CN104861059B - 一种褐飞虱VgR多肽及其多抗制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种褐飞虱VgR多肽及其多抗的制备方法。所述的VgR多肽的氨基酸序列为：RKGNADQSVATKSD，其多克隆抗体制备步骤如下：（1）褐飞虱VgR蛋白抗原表位分析；(2) 褐飞虱VgR多肽设计与合成；(3) 合成多肽与载体蛋白交联；(4) 制备兔抗褐飞虱VgR多肽抗体；(5) 收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗褐飞虱VgR多肽的抗体。本发明得到的褐飞虱VgR多肽多克隆抗体特异性好、纯度高，可与褐飞虱VgR蛋白发生特异性结合发应，可用于褐飞虱VgR蛋白的相关研究，如其特性、功能、表达谱和含量的分析。

Description

一种褐飞虱VgR多肽及其多抗制备方法

技术领域

本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法，这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测，具体说就是一种兔抗褐飞虱VgR多肽多克隆抗体的制备方法。

背景技术

VgR全称为vitellogenin receptor，为卵黄原蛋白受体，是介导昆虫卵黄原蛋白胞吞作用的主要受体，它属于低密度脂蛋白家族。VgR在卵子发生等生殖过程中发挥着重要作用。经检索，目前市场上褐飞虱等昆虫VgR蛋白的抗体尚无商业化产品，限制了昆虫VgR蛋白生物学功能的深入研究。

发明内容

（1）本发明的目的在于提供一种VgR多肽，其序列为：RKGNADQSVATKSD。

（2）本发明的另一目的在于提供一种特异性好、纯度高、可与组织或细胞中天然VgR蛋白特异识别的VgR多肽多克隆抗体及其制备方法。

（3）所述的VgR多肽多克隆抗体通过以下技术方案实现：

步骤一：在合成所述多肽序列时，在其N端增加一个半胱氨酸，方便与载体蛋白偶联，用多肽自动合成仪合成VgR修饰多肽，纯化后与载体蛋白KLH偶联，形成VgR修饰多肽-KLH复合蛋白；

步骤二：将乳化后的VgR修饰多肽-KLH复合蛋白在兔背部皮下注射，初次免疫后，进行3次加强免疫；

步骤三：收集、分离得到含有兔抗褐飞虱VgR修饰多肽抗体的血清；

步骤四：将抗血清通过VgR多肽亲和层析柱进行肽亲和纯化，得到VgR多肽抗体；

步骤五：对VgR多肽抗体进行效价检测；

步骤六：通过免疫印迹和免疫荧光对VgR多肽抗体进行鉴定。

附图说明

图1为Western Blot图，图中免疫印迹的目的条带大小在200kDa左右，与VgR蛋白的理论分子量（215.2kDa）大小一致。

图2为免疫荧光图，图中的亮处为抗体反应的阳性信号。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例一 ：褐飞虱VgR序列的分析与VgR多肽的设计和合成

根据GenBank上的褐飞虱VgR序列（登录号：ADE34166），已知褐飞虱VgR蛋白序列包含1931个氨基酸，利用DNAstar软件中的Protean程序模块对褐飞虱VgR蛋白特性进行分析，得知该蛋白分子量为215198.74道尔顿，等电点为4.95，为酸性蛋白，进一步分析该蛋白氨基酸序列的抗原性、亲水性、表面可能性等特征，从中筛选到一段序列为RKGNADQSVATKSD的多肽序列适合用作抗原（1295aa—1308aa）。为便于与载体蛋白交联，增加多肽的免疫原性，在上述多肽的N末端增加一个半胱氨酸C，故最终待合成的多肽序列为CRKGNADQSVATKSD。多肽合成由多肽自动合成仪合成，合成的多肽用高效液相色谱仪（HPLC）检测纯度，纯度为85.2%，用MS 质谱仪检测多肽的分子量，其分子量为1579.65。

实施例二： 多肽与载体蛋白交联

采用MBS作为交联剂将载体蛋白KLH 与合成多肽进行交联：用交联缓冲液溶解KLH至浓度为10mg/mL；溶解MBS于DMF为10mg/mL；将溶解后的KLH溶液和MBS溶液按10：1（W/W）的比例混匀，室温激活KLH 30分钟；用Sephadex G‐25纯化激活的KLH溶液；将激活的KLH溶液与多肽溶液按1:1（W/W）混合，室温反应3小时；将上述反应液在PBS中4℃下透析过夜，得到多肽-KLH复合蛋白。

