CN112661831A

CN112661831A - 一种重组蛋白抗原、抗体及制备方法

Info

Publication number: CN112661831A
Application number: CN202110086892.1A
Authority: CN
Inventors: 裴杨莉; 李奎; 陈楚杰; 李华
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明公开了一种重组蛋白抗原、抗体及制备方法。所述重组蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ ID№.1所示。该重组蛋白具有与猪Rab32近似的抗原决定簇。以其作为抗原，通过动物免疫的方式可以快速、稳定地获得猪Rab32蛋白的多克隆抗体，从而为猪Rab32表达的研究工作提供技术支持。

Description

一种重组蛋白抗原、抗体及制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种重组蛋白抗原，免疫该抗原的多克隆抗体，以及其制备方法。

背景技术

Rab蛋白是小分子GTP结合蛋白家族中最大的亚家族，其作为囊泡运输的分子开关，在囊泡的形成、转运、粘附、锚定、融合等过程中均发挥作用。Rab32在许多组织都有表达，在动物肝脏内丰度较高，且参与线粒体、脂质合成，疾病发生等调控。目前的研究显示Rab32在猪脂肪细胞中很可能存在关键的调控作用，但机制不明，且Rab32在猪其他细胞中的功能研究也未见报道。目前国内市场中的没有针对猪的Rab32抗体，因此阻碍了对猪Rab32功能的深入研究。

发明内容

本发明目的在于提供一种重组蛋白抗原、抗体及制备方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。

本发明提供一种重组蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ ID№.1所示。

上述重组蛋白具有与猪Rab32近似的抗原决定簇。以其作为抗原，通过动物免疫的方式可以快速、稳定地获得猪Rab32蛋白的多克隆抗体，从而为猪Rab32表达的研究工作提供技术支持。

根据本发明的另一个方面，提出了编码上述重组蛋白的基因序列。进一步，其核苷酸序列如SEQ ID№.2所示。

根据本发明的再一个方面，提出了包含上述基因序列的表达载体。

根据本发明的再一个方面，提出了包含上述基因序列或上述表达载体的宿主细胞。

一种多克隆抗体，由权利要求1所述重组蛋白通过动物免疫方法制得。

上述多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)首次免疫：用所述重组蛋白与弗氏完全佐剂混匀后进行注射；

(2)加强免疫：用所述重组蛋白与弗氏不全佐剂混匀后进行注射；

每次免疫之间的间隔为10-15天，最后一次免疫后采血制成猪Rab32多克隆抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述加强免疫重复进行2-3次。

在本发明的一些实施方式中，所述加强免疫进行3次，然后间隔7天采血进行间接ELISA检测抗血清效价。

在本发明的一些实施方式中，多克隆抗体的制备方法还包括步骤：

(3)冲击免疫：用所述重组蛋白与生理盐水混匀后进行注射。

在本发明的一些实施方式中，免疫的动物为兔；优选地，为健康的雌性新西兰大白兔，4月龄。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：目前市场无针对猪Rab32的抗体，本发明填补了市场的空白。

附图说明

图1是多克隆抗体的Western blotting的结果图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，抗原处理

1-1.处理方式

初免抗原为重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化。

二免、三免、四免抗原为重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混匀乳化。

五免冲击为重组蛋白与等体积生理盐水混合，冲击免疫。

1-2.动物免疫

动物选用健康雌性新西兰大白兔，4月龄，2.1kg。

免疫过程包括：

初免：第1天，免疫用抗原为弗氏完全佐剂与重组蛋白；

二免：第14天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂与重组蛋白；

三免：第28天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂与重组蛋白；

四免：第42天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂与重组蛋白；

四免后采血：第49天，耳静脉采血1mL，ELISA检测抗血清效价；

五免：第56天，免疫用抗原为生理盐水+重组蛋白。

1-3.间接ELISA检测

将抗原用0.05mol/L碳酸盐(PH＝9.6)稀释至6μg/mL，100μL/孔，4℃孵育过夜，实现包被抗原。然后取出用0.05％Tween-20(PBST)洗涤三次，3分钟/次。再每孔加入含有5％脱脂奶粉(PBST)的封闭液150μL，37℃封闭120分钟。取出用0.05％Tween-20(PBST)洗涤三次，3分钟/次。将抗血清分别按照1:1000稀释，然后倍比稀释，至1:512K，37℃孵育1小时。取出用0.05％Tween-20(PBST)洗涤三次，3分钟/次。辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)。1:8000稀释，37℃孵育45分钟。取出用0.05％Tween-20(PBST)洗涤五次，3分钟/次。加入底物溶液(TMB)100μL/孔，反应5-10分钟，最后加入100μL2mol/L的硫酸终止反应。

