CN1948490A - 人hRAB－14基因序列、其编码蛋白及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在人体正常肾上腺组织表达的新的Ras相关蛋白hRAB－14的基因序列及其编码蛋白，本发明还公开了该蛋白的制备方法，以及提供了与hRAB－14蛋白多肽特异性结合的抗体。本发明的人hRAB－14蛋白可以施用于病人，以治疗或减轻因人hRAB－14蛋白缺失、无功能或异常而导致的有关病症。

Description

人hRAB-14基因序列、其编码蛋白及制备方法

技术领域

本发明涉及一种新的人基因和蛋白，尤其涉及一种人hRAB-14基因的核酸序列、其编码蛋白；此外，本发明还涉及该基因编码蛋白的制备方法。

背景技术

哺乳动物细胞的Rab家族是Ras超家族的成员之一，它包括40多个家族成员。Rab蛋白在真核细胞的膜泡分泌和内吞途径中发挥着重要的调节和指导作用。Rab蛋白的羧基端在异戊二烯转移酶的作用下发生双重异戊二烯化，使其具有与膜相聚集的功能。Rab蛋白有GTP水解酶活性，可分别与GTP和GDP结合，根据其分子量小，单体结构等特征，又被称为“小分子GTP激酶”。Rab蛋白中GTP结合与GTP水解为GDP之间的循环形成了一种分子开关机制，即通过鸟嘌呤核苷酸不同形式的结合形成不同的激酶构象-Rab蛋白的活性形式和非活性形式。Rab作为细胞内膜泡运输过程中膜泡融合的调节因子，需要有精细的定位，因此每一Rab家族成员均有特定的细胞内膜定位。这种复杂性与哺乳动物细胞类型的多样性，膜泡运输路线的多样性紧密相关。作为一大的蛋白家族，Rab通过其不同的家族成员而发挥其广泛的生物学功能和临床应用价值，主要有以下几个方面：

(a)调节细胞内的膜泡运输

主要表现在：(1)细胞内运输膜泡的形成是受精细调控的，只有当膜泡中含有停泊(docking)融合所需的物质时，出芽反应才能发生，运输膜泡的形成需要Rab的参与(Pfeffer，S.R et al，Curr.Biol.1994，6，522-526；Nuoffer，Cetal，Annu.Rev.Biochem.1994，63，949-990)。(2)不同的RAB蛋白定位于不同的细胞内膜区域，分别指导着不同路线的膜泡运输反应。如RAB6参与内质网与高尔基体之间的膜泡运输(Beranger F et al，Mol Cell Biol 1994 Jan；14(1)：744-58)；RAB30则与高尔基体的堆积有关(de Leeuw HP et al，Br J Haematol 1998 Oct；103(1)：15-9)。

(b)影响细胞骨架的组成

对RAB6的研究发现：由肌动蛋白，微管组成的细胞骨架与Rab调节的膜泡运输之间有一定的联系(Echard A et al，Science 1998 279，580-585)；RAB3A-GTP调节的突触膜泡的胞吐现象与肌动蛋白构成的细胞骨架之间也有某种不确定关系(KatoM et al，J.Biol.Chm.1996 27l，31775-31778)。

(c)对信号传导有重要的调节作用

RAB3a和RAB15均在脑中特异表达，它们分布于神经元和神经内分泌细胞中，通过调节神经末梢膜的流动性而在神经递质的释放过程中发挥重要的作用(Burns ME etal，J Gen Physiol 1998 Feb；111(2)：243-55)。

