mRNA高度富集于粗线期精母细胞的xy小体中，P47蛋白相关于xy小体的轴元素，因此P47又称xy小体相关蛋白(Smith A et al Pro．Natl．Acad．Sci．1992 89：6938-42)。实验还表明，P47与男性性染色体减数分裂的异染周期性行为有关，有可能可用于男性计划生育以及男性不育症的治疗(Aisheimer M et al Chomosoma 1997 106：308-14)。不论从其在减数分裂过程中的作用还是参与胞吐过程中的作用来看，P47还可能与卵子受精过程中的顶体反应有关。

在本申请之前，尚没有公开或报道过本发明所涉及的人hP47蛋白。

本发明的第一目的就是提供一种新的人基因hP47(Genbank AccessionNo．AF112371)，该基因是一个P47蛋白基因。

本发明的第二目的是提供一种新的人蛋白hP47。

本发明的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述的新的人P47蛋白和核酸序列的方法。

本发明还提供了这种P47蛋白多肽和编码序列的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有人hP47蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO．6中从核苷酸第5-1120位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO．6中从核苷酸第5-1120位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO．7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO．6中从核苷酸第5-1120位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离出的人hP47蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO．7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO．7序列的多肽。

在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。

在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在一个实例中该宿主细胞是大肠杆菌；在另一实例中，该宿主细胞是真核细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有人hP47蛋白质活性的多肽的方法，该方法包括：

(1)将编码具有人hP47蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人hP47蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO．6中从核苷酸第5-1120位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hP47蛋白的重组细胞；

(3)在适合表达人hP47蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有人hP47蛋白活性的多肽。

较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO．6中第5-1120位的序列。

本发明还提供了与hP47蛋白多肽特异性结合的抗体。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“人hP47蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人hP47蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO．6中第5-1120位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO．6序列的编码框第5-1120位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO．6中第5-1120位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO．7所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO．6中从核苷酸第5-1120位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO．6中从核苷酸第5-1120位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人hP47相同功能的蛋白的、SEQ ID NO．6中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和／或取代，以及在5’和／或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“人hP47蛋白或多肽”指具有hP47蛋白活性的SEQ ID NO．7序列的多肽。该术语还包括具有与人hP47相同功能的、SEQ ID NO．7序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和／或取代，以及在C末端和／或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和／或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括hP47蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明人hP47多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人hP47 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人hP47多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人hP47多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括人hP47多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人hP47多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“hP47保守性变异多肽”指与SEQ ID NO．7的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu

Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还包括人hP47蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人hP47多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的人hP47多肽时，可以将hP47编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成人hP47蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

本发明还提供了对人hP47特异的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。

在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对hP47特异的抗体。例如，将提纯的人hP47基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人hP47或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可以用杂交瘤技术制备(例如，Kohler et al．，Nature 256：495，1975；Kohler et al．，Eur．J．Immunol．6：511，1976；Kohler et al．，Eur．J．Immunol．6：292，1976)。本发明的抗体包括可以阻抑hP47功能的抗体，也可以是不影响人hP47功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人hP47基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人hP47基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的hP47基因产物结合的抗体，可以通过用在原核细胞例如E．coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽结合的抗体，可以通过用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物的来免疫动物而得到。

本发明的人hP47抗体可以用来鉴定表达人hP47蛋白或多肽的细胞，如JurkatT细胞。例如，可以用一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸(FITC)来标记hP47特异抗体，然后让人hP47特异抗体与细胞样品接触，再用荧光显微镜或流式细胞仪检测出与hP47特异抗体结合的细胞。

除了在细胞表面检测人hP47外，还可以用Western印迹技术分析该蛋白质。细胞裂解液可以从培养细胞或取自病人的组织标本如肾上腺中提取，并溶解在含有去污剂的裂解缓冲液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞提取物(同时将提纯的人hP47多肽作为阳性对照)，接着通过电泳杂交将其转移到硝酸纤维素上。为了用Western印迹免疫探测hP47多肽，可以使用典型的抗体结合检测方法，例如放射自显影或碱性磷酸酶检测方法。并可使用免疫接种血清或不相关的单克隆抗体作为非特异反应的对照。

还可用Nothern印迹法技术分析hP47基因产物的表达，即分析人hP47的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