1-4.测OD值

用酶标仪在450nm波长下测定OD值。

终放后抗血清效价检测的抗血清ELISA检测结果见表1。

表1

孔号	阴性	空白	1K	4K	16K	64K	128K
								A	0.036	0.093	2.744	2.507	2.074	1.433	0.892
B	0.042	0.094	2.716	2.460	1.955	1.323	0.798

备注：A，B表示两只不同的兔子来源的血清。1K：抗血清稀释1000倍，4K：抗血清稀释4000倍，16K：抗血清稀释16000倍，64K：抗血清稀释64000倍，128K：抗血清稀释128000倍。判定血清效价标准：血清效价值≥2.5×阴性值。Rab32的终放后抗血清效价:R1≥128K，R2≥128K。

实施例2，抗体western blotting检测

Western blotting方法来验证Rab32抗体与抗原的结核，具体步骤如下：

1.方法：使用蛋白裂解液提取猪肝脏总蛋白，BCA法检测蛋白浓度后，调整浓度使之一致，样品混匀后，99℃，5min蛋白变性。设定蛋白上样量40μg。

(1)制胶。玻璃板、固定架、梳子等用蒸馏水冲洗干净并晾干，固定玻璃板，根据凝胶试剂盒(PAGE凝胶制备试剂盒(10％)，EpiZyme)说明书配制分离胶及浓缩胶，分离胶位于下层，加无水乙醇封层。待分离胶凝固后，吸净无水乙醇。然后加入浓缩胶并立即在插入梳子。

(2)凝胶电泳。胶凝固后，将胶板组装于电泳槽中(正负极对应)，倒满1×电泳缓冲液(100mL 10×Tris-Glycine SDS Buffer加入到900mL蒸馏水中)。拔出梳子，依次加入适量的蛋白样品，蛋白marker(预染蛋白Marker 10-170KD，fermentas)上样体积为5μL。根据说明书设置程序进行电泳。

(3)转模电泳。提前配制好转膜液，准备NC膜、转膜槽、转膜架和板子。电泳结束后，采用三明治湿转法组装好转膜槽，整个装置置于冰中。设置程序200mA，2h进行转模。

(4)封闭。用50mL 1×TBST(10×TBST：蒸馏水＝1:9比例配制)充分溶解2.5g的脱脂奶粉，配制5％的脱脂奶粉封闭液(现用现配)，取出NC膜放入封闭液，摇床轻摇封闭2h。

(5)一抗孵育。封闭结束后，取出膜用1×TBST稍洗，以去除残留的封闭液。按照1:5稀释比例用1×TBST稀释Rab蛋白一抗，按照1:500稀释比例用1×TBST稀释内参一抗Tubulin(absin,abs131993)，然后切取目的蛋白和内参条带置于一抗工作液中，摇床4℃过夜或者室温孵育2h。

(6)二抗孵育。吸去一抗工作液，1×TBST洗膜3次，每次10min，并依照一抗种属反应性，选择二抗(羊抗兔IGg，武汉三鹰)，按照1:20000稀释比例用1×TBST稀释二抗，加入稀释好的二抗，摇床室温孵育40min。

(7)显影成像。吸去二抗工作液，1×TBST洗膜3次，每次10min。取出膜，滴加现配的显影液(BeyoECL Star(特超敏ECL化学发光试剂盒)，碧云天)覆盖NC膜，置于Tanon-5200全自动化学发光仪中依次显影照相。

2.结果：

如图1显示，图左从上到下依次为蛋白Marker的25kDa、15kDa和10kDa的条带，图右为Rab32多克隆抗体的Western blotting的结果图。根据资料显示，Rab32蛋白大小为24.86kDa，而图1中的蛋白大小恰好在蛋白Marker的25kDa条带附近，表明本发明设计的多克隆抗体能特异性识别Rab32蛋白，为合适的Rab32多克隆抗体。说明本发明方法制备而成的多克隆抗体能特异性结合Rab32蛋白抗原，具有一定的效果。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一种重组蛋白抗原、抗体及制备方法