(d)与多种免疫疾病相关

(1)赛塞莉综合症(Sezary syndrome，红皮病)是一种皮肤T细胞淋巴瘤，表现为泛发性剥脱性红皮病，剧烈瘙痒，外周淋巴结病以及皮肤、淋巴结和外周血中出现含染色质过多的异常单核细胞。在17个赛塞莉综合症病人中，有13个病人其外周单核细胞中有RAB2蛋白的过量表达(Culine S et al，J Biol Chem 1993Jun5；268(16)：11548-52)。(2)在实体瘤病人的治疗过程中，发现其外周单核细胞中RAB2蛋白的过量表达随治疗过程发生改变.对覃状真菌病和实体瘤病人调查研究发现，RAB2蛋白的过量表达与机体内的免疫事件有关(Culine S et al，Eur J Cancer 1994；30A(5)：670-4)。(3)谢迪亚克-东综合症(Chediak-Higashi syndrome)是一种常染色体隐性全身性疾病，伴随症状有眼皮肤白化病、出现大量白细胞包涵体(巨大溶酶体)、身体多种器官组织细胞浸润和各类血细胞减少，以及可能发生恶性淋巴瘤，推测该疾病是由于细胞内膜泡运输方面的缺陷引起的，RAB4蛋白已被确定与谢迪亚克-东综合症有关(Ikeda H et al，Biochem Mol Biol Int 1996 Nov；40(4)：647-51)。(4)近期研究表明，RAB4在大鼠A20B细胞株中对受体调节的抗原作用途径起到关键的控制作用(Lazzarino DA et al，J Exp Med 1998 Nov 16；188(10)：1769-74)。

(e)调节机体代谢

GTP结合的RAB1b的突变体可抑制新生的低密度脂蛋白(LDL)受体在细胞内的正常运输及成熟(Castellano F et al，J Recept Transduct Res 1995Sep-Dec；15(7-8)：847-62)，而低密度脂蛋白的异常与动脉硬化及冠心病密切相关。

在本发明之前，还没有出现涉及本发明的人hRAB-14蛋白的公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种新的人基因hRAB-14(GenbankAccession No.AF112206)，该基因是一个hRAB-14蛋白基因。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种新的人hRAB-14蛋白。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种利用基因重组技术生产上述新的人hRAB-14蛋白的方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有人hRAB-14蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第2-649位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第2-649位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中从核苷酸第2-649位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离出的人hRAB-14蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。

在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。

在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在一个实例中该宿主细胞是大肠杆菌；在另一实例中，该宿主细胞是真核细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种产生具有人hRAB-14蛋白质活性的多肽的方法，该方法包括：

(1)将编码具有人hRAB-14蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人hRAB-14蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第2-649位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hRAB-14蛋白的重组细胞；

(3)在适合表达人hRAB-14蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有人hRAB-14蛋白活性的多肽。

较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第2-649位的序列。

本发明还提供了与hRAB-14蛋白多肽特异性结合的抗体。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“人hRAB-14蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人hRAB-14蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第2-649位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的编码框第2-649位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.6中第2-649位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.7所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第2-649位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。其中，“严紧条件”是指核苷酸序列在膜上杂交后的洗膜条件。例如，在本领域中，低严紧度洗膜可以在杂交管中倒入150ml左右洗液，放入杂交膜，室温持续摇动20分钟左右，而高严紧度洗膜可以是在杂交管中倒入200ml左右洗液，放入杂交膜，50℃摇床中持续摇动20分钟左右。该术语还包括与SEQ ID NO.6中从核苷酸第2-649位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人hRAB-14相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“人hRAB-14蛋白或多肽”指具有hRAB-14蛋白活性的SEQ IDNO.7序列的多肽。该术语还包括具有与人hRAB-14相同功能的、SEQ ID NO.7序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括hRAB-14蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明人hRAB-14多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人hRAB-14DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人hRAB-14多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人hRAB-14多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括人hRAB-14多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人hRAB-14多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“hRAB-14保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

本发明还包括人hRAB-14蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人hRAB-14多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的人hRAB-14多肽时，可以将hRAB-14编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成人hRAB-14蛋白表达载体。

在本发明中，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

本发明还提供了对人hRAB-14特异的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。

在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对hRAB-14特异的抗体。例如，将提纯的人hRAB-14基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人hRAB-14或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可以用杂交瘤技术制备(例如，Kohler et al.，Nature 256：495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：292，1976)。本发明的抗体包括可以阻抑hRAB-14功能的抗体，也可以是不影响人hRAB-14功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人hRAB-14基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人hRAB-14基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的hRAB-14基因产物结合的抗体，可以通过用在原核细胞例如E.coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽结合的抗体，可以通过用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物的来免疫动物而得到。

本发明的人hRAB-14抗体可以用来鉴定表达人hRAB-14蛋白或多肽的细胞，如Jurkat T细胞。例如，可以用一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸(FITC)来标记hRAB-14特异抗体，然后让人hRAB-14特异抗体与细胞样品接触，再用荧光显微镜或流式细胞仪检测出与hRAB-14特异抗体结合的细胞。