人hP47 DNA的Nothern印迹分析和人hP47特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实人hP47在生物样本中的表达。人hP47 DNA还可以用于Southern印迹分析或原位杂交分析，以将该基因定位于染色体上，并可进行遗传连锁分析以找出其它可能的疾病相关基因。

此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有hP47核苷酸编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码hP47的核酸分子。

本发明还提供了检测样品中是否存在hP47核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于hP47核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的hP47核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选hP47同源基因或同源蛋白。

为了得到与hP47基因相关的人cDNAs或基因组DNAs的点阵，可以用DNA探针筛选人cDNA或基因组DNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用³²P对hP47的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自人肾上腺组织的文库。来自参与内分泌的其它人体组织或特定人体细胞株的cDNA文库也可用于筛选目的。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Palo Alto，Cal．。这种筛选方法可以识别与hP47相关的基因家族的核苷酸序列。

根据核苷酸相似性筛选hP47同源物可以按如下方法完成。人体肾上腺cDNA文库，例如Clontech Cat．#7430-1(Clontech，Palo Alto，Cal．)可以使用一段包含hP47基因序列的全部或部分的随机引物化DNA探针筛选。要完成对与hP47序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鉴定，可以使用杂交温度为55℃的杂交液，然后用0．5×SSC和0．1％SDS清洗。用这种方法识别的克隆的DNA插入序列可以进一步用DNA限制性内切酶分析和DNA测序来评价它与hP47基因的相似性。组织表达的分布可以用上述的Northern印迹法技术分析。

hP47同源物也可以用针对hP47蛋白或多肽的抗体来识别。例如，可以用标准的方法对商品化的或者用已知方法构建的，来自细胞或者组织例如肾上腺的表达文库进行筛选。将文库倒入平皿，菌落转移到一张硝化纤维素膜上，使表达的重组蛋白结合到膜上。然后就可以用特异性的人hP47抗体进行典型的抗体结合和检测。用这种方法所识别出克隆中的DNA插入序列，可以进一步用DNA限制性内切酶分析和DNA测序进行分析以评价它与hP47基因的相似性。新识别的基因的组织表达分布可以同样地按上述方法进行分析。

本发明的人hP47核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

通过同源检索发现，本发明的新基因具有与已发表并被确认为大鼠P47蛋白的基因高度同源的序列，并且本发明的新蛋白具有大鼠P47蛋白高度保守的氨基酸序列。所以，本发明的hP47是大鼠P47蛋白基因的一个同源基因而具有相似的功能。

图1为本发明的人hP47与大鼠P47基因核酸序列(GenBank AccessionNo．AB002086)的同源比较(FASTA)图。其中，相同的核苷酸用“丨”标出。

图2为本发明的人hP47蛋白与大鼠P47蛋白的氨基酸序列(SwissProtAccession No．035987)的同源比较(FASTA)图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1hP47基因的克隆1．组织分离(Tissue isolation)肾上腺来源于5个正常成年男性供体，在死后四小时内取出肾上腺组织，立即置于液氮中冷冻保存。

2．mRNA的分离(mRNA isolation)

取出组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。用带Oligo d(T)的纤维素柱分离总RNA中的mRNA，定量。

3．cDNA文库的构建(Construction of cDNA library)

以mRNA为模板，合成双链cDNA，反转录引物见SEQ ID NO．1。补平末端后，加含EcoRⅠ切点的接头，接头序列分别见SEQ ID NO．2和3。磷酸化EcoRⅠ末端后，用XhoⅠ限制性内切酶消化1．5小时，再进行片段分离。过柱筛选长度＞500bp的片段，用酚—氯仿抽提，乙醇沉淀，无菌水溶解，连接至Uni-ZAP XR载体(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)进行包装，宿主菌使用XL l-Blue MRF’(Stratagene，CA9203，USA)细菌．涂板并测定滴度。

4．测序及数据库建立(Seqencing and Database Constructing)

挑选文库中有外源片段插入的克隆，扩增后抽提质粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作为3′端和5′端的通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行EST大规模测序。测序结果用FACTURA软件去除载体序列，传输到SUN Ultra 450 Server上进行下一步的处理。所有的序列信息再用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，将无同源性或同源性低于95％的序列视为新基因建立数据库。