<130> 2021

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Gly Gly Gly Ala Gly Asp Pro Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Pro Glu Thr Arg Glu His Leu Phe Lys Val Leu Val Ile Gly

20 25 30

Glu Leu Gly Val Gly Lys Thr Ser Ile Ile Lys Arg Tyr Val His Gln

35 40 45

Leu Phe Ser Gln His Tyr Arg Ala Thr Ile Gly Val Asp Phe Ala Leu

50 55 60

Lys Val Leu Asn Trp Asp Ser Arg Thr Leu Val Arg Leu Gln Leu Trp

65 70 75 80

Asp Ile Ala Gly Gln Glu Arg Phe Gly Asn Met Thr Arg Val Tyr Tyr

85 90 95

Lys Glu Ala Val Gly Ala Leu Val Val Phe Asp Ile Ser Arg Gly Ser

100 105 110

Pro Phe Glu Ala Val Leu Lys Trp Lys Asn Asp Leu Asp Ser Lys Val

115 120 125

His Leu Pro Asn Gly Ser Pro Ile Pro Ala Val Leu Leu Ala Asn Lys

130 135 140

Cys Asp Gln Lys Lys Asp Ser Gly Gln Asn Pro Ser Gln Met Asp Gln

145 150 155 160

Phe Cys Lys Glu His Gly Phe Thr Gly Trp Phe Glu Thr Ser Ala Lys

165 170 175

Asp Asn Ile Asn Ile Asp Glu Ala Ala Arg Phe Leu Val Glu Asn Ile

180 185 190

Leu Ala Asn His Gln Ser Phe Pro Ser Glu Glu Asn Asp Gly Arg Ile

195 200 205

Lys Leu Asp Glu Glu Thr Met Lys Lys Glu Asn Lys Ser His

210 215 220

<210> 2

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcggagctg gggaccccgg ccagggggcg gcggcggcgg ccgccgcggc gcccgagacc 60

cgcgagcacc tcttcaaggt gctggtcatc ggcgaactcg gcgtgggcaa gaccagcatc 120

atcaagcgct acgtccacca gctcttctcc cagcactacc gggccaccat cggggtggac 180

ttcgccctca aggtcctcaa ttgggacagc aggacgctag tgcgcctgca gctgtgggac 240

atcgcgggac aggaacggtt tggcaacatg acccgagtat attacaaaga agctgttggt 300

gctttggtcg tctttgatat atcgagaggc tccccatttg aagccgtttt aaaatggaaa 360

aatgatctgg atagtaaagt ccaccttcca aacggcagcc ctattcctgc tgttctctta 420

gctaacaagt gtgaccagaa aaaggacagt ggccagaatc cgtctcagat ggaccagttc 480

tgcaaagaac atggctttac tggatggttt gaaacctctg caaaggataa cataaacata 540

gatgaagcag cccggttcct agtggagaac attcttgcaa accaccaaag cttccccagt 600

gaagaaaacg atggcagaat taaactggat gaggagacca tgaaaaaaga gaacaagtcc 660

cac 663

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID№.1所示。

2.编码权利要求1所述重组蛋白的基因序列。

3.根据权利要求2所述的基因序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID№.2所示。

4.包含权利要求2或3所述基因序列的表达载体。

5.包含权利要求2或3所述基因序列或权利要求4所述表达载体的宿主细胞。

6.一种多克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述重组蛋白通过动物免疫方法制得。

7.权利要求6所述多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(2)加强免疫：用所述重组蛋白与弗氏不全佐剂混匀后进行注射；每次免疫之间的间隔为10-15天，最后一次免疫后采血制成猪Rab32多克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述加强免疫重复进行2-3次；优选地，所述加强免疫进行3次，然后间隔7天采血进行间接ELISA检测抗血清效价。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤：

(3)冲击免疫：加强免疫后间隔10-15天，用所述重组蛋白与生理盐水混匀后进行注射。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，免疫的动物为兔；

优选地，免疫的动物为新西兰大白兔，4月龄，雌性。