除了在细胞表面检测人hRAB-14外，还可以用Western印迹技术分析该蛋白质。细胞裂解液可以从培养细胞或取自病人的组织标本如肾上腺中提取，并溶解在含有去污剂的裂解缓冲液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞提取物(同时将提纯的人hRAB-14多肽作为阳性对照)，接着通过电泳杂交将其转移到硝酸纤维素上。为了用Western印迹免疫探测hRAB-14多肽，可以使用典型的抗体结合检测方法，例如放射自显影或碱性磷酸酶检测方法。并可使用免疫接种血清或不相关的单克隆抗体作为非特异反应的对照。

还可用Nothern印迹法技术分析hRAB-14基因产物的表达，即分析人hRAB-14的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

人hRAB-14DNA的Nothern印迹分析和人hRAB-14特异抗体的Western印迹分析还可以联合使用，以证实人hRAB-14在生物样本中的表达。人hRAB-14DNA还可以用于Southern印迹分析或原位杂交分析，以将该基因定位于染色体上，并可进行遗传连锁分析以找出其它可能的疾病相关基因。

此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有hRAB-14核苷酸编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码hRAB-14的核酸分子。

本发明还提供了检测样品中是否存在hRAB-14核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于hRAB-14核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

此外，根据本发明的hRAB-14核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选hRAB-14同源基因或同源蛋白。

为了得到与hRAB-14基因相关的人cDNAs或基因组DNAs的点阵，可以用DNA探针筛选人cDNA或基因组DNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对hRAB-14的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自人肾上腺组织的文库。来自参与内分泌的其它人体组织或特定人体细胞株的cDNA文库也可用于筛选目的。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与hRAB-14相关的基因家族的核苷酸序列。

根据核苷酸相似性筛选hRAB-14同源物可以按如下方法完成。人体肾上腺cDNA文库，例如Clontech Cat.#7430-1(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含hRAB-14基因序列的全部或部分的随机引物化DNA探针筛选。要完成对与hRAB-14序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鉴定，可以使用杂交温度为55℃的杂交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用这种方法识别的克隆的DNA插入序列可以进一步用DNA限制性内切酶分析和DNA测序来评价它与hRAB-14基因的相似性。组织表达的分布可以用上述的Northern印迹法技术分析。

hRAB-14同源物也可以用针对hRAB-14蛋白或多肽的抗体来识别。例如，可以用标准的方法对商品化的或者用已知方法构建的，来自细胞或者组织例如肾上腺的表达文库进行筛选。将文库倒入平皿，菌落转移到一张硝化纤维素膜上，使表达的重组蛋白结合到膜上。然后就可以用特异性的人hRAB-14抗体进行典型的抗体结合和检测。用这种方法所识别出克隆中的DNA插入序列，可以进一步用DNA限制性内切酶分析和DNA测序进行分析以评价它与hRAB-14基因的相似性。新识别的基因的组织表达分布可以同样地按上述方法进行分析。

本发明的人hRAB-14核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

通过同源检索发现，本发明的新蛋白具有与已发表并被确认为RAB-14的基因高度同源的序列，并且本发明的新蛋白具有RAB基因家族高度保守的氨基酸序列。进一步的研究表明，本发明与已发表并被确认为大鼠RAB-14基因具有高度同源性(大鼠RAB-14基因属于RAB基因家族)，此外与其他RAB家族成员也存在较高同源性。所以，本发明的hRAB-14基因属于RAB基因家族，是大鼠RAB-14基因的一个同源基因而可能具有相似的功能。

本发明的人hRAB-14蛋白可以施用于病人，以治疗或减轻因人hRAB-14缺失、无功能或异常而导致的有关病症，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

附图说明

图1是本发明的人hRAB-14与大鼠RAB-14基因核酸序列(GenBank AccessionNo.U72519)的同源比较(FASTA)图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。

图2是本发明的人hRAB-14蛋白与其他RAB基因家族成员的氨基酸序列的同源比较(PILEUP)图。其中，hRAB14：人类RAB-14基因；rb14_rat：大鼠Ras相关蛋白RAB-14(Swiss-Prot Accession No.P35287)；rb4a_mouse：小鼠Ras相关蛋白RAB-4a(Swiss-Prot Accession No.P56371)；rb4b_rat：大鼠Ras相关蛋白RAB-4b(Swiss-Prot Accession No.P51146)；RAB2_human：人类Ras相关蛋白RAB-2(Swiss Prot Accession No.P08886)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

hRAB-14基因的克隆

1.组织分离(Tissue isolation)