5．基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

在得到的新基因片段序列信息基础上，进行cDNA全长克隆，分两阶段进行：

(1)“电子克隆”(Electronic Cloning)

以新基因片段序列作为探针搜寻dbEST数据库，将重叠序列＞50bp，同源性在98％以上的表达序列标签(Expressed Sequence Tag，简称“EST”)序列认为同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER软件进行拼接，部分EST可以延伸探针序列。再用STRIDER软件分析被延伸的序列是否具有完整的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜寻Genbank或SwissProt以确定该序列在核苷酸和氨基酸水平上是否与其他物种有同源性，以帮助判别所得到的基因全长完整性如何。通过电子克隆的方法，通常可获取hP47基因的全长序列。

(2)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)

如果通过“电子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全长，则在已有序列的5′或3′端设计引物，在人类肾上腺Marathon-Ready cDNA文库(Clontech Lab，Inc，USA)中进行长距离PCR反应。然后对PCR产物克隆、测序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER软件分析被延长的序列有无完整的ORF，如无，重复上述过程直至获得全长。

(3)RT-PCR

对于5′和3′端已知的序列，如果中间尚有一段间隙(gap)无法从已有的公共数据库或自身数据库获得，可考虑采用RT-PCR的方法。在序列5′端设计引物，3′端引物采用Oligo-dT，在肾上腺总RNA库中进行扩增。然后对产物进行克隆、测序。最后拼接并获得全长。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的人hP47蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物R1：5′-GAAGATGGCGGCGGCGACA-3′(SEQ ID NO．4)为正向引物，寡核苷酸R2：5′-CACAAAAACCCAGGAAATGC-3′(SEQ ID NO．5)为反向引物，以肾上腺组织的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，R1／R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1309bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO．6所示的序列。

实施例2

hP47基因的序列信息与同源性分析：

本发明新的人hP47全长cDNA(GenBank Accession No．AF112371。因申请保密，故在本申请之前未对公众公开)的长度为1309bp，详细序列见SEQ ID NO．6，其中开放读框位于5-1120位核苷酸。根据全长cDNA推导出hP47的氨基酸序列，共371个氨基酸残基，分子量40949．38，pI为5．05。详细序列见SEQ ID NO．7。

将hP47的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与大鼠的基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它与大鼠P47基因的mRNA全编码序列(GenBank Accession No．AB002086)的105-1403位碱基有79．7％的相同性(图1)，在氨基酸水平上，它与大鼠P47蛋白(SwissProt AccessionNo．O35987)的第1-370位氨基酸残基有84．8％的相同性和90％的相似性(图2)。由上可见，hP47基因与大鼠P47基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也有很高相似性。

本发明的人hP47除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人hP47还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人hP47蛋白的N端与大鼠P47蛋白的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。

针对本发明人hP47的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。

此外，本发明人hP47核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人hP47的表达水平或者抑制人hP47的过度表达。本发明的人hP47蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人hP47缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

由于本发明的人hP47蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种(如大鼠)的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和／或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。

实施例3

hP47蛋白的结构和功能研究：

1．将bP47蛋白的氨基酸序列在PROSITE数据库(网址为：http：／／expasy．hcuge．ch／sprot／scnpsitl．html)中检索基序(motif)，得到以下结果：

1  MAAATATALR EFVAVTGAEE DRARFFLESA GWDLQIALEP SYEDGGDEDI

51  VTISQATPSS VSRGTAPSDN RVTSFRDLIH DQDEDEEEEE GQRSRFYAGG

101 SERSGQQIVG PPRKKSPNEL VDDLFKGAKE HGAVACWKRV TQEPWGETSK

151 PRPYLQGGGY PLGPAPEEDS FLLLAGEKRQ HFOQDGSCSM KLWKSGYSLD

201 NGDLRSYKPS NAQFWSYRRG ESTIRRLATV TVNLDMEDHR DEDFVKPKGA

251 FKAFTGEGQK  LGSTAPQVLS  TSSPAQQAEN  EAKASSSILI  DESEPTTNIQ

301 IRLADGGRLV  QKFNHSHRIS  DIRLFIVDAR  PAMAATSFIL  MTTFPNKELA

351 DESQTLKEAN  LLNAVIVQRL  T

(1)在氨基酸序列中，存在以下功能基序：

(ⅰ)波浪下划线区(113-116,138-141)：cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点(cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site)

