CN103788210A

CN103788210A - 一种磷酸化芳香化酶的特异性抗体

Info

Publication number: CN103788210A
Application number: CN201210422626.2A
Authority: CN
Inventors: 崔玉坤; 周克湘; 孔丽; 陈熹鹏; 吴晓; 彭志兰
Original assignee: Shantou University Medical College
Current assignee: Shantou University Medical College
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2014-05-14

Abstract

本发明公开了一种磷酸化芳香化酶的特异性抗体，所述抗体是针对Tyr361位点磷酸化的芳香化酶的特异性抗体。所述抗体制备时采用针对芳香化酶中Tyr361磷酸化位点设计的抗原多肽，该抗原多肽的具体序列为：VMENPIPpYSMRY，该序列中pY为磷酸化的氨基酸。本发明的磷酸化芳香化酶的特异性抗体，能够用于检测Tyr361位点磷酸化的芳香化酶的表达情况，进而检测pY361芳香化酶水平，以预测和研究芳香化酶抑制剂的耐药性。

Description

一种磷酸化芳香化酶的特异性抗体

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种磷酸化芳香化酶的特异性抗体及试剂盒。

背景技术

乳腺癌是全球最常见的女性恶性肿瘤。实验室及临床数据均证实，约三分之二的乳腺肿瘤是雌激素受体(ER)阳性的。这部分乳腺癌的形成和进展与雌激素有关(1)。雌激素对乳腺肿瘤的作用是通过雌激素受体(ER)来调节的。以三苯氧胺(TAM)和芳香化酶抑制剂(aromatase inhibitors，AI)为主的靶向ER的内分泌治疗是治疗ERα阳性乳腺癌的最常用的方法之一(2-5)。作为绝经后妇女体内雌激素合成系统的限速酶，芳香化酶(aromatase)是乳腺癌治疗的一个重要的靶点。近期的临床研究数据表明，芳香化酶抑制(aromataseinhibitors，AI)单独使用或与三苯氧胺联合治疗可以进一步改善疾病(3-4)，但是有一部分ER阳性患者在一开始即对此治疗不敏感，而多数在治疗初期有效的患者最终还是不可避免的会出现耐药性。如何预测其抑制剂(aromataseinhibitors，AI)耐药性的发生则成为临床中重要的问题之一。

芳香化酶(aromatase)是利用睾酮合成雌激素的限速酶(7-8)，其表达是组织特异性的(9)。女性在绝经前的雌激素主要通过卵巢合成，由于增高的卵泡刺激激素作用，AI的治疗是无效的。绝经后的雌激素主要由外周组织，包括乳房合成(8)。因此AI主要应用于绝经后的患者(7)。

已有研究发现芳香化酶可以被雌激素激活的c-src激酶所磷酸化，(10)磷酸化位点是第361位的酪氨酸(Y)。另外研究表明，c-src激酶的抑制剂AZ0530可逆转乳腺细胞对AI的耐药，而AI本身可以激活c-src激酶(11)。这些结果提示c-src激酶对芳香化酶的磷酸化可能是AI发生的原因，而芳香化酶第361位的酪氨酸的磷酸化则可能是可用于指示AI耐药发生的一个标志物。我们通过序列分析，发现Y361存在于一个潜在的PI3K的结合位点YXXM(Y=酪氨酸，M=甲硫氨酸，X=任意氨基酸)中(12)，我们前期工作表明芳香化酶在细胞内可以和PI3K调节亚基P85结合，而抑制c-src的活性则可以阻断这种结合，提示芳香化酶的Y361确实存在于一个PI3K的结合位点中。因此我们推测芳香化酶Y361的磷酸化可以引发与PI3K的结合而介导PI3K活化，从而导致AI耐药发生，而芳香化酶Y361的磷酸化水平则可用于预测乳癌组织对AI的敏感性。而本技术则正是研发了此特异识别Y361磷酸化芳香化酶的抗体。

发明内容

有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供一种磷酸化芳香化酶的特异性抗体，用以检测Tyr361位点磷酸化的芳香化酶(pY361芳香化酶)的表达情况，以预测和研究芳香化酶抑制剂的耐药性。

另外，本发明所解决的技术问题还在于提供一种检测磷酸化芳香化酶抗体的试剂盒，以便检测pY361芳香化酶抗体的效价。

本发明通过下列技术方案解决上述技术问题：

一种磷酸化芳香化酶的特异性抗体，所述抗体是针对Tyr361位点磷酸化的芳香化酶的特异性抗体。

优选地，所述抗体制备时采用针对芳香化酶中Tyr361磷酸化位点设计的抗原多肽，该抗原多肽的具体序列为：VMENPIPpYSMRY，该序列中pY为磷酸化的氨基酸。

优选地，所述抗原多肽N-端被乙酰基化以维持其稳定性，该抗原多肽偶联于载体蛋白KLH上。

优选地，所述磷酸化芳香化酶的特异性抗体通过以下方法获得：通过人工合成所述抗原多肽后，采用偶联剂将抗原多肽偶联到载体蛋白KLH上，形成适合动物免疫的KLH-多肽抗原系统，然后经动物免疫产生磷酸化芳香化酶的特异性抗体；再经过抗血清制备和抗体分离纯化，最终获得抗Tyr361位点磷酸化芳香化酶的特异性抗体。