肾上腺来源于5个正常成年男性供体，在死后四小时内取出肾上腺组织，立即置于液氮中冷冻保存。

2.mRNA的分离(mRNA isolation)

取出组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。用带Oligo d(T)的纤维素柱分离总RNA中的mRNA，定量。

3.cDNA文库的构建(Construction of cDNA library)

以mRNA为模板，合成双链cDNA，反转录引物见SEQ ID NO.1。补平末端后，加含EcoRI切点的接头，接头序列分别见SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性内切酶消化1.5小时，再进行片段分离。过柱筛选长度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，无菌水溶解，连接至Uni-ZAP XR载体(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)进行包装，宿主菌使用XLl-Blue MRF’细菌。涂板并测定滴度。

4.测序及数据库建立(Seqencing and Database Constructing)

挑选文库中有外源片段插入的克隆，扩增后抽提质粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作为3’端和5’端的通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行EST大规模测序。测序结果用FACTURA软件去除载体序列，传输到SUN Ultra 450Server上进行下一步的处理。所有的序列信息再用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，将无同源性或同源性低于95％的序列视为新基因建立数据库。

5.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

在得到的新基因片段序列信息基础上，进行cDNA全长克隆，分两阶段进行：

(1)“电子克隆”(Electronic Cloning)

以新基因片段序列作为探针搜寻dbEST数据库，将重叠序列＞50bp，同源性在98％以上的表达序列标签(Expressed Sequence Tag，简称“EST”)序列认为同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER软件进行拼接，部分EST可以延伸探针序列。再用STRIDER软件分析被延伸的序列是否具有完整的开放阅读框架(OpenReading Frame，ORF)，用BLAST搜寻Genbank或SwissProt以确定该序列在核苷酸和氨基酸水平上是否与其他物种有同源性，以帮助判别所得到的基因全长完整性如何。通过电子克隆的方法，通常可获取hRAB-14基因的全长序列。

(2)eDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)

如果通过“电子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全长，则在已有序列的5’或3’端设计引物，在人类肾上腺Marathon-Ready cDNA文库(Clontech Lab，Inc，USA)中进行长距离PCR反应。然后对PCR产物克隆、测序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER软件分析被延长的序列有无完整的ORF，如无，重复上述过程直至获得全长。

(3)RT-PCR

对于5’和3’端已知的序列，中间尚有一段间隙(gap)无法从已有的公共数据库或自身数据库获得，可考虑采用RT-PCR的方法。在序列5’端设计引物，3’端引物采用Oligo-dT，在肾上腺总RNA库中进行扩增。然后对产物进行克隆、测序。最后拼接并获得全长。

通过组合使用上述3种方法，获得了候选的人hRAB-14蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物“R1：5’-CATGGCAACTGCACCATACAAC-3’(SEQ ID NO.4)为正向引物，寡核苷酸R2：5’-CCCCCCTCGAGTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO.5)为反向引物，以肾上腺组织的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，R1/R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得目的片段长度为782bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得如SEQ ID NO.6所示的序列。

实施例2

hRAB-14基因的序列信息与同源性分析：

本发明新的人hRAB-14全长cDNA(GenBank Accession No.AF112206)的长度为782bp，详细序列见SEQ ID NO.6，其中开放读框位于2-649位核苷酸。根据全长cDNA推导出hRAB-14的氨基酸序列，共215个氨基酸残基，分子量23896.95，pI为5.85。详细序列见SEQ ID NO.7。

将hRAB-14的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与人、大鼠、大鼠、线虫乃至果蝇中的基因都存在较高的同源性。在核苷酸水平上，它与大鼠Rab14基因的mRNA全编码序列(GenBank Accession No.M83680)的6-774位碱基有94.5％的相同性(图1)，在氨基酸水平上，它与大鼠Rab14类基因(SwissProtAccession No.P35287)的第1-215位氨基酸残基有99.5％的相同性和100％的相似性(图2)。因此，hRAB-14基因与大鼠Rab14基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也可能具有较高相似性。

实施例3

hRAB-14蛋白的结构和功能研究：

1．将hRAB-14蛋白的氨基酸序列在PROSITE数据库(网址为：http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)中检索基序(motif)，得到以下结果：