(ⅱ)黑体区(74-76，101-103，148-150，189-191，206-208，216-218，223-225，316-318，355-357)：蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinase C phosphorylation site)

(ⅲ)斜体区(16-19，41-44，74-77，116-119，355-358)：酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(Casein kinase Ⅱ phosphorylation site)

(ⅳ)下划线区(64-69，100-105，132-137，249-254，258-263)：N-豆蔻酰化位点(N-myristoylation site)

(ⅴ)着重号区(314-317)：N-糖基化位点(N-glycosylation site)

(2)功能分析：

cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，N-豆蔻酰化位点，蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点均与翻译后修饰(post-translational modifications)有关。

2．将hP47蛋白的氨基酸序列在blocks数据库(网址为：http：／／www．blocks．fhcrc．org)中检索结构域，得到以下结果：

  1  MAAATATALR  EFVAVTGAEE  DRARFFLESA  GWDLQIALEP  SYEDGGDEDI

 51  VTISQATPSS  VSRGTAPSDN  RVTSFRDLIH  DQDEDEEEEE  GQRSRFYAGG

101  SERSGQQIVG  PPRKKSPNEL  VDDLFKGAKE  HGAVACWKRV  TQEPWGETSK

151  PRPYLQGGGY  PLGPAPEEDS  FLLLAGEKRQ  HFQQDGSCSM  KLWKSGYSLD

201  NGDLRSYKPS  NAQFWSYRRG  ESTIRRLATV  TVNLDMEDHR  DEDFVKPKGA

251  FKAFTGEGQK  LGSTAPQVLS  TSSPAQQAEN  EAKASSSILI  DESEPTTNIQ

301  IRLADGGRLV  QKFNHSHRIS  DIRLFIVDAR  PAMAATSFIL  MTTFPNKELA

351  DESQTLKEAN LLNAVIVQRL T

(1)在氨基酸序列中，存在以下结构域区：

(ⅰ)下划线区(76-94)：甲状腺激素受体功能模块(THYROID HORMONERECEPTOR)

(ⅱ)黑体区(215-226，325-338)：细胞色素c和cl血红素裂解酶蛋白功能模块(Cytochrome c and cl heme lyases proteins)

(2)功能分析

在该基因氨基酸序列中存在甲状腺激素受体功能模块，预示着该蛋白参与膜泡分泌的功能可能受一些内分泌激素的调节。

综上所述，从hP47蛋白的结构和理化特性进一步证实了该基因与大鼠P47蛋白的相似性。由于蛋白质结构决定了功能特异性的生物化学原理，因此本发明的人P47具有大鼠P47相似或相同的功能。该基因在胞吐过程发挥着重要作用。

实施例4

hP47基因的组织表达谱

1．电子Northern表达谱。按Ton C．等人的方法(Ton C et al．，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)：589-594；Hwang DM，et al．，Circulation 1997 Dec16；96(12)：4146-4203)，将hP47 cDNA序列在GCG软件包中的dbEST数据库中做BLAST检索，在得到的人类EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST有81个，可视为该基因在组织中的转录表达本，由此得出表达该基因的组织谱，发现其在肾上腺、脑、乳腺、结肠、B细胞生发中心(B cell germinal center)、心脏、肾、肝、肺、黑色素细胞、子宫、松果体、胎盘、前列腺、脾脏和睾丸中均有表达，表明它在人体许多组织器官中都发挥着重要作用。

实施例5

hP47多肽的制备和提纯

在该实施例中，将全长的hP47编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

1．将hP47多肽以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。

原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌

根据人hP47的全长编码序列(SEQ ID NO．6)，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5′和3′端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pGEX-2T载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将hP47基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pGEX-2T载体(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鉴定好的表达载体利用CaCl₂方法转入大肠杆菌DH5α，筛选鉴定得到含有pGEX-2T-hP47表达载体的工程菌DH5α-pGEX-2T-hP47。

表达GST-hP47重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的DH5α-pGEX-2T-hP47工程菌于3ml含100μg／ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg／ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0．5后，加入IPTG至终浓度1mmol／L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-hP47融合蛋白的工程菌。