实施例三：实验动物的免疫

选取适龄的新西兰雄兔作为免疫动物，免疫前耳部静脉采血2-3mL，用作后续ELISA检测的阴性对照。首次免疫时，将0.5mg的多肽-KLH复合蛋白溶于0.5mL的PBS溶液中，与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化，兔子皮下多点注射。2周后，进行首次加强免疫，将0.5mg的多肽-KLH交联复合蛋白溶于0.5mL的PBS溶液中，与等体积的弗氏不完全佐剂充分混匀乳化，皮下多点注射，此后每隔3周进行同样操作的加强免疫，前后共3次。每次加强免疫1周后，从兔子耳部静脉采血微量，用间接ELISA法检测免疫血清效价，当效价达到1:20000以上，采用颈动脉放血的方式收集兔子血液，制备血清。

实施例四：VgR多肽亲和层析柱纯化抗体

将1mL活化的凝胶悬液注入层析柱，待柱内液体流干后，加入5mL的偶联缓冲液冲洗层析柱。用1mL偶联缓冲液溶解合成的VgR多肽，并加入层析柱，再加入1mL的偶联缓冲液至层析柱中，于4℃条件下旋转混匀过夜。用8mL偶联缓冲液冲洗层析柱，再用3mL的封闭液室温封闭1小时，用结合缓冲液冲洗层析柱3次，直至柱内液体流干，制备得到VgR多肽结合层析柱。向层析柱内加入含有VgR抗体血清的结合缓冲液，室温混匀1小时，用30mL冲洗缓冲液冲洗层析柱，直至流出液的A280nm吸收峰稳定。用15mL的洗脱缓冲液洗脱层析柱，获得纯化的VgR多抗。

实施例五：间接ELISA法测定抗体的效价

将VgR修饰多肽-KLH复合物包被ELISA板，4℃下过夜包被；用5%的脱脂奶粉室温封闭2小时；用VgR抗体作不同浓度稀释，1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000，室温2小时或4℃过夜孵育；加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔的二抗，室温孵育2小时；加入TMB进行显色反应，硫酸终止反应后测定450nm波长的吸光度。当与阴性血清的比值大于2.1时，计算抗体效价。经检测，纯化过后的VgR抗体的效价达到1:256,000。

实施例六：WesternBlot分析VgR抗体的特异性

按照标准方法配制 SDS-PAGE 凝胶， 将 10μL蛋白浓度为 5mg/ml 的组织裂解液加入垂直电泳槽的上样孔中，恒压80V电泳，待样品跑过浓缩胶，呈一条直线时，改换120V电压， 电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶时终止电泳，采用湿转膜方法恒压100V 电转90分钟，将蛋白转膜至NC膜。将实施例四获得的VgR抗体作为一抗，1:500稀释后，与上述湿转后的NC膜在室温下杂交2小时，然后用HRP标记的羊抗兔抗体在室温下杂交2小时，采用DAB显色法进行显色，得到免疫印迹结果。

实施例七：免疫荧光分析VgR抗体检测组织内VgR蛋白的表达情况

解剖出褐飞虱的卵巢，将卵巢用4％甲醛溶液固定后，用封闭液封闭，将实施例四获得的VgR抗体作为一抗，1:100稀释后，4℃过夜孵育，之后再以含有Dylight488标记的羊抗兔荧光二抗作为二抗，1:50稀释后，孵育1小时，清洗未反应的荧光二抗，用荧光防淬灭剂覆盖组织样品，观察荧光并拍照。本实施例的实验结果表明，VgR在褐飞虱卵巢中普遍表达。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国计量学院

<120> 一种褐飞虱VgR多肽及其多抗制备方法

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> Nilaparvata lugens

<223> 褐飞虱卵黄蛋白受体VgR多肽

<400> 1

Arg Lys Gly Asn Ala Asp Gln Ser Val Ala Thr Lys Ser Asp

1 5 10

Claims (5)

1.一种VgR多肽，其特征在于：氨基酸序列为RKGNADQSVATKSD。

2.一种兔抗褐飞虱VgR多肽的抗体制备方法，其特征在于：按权利要求1所述VgR多肽序列合成修饰多肽，将合成的修饰多肽与载体蛋白交联形成复合蛋白，用复合蛋白免疫动物，取免疫动物的血制备抗血清，从血清中分离纯化抗体。

3.根据权利要求2所述的一种兔抗褐飞虱VgR多肽的抗体制备方法，其特征在于：所述修饰多肽为在权利要求1的氨基酸序列尾端增加一个半胱氨酸残基，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白（KLH）或牛血清白蛋白（BSA），所述修饰多肽的巯基与所述载体蛋白的氨基通过交联剂共价交联形成复合蛋白。

4.根据权利要求3所述的一种兔抗褐飞虱VgR多肽的抗体制备方法，其特征在于：所述复合蛋白与免疫佐剂混合乳化后，在兔背部通过皮下注射，初次免疫后，通过3次加强免疫，得到抗血清。

5.根据权利要求4所述的一种兔抗褐飞虱VgR多肽的抗体制备方法，其特征在于：权利要求4中得到的抗血清经过多肽亲和纯化后可以从抗血清中获得高纯度的抗体。