(1)在氨基酸序列中，存在以下功能基序：

(i)下划线(95-98)：cAMP-和cGMP-依赖的蛋白激酶磷酸化位点(cAMP-andcGMP-dependent protein kinase phosphorylation site)；

(ii)黑体区(32-34，94-96，154-156)：蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinase Cphosphorylation site)；

(iii)方框区(135-138)：酪蛋白激酶II磷酸化位点(Casein kinase II phosphorylationsite)；

(iv)斜体区(21-26，45-50，83-88，199-204)：N-豆蔻酰化位点(N-myfistoylation site)；

(v)双下划线区(18-25)：ATP/GTP-结合位点基序A(ATP/GTP-binding site motif A(P-loop))；

(vi)曲线区(7-10，111-114)：N-糖基化位点(N-glycosylation site)。

(2)功能分析：

N端糖基化位点，酪蛋白激酶II型磷酸化位点，N-糖基化位点，N-豆蔻酰化位点，蛋白激酶C磷酸化位点与翻译后修饰(post-translational modifications)有关。ATP/GTP-结合位点基序对Rabs家族的功能具有重要意义，Rabs蛋白具有GTP水解酶的活性，它们与GTP、GDP的结合就依赖与蛋白上的这一位点。

2.将hRAB-14蛋白的氨基酸序列在Blocks数据库(网址为：http://blocks.fhcrc.org)中检索结构模块，得到以下结果：

101 HLSSWLTDAR NLTN PNTVII  LIGNKADLEA QRDVTYEEAK QFAEENGLL F

151  LEASAKTGEN  VEDAFLEAAK  KIYQNIQDGS LDLNAAESGV QHKPSAPQGG

201 RLTSEPQPQR EGCGC

(1)在氨基酸序列中，存在以下结构模块区：

(i)下划线区域：(12-33，35-51，53-75，29-51，115-128，150-172)转化蛋白P21(TRANSFORMING PROTEIN P21)，属于Ras超家族的标记；

(ii)斜体区域：(46-85)ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factors)，该结构域中包含有一个保守的GTP结合区域。

以上结果表明，hRAB-14属于Ras超家族的成员之，而且在其结构中包含有与GTP结合的区域，提示其与GTP的结合与水解有密切的联系。

综上所述，从hRAB-14蛋白的结构和理化特性进一步证实了该基因是RAB基因家族的成员。由于蛋白质结构决定了功能特异性的生物化学原理，因此本发明的人hRAB-14基因可能具有与RAB基因家族成员相似或相同的功能，在膜泡运输中发挥重要作用。

实施例4

hRAB-14基因的组织表达谱

1.电子Northern表达谱。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)：589-594；Hwang DM，et al.，Circulation 1997Dec 16；96(12)：4146-4203)，将hRAB-14 cDNA序列在GCG软件包中的dbEST数据库中做BLAST检索，在得到的人类EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST有41个，可视为该基因在组织中的转录表达本，由此得出表达该基因的组织谱，发现其在脑、胸腺、前列腺、心脏、肾脏、肝、胰脏、旁胸腺、肌肉、骨髓、结肠、胎盘、睾丸、脾脏、子宫和黑色素细胞中均有表达。这表明这种蛋白在人体许多组织中都可那发挥着重要作用。

实施例5

hRAB-14多肽的制备和提纯

在该实施例中，将全长的hRAB-14编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

1.hRAB-14蛋白或多肽可以以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。

(a)原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌

根据人hRAB-14的全长编码序列(SEQ ID NO.ID No.6)，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5’和3’端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将hRAB-14基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pGEX-2T载体(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌DH5α，筛选鉴定得到含有pGEX-2T-hRAB-14表达载体的工程菌DH5α-pGEX-2T-hRAB 14。

(b)表达GST-hRAB-14重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的DH5α-pGEX-2T-hRAB-14工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000转离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-hRAB-14融合蛋白的工程菌。

(c)GST-hRAB-14融合蛋白的提取纯化

按上述方法诱导表达GST-hRAB-14融合表达蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hRAB-14。诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌，超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm/min离心10分钟沉淀结合了GST-hRAB-14的谷胱苷肽Sepharose 4B，弃上清。按每毫升超声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm/min离心10分钟，上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。在约24kDa处的条带即为hRAB-14蛋白。