GST-hP47融合蛋白的提取纯化

按上述方法诱导表达GST-hP47融合表达蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hP47。诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌，超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm／min离心10分钟沉淀结合了GST-hP47的谷胱苷肽Sepharose 4B，弃上清。按每毫升超声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm／min离心10分钟，上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。在41kDa处的蛋白质条带即为hP47蛋白。

实施例6

hP47蛋白或多肽在昆虫细胞中进行真核细胞表达

1．hP47杆状病毒表达载体的构建及转染Sf9昆虫细胞株

根据人hP47的全长编码序列(SEQ ID NO．6)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将hP47cDNA在保证阅读框架的前提下克隆至pVL1392载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鉴定好的表达载体3μg，野生型线性杆状病毒DNA(BaculoGold^TM ACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml无血清的昆虫培养基中，振荡15秒混匀，室温孵育15分钟备用。取1ml(2×10⁶)Sf9昆虫细胞悬液于60mm组织培养板中，贴壁1小时后换转染培养基，室温孵育15分钟后弃培养基，加入前面制备好的DNA载体转染混合物，Parafilm密封培养板，于室温27℃振摇培养4小时，而后换完全培养基培养3天，收集上清备用。

2．转入重组表达载体的昆虫细胞株的筛选鉴定

转染3天后的昆虫细胞用新鲜培养基制成细胞悬液(2×10⁶／l ml)，取1ml细胞悬液置于60mm组织培养皿中，加入3ml培养基，100μl收集的培养上清，贴壁1小时，弃2ml培养基，继续室温培养1小时，弃去所有的培养基，加入预热的含20μl4％X-gal的3ml半固体培养基，培养5-7天后挑取白色细胞克隆于96孔培养板中培养3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆虫细胞。

收集感染的细胞进行Western鉴定。将细胞裂解后进行SDS-PAGE电泳，电泳后的胶于Pharmacia的MultiphorⅡ半干电转移仪中将蛋白质转印到硝酸纤维膜上，将硝酸纤维膜置于封闭液中封闭1小时，而后于抗hP47的抗体溶液中封闭1小时，TBS液振摇清洗5分钟共2次，而后将膜置于生物素标记的抗hP47一抗的第二抗体溶液中振摇1小时，TBS清洗，加入亲和素-碱性磷酸酶复合物反应30分钟，TBS清洗2次，加入新鲜配制的显色液显色观察蛋白条带。

挑取高表达hP47的Sf9细胞克隆。

3．hP47蛋白的提取纯化

用高表达hP47的Sf9细胞克隆的上清大量感染Sf9细胞，感染48小时后收集细胞，PBS洗涤。每2×10⁸细胞加入20ml细胞裂解液(0．5％Triton x-100，20mM Na₃PO₄(磷酸钠，pH7．8)，500mM NaCl，1mM Na₃VO₄(钒酸钠)，1mM Pefabloc，1μg／ml胃蛋白酶抑制剂，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破细胞，12000×g离心20min去除细胞碎片，上清按每2×10⁸的细胞加入2ml NTA-琼脂糖(Qiagen,Germany)，4℃吸附1小时。而后用含100nM咪唑的His缓冲液洗涤两次，用含20mM N，N′-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的缓冲液洗脱以得到纯化的蛋白。洗脱液保存于4℃，并进行SDS-PAGE电泳检测提取的hP47蛋白的纯度。在41kDa处的蛋白质条带即为hP47蛋白。

实施例7

抗人hP47抗体的制备

1．免疫小鼠和脾细胞的制备：将实施例5和实施例6中获得的hP47蛋白用层析法进行分离后备用，也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中割下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。取6-8周龄Balb／C雌鼠，用50-100μg／0．2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg／0．2ml的剂量再加强免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾细胞制备见鄂征主编，《组织培养和分子细胞学技术》，北京出版社，第210页。

2．按《组织培养和分子细胞学技术》(同上)，第371页中的方法，制备饲养细胞。

3．按《组织培养和分子细胞学技术》(同上)，第213页中的方法，进行细胞融合。

4．抗体的检测：在细胞融合10-15天后，需逐孔进行检查，一旦发现旺盛的杂交细胞集落生长，就应用hP47蛋白做抗体活性的初步筛选，常用的方法有：免疫荧光试验、发射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。检查出抗体活性的孔后，立刻进行克隆培养，并分离出抗体。