ELISA测试表明：本发明的磷酸化芳香化酶特异性抗体，对Tyr361位点磷酸化芳香化酶具有高度的结合专一性，而与此位点非磷酸化的芳香化酶结合力极低。

更优更具体地说，所述磷酸化芳香化酶的特异性抗体，是采用如下方法获得的抗体：

(1)抗原多肽的设计与合成：依据蛋白质数据库中芳香化酶的序列信息，设计出对应芳香化酶的Tyr361磷酸化氨基酸位点两侧一段连续的抗原多肽；并将抗原多肽N-端被乙酰基化以维持其稳定性，抗原多肽的具体序列为VMENPIPpYSMRY，该序列中pY为磷酸化的氨基酸；

(2)通过人工合成Tyr361位点磷酸化的所述抗原多肽后，同时合成与抗原多肽相同序列的但Tyr361位点未磷酸化的阴性抗原多肽；

(3)通过偶联剂将抗原多肽偶联到载体蛋白KLH 上，形成适合动物免疫的KLH-多肽抗原系统；另外，将所述抗原多肽和阴性抗原多肽分别偶联到载体BSA上，用做ELISA检测时用的包被抗原；

(4)动物免疫与阳性血清的采集：

动物免疫过程：

1、免疫之前将偶联到载体蛋白KLH上的多肽用生理盐水稀释成0.25mg/ml。

2、每只兔子按照表1中的方案进行免疫：

表1

天数 0 1 14 28 38 50 60

注射 0 1mg 0.75mg 0.75mg 0.75mg 0.75mg 0.5mg

采血 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2 2+20ml

3、第一次注射1mg多肽，注射时用等体积的弗氏佐剂充分乳化，经背部皮下多点注射。以后每次免疫量为0.75mg,注射时用不完全弗氏佐剂将抗原也充分乳化，经背部皮下多点注射。(具体时间按表1执行)。

4、阳性血清采取：兔子免疫两次之后开始(即从第三次免疫前开始)，兔子饥饿24h后，经耳缘静脉(或者髂内静脉)取血，约3-5ml左右。

(5)取血后，37℃下，在不加抗凝剂的条件下让血液凝固1到2小时；当血清自然析出后，取上清液4℃，3000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物；将血清移至一干净试管，并分装成小份，不加防腐剂储藏在-20℃冰箱中。血清即为抗体(多克隆抗血清)。

在后续步骤中可以通过如下方式对血清中的是否含有磷酸化芳香化酶的特异性抗体，即目的蛋白进行鉴定：

1、ELISA：可初步检测抗血清抗体效价，以便下一步用Western Blot检测目的蛋白。

2、Western Blot：背景：MCF-7不表达磷酸化芳香化酶，而SKBR3表达磷酸化芳香化酶，而在无血清培养条件下24h后磷酸化芳香化酶表达更高。因此选用这两种细胞做抗体的特异性检测。具体步骤如下：

1)．用抗血清检测上述三种细胞裂解液内的蛋白。

2).用抗血清加抗原反应后的抗血清检测上述三种细胞裂解液内蛋白。

3).以上两步检测成功后，加一组细胞裂解液：为SKBR3+无血清培养下PP2(为c-src激酶抑制剂可逆转乳腺细胞对AI的耐药，购自SIGMAP0042-5mg)，此组细胞裂解液内磷酸化芳香化酶表达降低，说明这种磷酸化的芳香化酶表达高低可为PP2逆转，从而证明研发抗体的特异性。

4).用CYTOCHROME P450AROMATASE抗体(检测未磷酸化的芳香化酶蛋白条带约在55kd左右)检测3中四组细胞裂解液内蛋白表达情况，结果：MCF-7组不会出现条带，其他组细胞裂解液内可出现相应条带。从而说明该抗体为特异性检测芳香化酶中Tyr361磷酸化位点的蛋白的抗体。

3、免疫组化：用该抗血清检测乳腺癌组织内芳香化酶中Tyr361磷酸化位点的蛋白，会在细胞浆内见染色，而用相应抗原(免疫兔子用的抗原)中和反应后的抗血清检测则会出现阴性结果。从而说明该抗体能在免疫组化中应用。

另外，本发明提供的一种检测磷酸化芳香化酶抗体的试剂盒，包括抗体检测板和ELISA反应液，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括包被抗体检测板的包被抗原，所述抗原为针对芳香化酶中Tyr361磷酸化位点设计的抗原多肽。