实施例6

hRAB-14蛋白或多肽在昆虫细胞中进行真核细胞表达

1.hRAB-14杆状病毒表达载体的构建及转染Sf9昆虫细胞株

根据人hRAB-14的全长编码序列(SEQ ID NO.6)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将hRAB-14 cDNA在保证阅读框架的前提下克隆至pVL1392载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鉴定好的表达载体3μg，野生型线性杆状病毒DNA(BaculoGold^TM ACMNPV DNA，Pharmingen，SanDiego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml无血清的昆虫培养基中，振荡15秒混匀，室温孵育15分钟备用。取1ml(2×10⁶)Sf9昆虫细胞悬液于60mm组织培养板中，贴壁1小时后换转染培养基，室温孵育15分钟后弃培养基，加入前面制备好的DNA载体转染混合物，Parafilm密封培养板，于室温27℃振摇培养4小时，而后换完全培养基培养3天，收集上清备用。

2.转入重组表达载体的昆虫细胞株的筛选鉴定

转染3天后的昆虫细胞用新鲜培养基制成细胞悬液(2×10⁶/1ml)，取1ml细胞悬液置于60mm组织培养皿中，加入3ml培养基，100μl收集的培养上清，贴壁1小时，弃2ml培养基，继续室温培养1小时，弃去所有的培养基，加入预热的含20μl4％X-gal的3ml半固体培养基，培养5-7天后挑取白色细胞克隆于96孔培养板中培养3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆虫细胞。

收集感染的细胞进行Western鉴定。将细胞裂解后进行SDS-PAGE电泳，电泳后的胶于Pharmacia的Multiphor II半干电转移仪中将蛋白质转印到硝酸纤维膜上，将硝酸纤维膜置于封闭液中封闭1小时，而后于抗hRAB-14的抗体溶液中封闭1小时，TBS液振摇清洗5分钟共2次，而后将膜置于生物素标记的抗hRAB-14一抗的第二抗体溶液中振摇1小时，TBS清洗，加入亲和素-碱性磷酸酶复合物反应30分钟，TBS清洗2次，加入新鲜配制的显色液显色观察蛋白条带。

挑取高表达hRAB-14的Sf9细胞克隆。

3.hRAB-14蛋白的提取纯化

用高表达hRAB-14的Sf9细胞克隆的上清大量感染Sf9细胞，感染48小时后收集细胞，PBS洗涤。每2×10⁸细胞加入20ml细胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mMNa₃PO₄(磷酸钠，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na₃VO₄(钒酸钠)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制剂，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破细胞，12000×g离心20min去除细胞碎片，上清按每2×10⁸的细胞加入2ml NTA-琼脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小时。而后用含100nM咪唑的His缓冲液洗涤两次，用含20mM N，N’-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的缓冲液洗脱以得到纯化的蛋白。洗脱液保存于4℃，并进行SDS-PAGE电泳检测提取的hRAB-14蛋白的纯度。在约24kDa处的条带即为hRAB-14蛋白。

实施例7

抗人hRAB-14抗体的制备

1.免疫小鼠和脾细胞的制备：将实施例5和6中获得的人hRAB-14重组蛋白分子用层析法进行分离后备用，也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中割下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。取6-8周龄Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量再加强免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾细胞制备见鄂征主编，《组织培养和分子细胞学技术》，北京出版社，第210页。

2.按《组织培养和分子细胞学技术》(同上)，第211页中的方法，制备饲养细胞。

3.按《组织培养和分子细胞学技术》(同上)，第213页中的方法，进行细胞融合。

4.抗体的检测：在细胞融合10-15天后，需逐孔进行检查，一旦发现旺盛的杂交细胞集落生长，就应用hRAB-14蛋白做抗体活性的初步筛选，常用的方法有：免疫荧光试验、发射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。检查出抗体活性的孔后，立刻进行克隆培养，并分离出抗体。

                    序列表

<110>上海人类基因组研究中心

<120>人hRAB-14基因序列、其编码蛋白及制备方法

<130>NP-10005

<160>7

<210>1

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 50

<210>2

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>接头序列

<400>2

AATTCGGCAC GA G                                    13

<210>3

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>接头序列

<400>3

GCCGTGCTC                                            9

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

CATGGCAACTGCACCATACAAC                              22

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

CCCCCCTCGAGTTTTTTTT                                19

<210>6

<211>782

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(2)..(649)