序列表(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：国家人类基因组南方研究中心

(ⅱ)发明名称：人P47蛋白及其编码序列

(ⅲ)序列数目：7

(2)SEQ ID NO．1的信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：50bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：寡核苷酸

(ⅸ)序列描述：SEQ ID NO．1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 50

(2)SEQ ID NO．2的信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：13bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：寡核苷酸

(ⅸ)序列描述：SEQ ID NO．2

AATTCGGCAC GA G    13(2)SEQ ID NO．3的信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：9bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸(ⅸ)序列描述：SEQ ID NO．3GCCGTGCTC              9(2)SEQ IDNO．4的信息(ⅰ)．序列特征：

(A)长度：19bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)．分子类型：寡核苷酸(ⅸ)．序列描述：SEQ ID NO．4GAAGATGGCGGCGGCGACA          19(2)SEQ ID NO．5的信息(ⅰ)．序列特征：

(A)长度：20bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)．分子类型：寡核苷酸(ⅸ)．序列描述：SEQ ID NO．5CACAAAAACCCAGGAAATGC         20(2)SEQ ID NO．6的信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1309bp  (B)类型：核苷酸(C)链性：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：核苷酸(ⅸ)序列描述：SEQ ID NO．61  GAAGATGGCG  GCGGCGACAG  CGACGGCGCT  GAGGGAGTTC  GTGGCGGTGA51  CGGGCGCCGA  GGAGGACCGG  GCCCGCTTCT  TTCTCGAGTC  GGCCGGCTGG101  GACTTGCAGA  TCGCGCTAGA  GCCTTCTTAT  GAGGACGGAG  GGGATGAAGA151  CATTGTGACC  ATTTCGCAGG  CAACCCCCAG  TTCAGTGTCC  AGAGGCACAG201  CCCCCAGTGA  TAATAGAGTG  ACATCCTTCA  GAGACCTCAT  TCATGACCAA251  GATGAAGATG  AGGAGGAAGA  GGAAGGCCAG  AGGAGCAGGT  TTTATGCTGG301  GGGCTCAGAG  AGAAGTGGAC  AGCAGATTGT  TGGCCCTCCC  AGGAAGAAAA351  GTCCCAACGA  GCTGGTTGAT  GATCTCTTTA  AAGGTGCCAA  AGAGCATGGA401  GCTGTAGCTT  GTTGGAAGCG  AGTGACCCAA  GAGCCCTGGG  GAGAGACCAG451  TAAACCGAGA  CCCTATTTGC  AAGGAGGTGG  CTACCCCTTG  GGGCCAGCAC501  CAGAGGAAGA  CTCTTTCCTA  TTGTTGGCAG  GAGAAAAGAG  GCAGCATTTC551  CAGCAAGATG  GTTCATGTAG  TATGAAACTC  TGGAAGAGTG  GATACAGCCT601  GGATAATGGA  GACCTCAGAA  GCTACAAGCC  ATCCAATGCC  CAGTTCTGGA651  GTTATCGCAG  AGGGGAGTCC  ACAATTCGGA  GGCTAGCTAC  GGTGACAGTG701  AACTTGGATA  TGGAGGACCA  TCGGGACGAG  GACTTTGTGA  AGCCCAAAGG751  AGCCTTCAAA  GCCTTCACTG  GCGAGGGTCA  GAAACTGGGC  AGCACTGCCC801  CCCAGGTGTT  GAGTACCAGC  TCTCCAGCCC  AACAGGCAGA  AAATGAAGCC851  AAAGCCAGCT  CTTCCATCTT  AATCGACGAA  TCAGAGCCTA  CCACAAACAT901  CCAAATTCGG  CTTGCAGACG  GCGGGAGGCT  GGTGCAGAAA  TTTAACCACA951  GCCACAGGAT  CAGCGACATC  CGACTCTTCA  TCGTGGATGC  CCGGCCAGCC1001  ATGGCTGCCA  CCAGCTTTAT  CCTCATGACT  ACTTTCCCGA  ACAAAGAGCT1051  GGCTGATGAG  AGCCAGACCC  TGAAGGAAGC  CAACCTGCTC  AATGCTGTCA1101  TCGTGCAGCG  GTTAACATAA  CCGCCCAGCC  AGCTGCCTGG  CCTCCCTCCT1151  GTGTTTCCCA  TGCCAGTGGC  CATGCCCCAT  GGGGATCGCC  CCTCCTGCCC1201  CCTTGTGCAC  ACCCAGCAGT  CCAGTGCAAC  GTCTCCTCCA  TAGCTCTGGG1251  TTCTTAGATC  TTGGTTGGAC  GTTTGTTTTC  TCCTTAGTTG  CATTTCCTGG1301  GTTTTTGTG(2)SEQ ID NO．7的信息(ⅰ)序列特征：

