CN101928334B - 一种鼠Ehf多肽及其抗体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白序列中部特异的鼠Ehf多肽以及抗体的制备方法，属于以抗体为特征的体外实验用的生物制品。蛋白序列中部特异的鼠Ehf多肽的氨基酸序列为：FTRAAGSAGQLLYS。抗鼠Ehf多肽抗体按以下方法制备：(1)鼠Ehf抗原表位分析；(2)鼠Ehf蛋白序列中部多肽合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔抗鼠Ehf多肽抗体；(5)收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗鼠Ehf多肽的抗体。本发明制备的蛋白序列中部特异的抗鼠Ehf合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然鼠Ehf发生特异性结合反应，制备成本低，纯化后的抗体可以用于免疫印迹和免疫组化。该抗体为Ehf蛋白的基础研究，比如对Ehf的特性、功能、表达谱和含量的分析，及其相关疾病的研究提供了一个重要的工具。
Description
1.技术领域
本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法，这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测。
2.背景技术
Ehf属于ETS蛋白家族，该蛋白作为一种转录激活因子调节上皮细胞的分化和增生。它可以作为ETS/AP-1响应基因特定亚型的抑制子。Ehf在丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路中发挥调节作用。该蛋白与包含GGAA的核心序列绑定，Ehf通过TNFRSF10B/DR5启动子的Ets结合序列参与调节TNFRSF10B/DR5复合物的表达。
经检索，除本发明中的抗Ehf抗体产品外，仅有Lifespan公司货号为LS-C40314的抗体为同类产品，但该公司未公布使用该抗体用于任何检测的数据。
有研究表明，Ehf蛋白在对前列腺上皮细胞的调控机制中发挥重要作用，可能在前列腺癌细中起到肿瘤抑制的作用(Cangemi R，Mensah A et al.Oncogene.2008 May 1；27(20)：2877-85)。这提示我们，Ehf蛋白可能成为一个潜在的具有基础研究和临床应用价值的药物作用靶点。
3.发明内容
本发明提供了一种Ehf多肽，其序列为：FTRAAGSAGQLLYS。用此多肽制备的抗Ehf抗体可以在免疫印迹(Western blot)及免疫组化(IHC)分析中特异识别组织或细胞中的天然Ehf蛋白。
抗Ehf抗体是通过以下步骤获得的：
步骤一：多肽序列的分析和设计：利用DNAstar软件对Ehf蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定Ehf蛋白93-106位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为FTRAAGSAGQLLYS。
步骤二：多肽合成和交联：采用ACT396全自动多通道多肽合成仪合成目的多肽，并采用质谱进行鉴定；为增强多肽的抗原性，将Ehf多肽与载体蛋白KLH采用Sulfo-SMCC交联法进行交联。
步骤三：多肽免疫和抗血清制备：将交联后的Ehf-KLH与弗氏佐剂混合乳化，在新西兰兔背部进行皮内注射免疫，并反复加强免疫，至取血检测抗体效价达到标准时停止免疫。
步骤四：抗体纯化：实验兔抗体效价达到标准后，采用心脏取血，分离抗血清，采用Protein A纯化全抗体后，进一步采用肽亲和纯化，得到目标抗体。
抗Ehf抗体是通过以下步骤鉴定的：
步骤一：免疫印迹：将所获得的Ehf抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法，用于检测抗原，确认该抗体能够与变性后的天然Ehf蛋白相互作用，可用于免疫印迹试验。
步骤二：免疫组化：将所获得的Ehf抗体作为一抗，采用标准的免疫组化方法，用于检测组织，确认该抗体能够与具有天然结构的Ehf蛋白相互作用，可用于免疫组化试验。
4.附图说明
图1为Western blot图，图中免疫印记的目的条带为33kDa，与Ehf蛋白的理论分子量一致。
图2为IHC图，图中箭头所指位置为抗体反应的阳性信号。
5.具体实施方式
1.多肽序列的分析和设计
利用DNAstar软件对Ehf蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定Ehf蛋白93-106位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为FTRAAGSAGQLLYS。同时，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在N末端增加一个半胱氨酸C，最终待合成多肽序列为CFTRAAGSAGQLLYS。
2.多肽合成和交联