<400>6

  1 CATGGCAACT GCACCATACA ACTACTCTTA CATCTTTAAA TATATTATTA

 51 TTGGGGACAT GGGAGTAGGA AAATCTTGCT TGCTTCATCA ATTTACAGAA

101 AAAAAATTTA TGGCTGATTG TCCTCACACA ATTGGTGTTG AATTTGGTAC

151 AAGAATAATC GAAGTTAGTG GCCAAAAAAT AAAACTGCAG ATTTGGGATA

201 CGGCAGGACA GGAGCGATTT AGGGCTGTTA CACGGAGCTA CTATAGAGGA

251 GCTGCGGGAG CTCTTATGGT CTATGATATT ACTAGAAGAA GTACATATAA

301 CCACTTAAGC AGCTGGTTGA CAGATGCAAG GAATCTCACC AATCCAAATA

351 CTGTAATAAT TCTCATAGGA AATAAAGCAG ATTTGGAGGC ACAGAGAGAT

401 GTTACATATG AAGAAGCCAA ACAGTTTGCT GAAGAAAATG GCTTATTGTT

451 CCTCGAAGCG AGTGCAAAAA CGGGAGAGAA TGTAGAAGAT GCCTTCCTTG

501 AGGCTGCCAA GAAAATCTAT CAGAACATTC AGGATGGAAG CTTGGATCTG

551 AATGCTGCTG AGTCTGGTGT ACAACACAAA CCTTCAGCCC CGCAGGGAGG

601 CCGGCTAACC AGTGAACCCC AACCCCAGAG AGAAGGCTGT GGCTGCTAGT

651 GACCTCTTTG CTGTGGCCCC TCATTTGACC TTTCACCTCT GTCTGTTGGA

701 AGCAGTACTT TTTACTGCCT CATTGTCTTC TGTACATCTT ACTGGGTTTA

751 ATTAAAAAAA AAAAAAAAAA ACTCGAGGGG GG

<210>7

<211>215

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

1 Met Ala Thr Ala Pro Tyr Asn Tyr Ser Tyr Ile Phe Lys Tyr Ile

16 Ile Ile Gly Asp Met Gly Val Gly Lys Ser Cys Leu Leu His Gln

31 Phe Thr Glu Lys Lys Phe Met Ala Asp Cys Pro His Thr Ile Gly

46 Val Glu Phe Gly Thr Arg Ile Ile Glu Val Ser Gly Gln Lys Ile

61 Lys Leu Gln Ile Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Ala

76 Val Thr Arg Ser Tyr Tyr Arg Gly Ala Ala Gly Ala Leu Met Val

91 Tyr Asp Ile Thr Arg Arg Ser Thr Tyr Asn His Leu Ser Ser Trp

106 Leu Thr Asp Ala Arg Asn Leu Thr Asn Pro Asn Thr Val Ile Ile

121 Leu Ile Gly Asn Lys Ala Asp Leu Glu Ala Gln Arg Asp Val Thr

136 Tyr Glu Glu Ala Lys Gln Phe Ala Glu Glu Asn Gly Leu Leu Phe

151 Leu Glu Ala Ser Ala Lys Thr Gly Glu Asn Val Glu Asp Ala Phe

166 Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ile Tyr Gln Asn Ile Gln Asp Gly Ser

181 Leu Asp Leu Asn Ala Ala Glu Ser Gly Val Gln His Lys Pro Ser

196 Ala Pro Gln Gly Gly Arg Leu Thr Ser Glu Pro Gln Pro Gln Arg

211 Glu Gly Cys Gly Cys

Claims (10)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人hRAB-14蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第2649位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第2-649位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQ ID NO.7所示序列的多肽。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.6中从核苷酸第2-649位的核苷酸序列。

4.一种分离出的人hRAB-14蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。

7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8.一种产生具有人hRAB-14蛋白质活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)将编码具有人hRAB-14蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人hRAB-14蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第2-649位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hRAB-14蛋白的重组细胞；

(3)在适合表达人hRAB-14蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；

(4)分离出具有人hRAB-14蛋白活性的多肽。

9.一种能与权利要求4所述的人hRAB-14蛋白多肽特异性结合的抗体。

10.一种探针分子，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

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