(A)长度：371氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：多肽(ⅸ)序列描述：SEQ ID NO．71 Met Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Arg Glu Phe Val Ala Val16 Thr Gly Ala Glu Glu Asp Arg Ala Arg Phe Phe Leu Glu Ser Ala31 Gly Trp Asp Leu Gln Ile Ala Leu Glu Pro Ser Tyr Glu Asp Gly46 Gly Asp Glu Asp Ile Val Thr Ile Ser Gln Ala Thr Pro Ser Ser61 Val Ser Arg Gly Thr Ala Pro Ser Asp Asn Arg Val Thr Ser Phe76 Arg Asp Leu Ile His Asp Gln Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu91 Gly Gln Arg Ser Arg Phe Tyr Ala Gly Gly Ser Glu Arg Ser Gly106 Gln Gln Ile Val Gly Pro Pro Arg Lys Lys Ser Pro Asn Glu Leu121 Val Asp Asp Leu Phe Lys Gly Ala Lys Glu His Gly Ala Val Ala136 Cys Trp Lys Arg Val Thr Gln Glu Pro Trp Gly Glu Thr Ser Lys151 Pro Arg Pro Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Tyr Pro Leu Gly Pro Ala166 Pro Glu Glu Asp Ser Phe Leu Leu Leu Ala Gly Glu Lys Arg Gln181 His Phe Gln Gln Asp Gly Ser Cys Ser Met Lys Leu Trp Lys Ser196 Gly Tyr Ser Leu Asp Asn Gly Asp Leu Arg Ser Tyr Lys Pro Ser211 Asn Ala Gln Phe Trp Ser Tyr Arg Arg Gly Glu Ser Thr Ile Arg226 Arg Leu Ala Thr Val Thr Val Asn Leu Asp Met Glu Asp His Arg241 Asp Glu Asp Phe Val Lys Pro Lys Gly Ala Phe Lys Ala Phe Thr256 Gly Glu Gly Gln Lys Leu Gly Ser Thr Ala Pro Gln Val Leu Ser271 Thr Ser Ser Pro Ala Gln Gln Ala Glu Asn Glu Ala Lys Ala Ser286 Ser Ser Ile Leu Ile Asp Glu Ser Glu Pro Thr Thr Asn Ile Gln301 Ile Arg Leu Ala Asp Gly Gly Arg Leu Val Gln Lys Phe Asn His316 Ser His Arg Ile Ser Asp Ile Arg Leu Phe Ile Val Asp Ala Arg331 Pro Ala Met Ala Ala Thr Ser Phe Ile Leu Met Thr Thr Phe Pro346 Asn Lys Glu Leu Ala Asp Glu Ser Gln Thr Leu Lys Glu Ala Asn361 Leu Leu Asn Ala Val Ile Val Gln Arg Leu Thr

Claims (10)

1．一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人hP47蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，

所述的核苷酸序列与SEQ ID NO．6中从核苷酸第5-1120位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO．6中从核苷酸第5-1120位的核苷酸序列杂交。

2．如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQ IDNO．7所示的序列的多肽。

3．如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO．6中从核苷酸第5-1120位的核苷酸序列。

4．一种分离出的人hP47蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID NO．7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5．如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO．7序列的多肽。

6．一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。

7．一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8．一种产生具有人hP47蛋白质活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)将编码具有人hP47蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人hP47蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO．6中从核苷酸第5-1120位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hP47蛋白的重组细胞；

(3)在适合表达人hP47蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有人hP47蛋白活性的多肽。

9．一种能与权利要求7所述的人hP47蛋白多肽特异性结合的抗体。

10．一种探针分子，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

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