采用ACT396全自动多通道多肽合成仪，按照编制好的程序自动合成目的多肽，将合成后的多肽溶于50％乙腈，采用质谱仪进行鉴定，确认所获得的多肽为目的多肽。采用Sulfo-SMCC作为交联剂将载体蛋白KLH与合成多肽进行交联：取10mg KLH溶于0.5ml超纯水中；取3mgsulfo-SMCC溶于0.5ml超纯水中，用3M NaOH调pH值7左右。在混匀情况下，把sulfo-SMCC溶液逐滴缓慢加入KLH溶液中，室温下旋转混匀反应物30min。将反应好的sulfo-SMCC/KLH混合液上样到预先用平衡缓冲液(0.05M PB，pH6.0)平衡过30min的Sephadex G25柱中，收集浅灰色洗脱液，即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ul PBS(pH7.3)溶解待2mg交联多肽，把0.2体积的sulfo-SMCC/KLH复合物溶液加入到多肽溶液中，调pH值到7.3，室温振摇4小时，-70冷冻后，用冻干机冻干24小时后备用。通过Ellman法检测交联前后多肽巯基确定多肽交联效率。
3.多肽免疫和抗血清制备
将交联好的KLH-多肽400μg溶于400μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化(至在水中不扩散为准)。采用兔龄3个月，体重1.75-2.25Kg的健康新西兰兔进行免疫，进行背部皮内注射免疫，至少要注射20点以上。首次免疫3周后，将300μg多肽溶于300μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行皮内免疫，作为第一次加强免疫，要求背部皮内注射免疫，至少要注射15点以上。第二次免疫3周后，进行第二次加强免疫，方法和要求同第一次加强免疫。1周后，采用耳缘静脉微量取血，用未交联的合成多肽包被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价。重复加强免疫和效价测定，直至血清效价达到1∶10000以上，采用心脏取血，标准方法获得抗血清。
4.抗体亲和纯化
TIgG纯化：用移液器将50％的Protein-A Sepharose混悬液10ml加到30ml层析柱中，去掉顶盖和底帽，液体流出后的柱床体积即为5ml，然后用25ml去离子水冲洗3遍。取出对应的血清10ml，与2ml PBS混合后加入30ml层析柱中，旋转混合器上室温(20-25℃)混旋1小时，让血清样品流出。再用15ml纯化洗液洗层析柱3次，加入10ml洗脱液进行洗脱。
肽亲和纯化：在层析柱中加入1ml Sulfo-link凝胶悬液(0.5ml凝胶)，待柱内液体流干，用4ml偶联缓冲液冲洗层析柱。用1ml偶联缓冲液溶解合成的Ehf多肽，并加入层析柱，再加入1ml偶联缓冲液至层析柱中，室温颠倒混匀1小时。用6ml偶联缓冲液冲洗层析柱，然后加入3ml封闭液，室温混匀1小时。冲洗层析柱3次，然后向层析柱内加入6ml IgG及3ml PBS，室温颠倒混匀1小时。用PBS冲洗层析柱3次，然后用2ml洗脱液洗脱。将所获得的纯化抗体装入透析袋内4℃透析。透析过夜，然后4000rpm×35min离心除沉淀，收集上清。用间接ELISA法测定抗体效价并用Bradford法测定蛋白浓度。
5.免疫印迹分析
按照标准方法配制SDS-PAGE凝胶，将5μl蛋白浓度为5mg/ml的组织裂解液加入上样孔中，恒压80V约30分钟，待样品跑过浓缩胶基本呈一条直线时，改换160V电压，电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶(约60分钟)时终止电泳，采用电转膜方法恒压100V电转80分钟转膜至PVDF膜。将所获得的Ehf抗体作为一抗，采用浓度为1μl/ml与上述转膜得到的抗原在室温下杂交1小时，然后用HRP标记的羊抗兔抗体在室温下杂交1小时，采用ECL显色法进行显色，在暗室中用X片进行显色和曝光，得到免疫印迹结果。
6.免疫组织化学分析
将4％甲醛溶液固定的组织切成1.5mm×1.5mm×2.0-3.0mm的组织块，乙醇梯度脱水后二甲苯透明30分钟，62℃石蜡浸蜡2小时后，在组织包埋机上将9种组织按照3×3的排列方式用石蜡进行包埋。采用标准石蜡切片方法将切好的4-5μm厚的组织芯片蜡片贴附于APES处理过的载玻片上，在烤片机60℃烤片1小时，然后在烤箱中60℃烤片6小时。采用标准免疫组化方法，室温下用100μl 10％羊血清于湿盒中封闭切片30分钟，加入100μl浓度为2-4μg/ml的Ehf抗体，湿盒中4℃过夜，PBS清洗后加入生物素标记羊抗兔IgG于湿盒中37℃孵育30分钟，然后PBS清洗后加入HRP标记的链霉卵白素浓缩液，湿盒中37℃孵育30分钟，洗片后1％DAB显色，苏木素复染，复蓝，脱水，透明，封片，镜检，检查结果并拍照。
序列表
FTRAAGSAGQLLYS
Claims (6)
1.一种鼠Ehf多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列为：FTRAAGSAGQLLYS。
2.一种抗鼠Ehf多肽的抗体制备方法，其特征在于按权利要求1所述序列合成N端修饰肽，将合成的N端修饰肽与载体蛋白交联，用交联的肽免疫动物，取免疫动物的血制备抗血清，从血清中分离纯化IgG，其中所述的N端修饰为在氨基酸序列的N端增加一个半胱氨酸残基。
3.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)。
4.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于N端修饰肽通过交联剂将其巯基与载体蛋白氨基共价交联。
5.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于交联肽与免疫佐剂混合乳化后，在兔背部通过多点皮下注射，并经二次以上加强免疫，血清的效价大于1∶10000。
6.根据权利要求2所述的抗体制备方法，其特征在于经过硫酸铵沉淀、蛋白A亲和纯化以及肽亲和纯化可以从抗血清中获得高纯度的IgG。
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