优选地，所述抗原多肽的具体序列为：VMENPIPpYSMRY，该序列中pY为磷酸化的氨基酸。

优选地，所述抗原多肽N-端被乙酰基化以维持其稳定性，该抗原多肽偶联于载体蛋白BSA上。

优选地，试剂盒中ELISA反应液包括：酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，酶结合物工作液，阳性对照包括磷酸化芳香化酶特异性抗体标准品和非磷酸化芳香化酶特异性抗体标准品，阴性对照为无芳香化酶特异性抗体的阴性血清，所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG。

另外，本发明还公开了按上述方法获取的磷酸化芳香化酶特异性抗体在制备测定Tyr361位点磷酸化芳香化酶的试剂盒中的应用。

对于上述本发明的技术方案，pY361芳香化酶作为预测AI耐药的分子标志物，本发明通过合成一下短肽：VMENPIPpYSMRY,这一短肽对应人芳香化酶蛋白第354-第365氨基酸，pY代表磷酸化的Y361，N-端将被乙酰基化以维持其稳定性。这一短肽连接KLH后用来免疫动物以制备抗血清，多余(6mg是未偶联的多肽粉末)的将用来制备ELISA以测定效价，抗体的特异性以及敏感性用MCF-7(阴性)、SKBR3(阳性)细胞株来鉴定。这些抗体在免疫组织化学中的应用将通过本院现有的组织标本来确定。进而将该抗体做成试剂盒，进行免疫组化来检测pY361芳香化酶水平从而预测和研究芳香化酶抑制剂耐药。

附图说明

图1为本实施例2中用抗血清检测阴性对照MCF-7、SKBR3、hSKBR3即无血清培养24h、SKBR3+无血清培养下PP2的细胞裂解液免疫印迹实验结果图；

图2为CYTOCHROME P450AROMATASE抗体(购自AbD serotec公司)检测上述四种细胞裂解液内CYTOCHROME P450芳香化酶表达情况；

图3为实施例3中Tyr361位点磷酸化芳香化酶高表达情况下病理切片示意图；

图4为实施例3中Tyr361位点磷酸化芳香化酶低表达情况下病理切片示意图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。

实施例1抗Tyr361位点磷酸化芳香化酶的抗体的制备

按照如下步骤制备针对Tyr361位点磷酸化的芳香化酶的特异性抗体：

(3)通过偶联剂将抗原多肽偶联到载体蛋白KLH上，形成适合动物免疫的KLH-多肽抗原系统；另外，将所述抗原多肽和阴性抗原多肽分别偶联到载体BSA上，用做ELISA检测时用的包被抗原；

(4)动物免疫与阳性血清的采集：

动物免疫过程：

2、每只兔子按照表1中的方案进行免疫：

表1

天数 0 1 14 28 38 50 60

注射 0 1mg 0.75mg 0.75mg 0.75mg 0.75mg 0.5mg

采血 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2 2+20ml

3、第一次注射1mg多肽，注射时用等体积的弗氏佐剂充分乳化，经背部皮下多点注射。以后每次免疫量为0.75mg，注射时用不完全弗氏佐剂将抗原也充分乳化，经背部皮下多点注射。(具体时间按上表执行)。

(5)取血后，37℃下，在不加抗凝剂的条件下让血液凝固1到2小时；当血清自然析出后，取上清液4℃，3000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物；将血清移至一干净试管，并分装成小份，不加防腐剂储藏在-20℃冰箱中。

采用化学连接法把多肽抗原(VMENPIPpYSMRY，该序列中pY为磷酸化的氨基酸)偶联到GEL上以制备出亲和层析用的抗原柱。采集的阳性血清经0.45um滤器过滤，并添加10％的pH 7.6Tris-HCL缓冲液(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)调节pH然后将血清与偶联了磷酸化多肽抗原的亲和层析GEL混合4℃缓慢搅拌过夜，第二天将其装入层析柱中，以10mM PBS洗完柱后用pH 2.8的甘氨酸溶液洗柱，手机OD280≥0.15的洗脱液并迅速调节pH中性，该洗脱液中包含了抗此P太对应微点氨基酸磷酸化看题，进一步讲洗脱液与偶联了对应N肽的亲和柱结合去除其中混有的其他抗体，收集其穿透液进行透析、浓缩、添加甘油保护剂，最终获得了抗此肽对应微点氨基酸磷酸化的兔多克隆抗体成品。(即选用VMENPIPpYSMRY，该序列中pY为磷酸化的氨基酸多肽制备其特异性抗体)。

其中，以BSA-多肽抗原包被的酶标板做ELISA测试，数据(见表2)显示了按照上述方法制备的抗体的高效价和对指定位点磷酸化芳香化酶高度的专一性(在抗体对Tyr361位点磷酸化的芳香化酶的OD值远高于对对应Tyr361位点未磷酸化的芳香化酶的OD值)。ELISA测试具体包括如下步骤：

1．用50mM的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)溶解抗原，使抗原浓度为10μg/ml，加100μg孔到96孔酶标板，4°C放置过夜。

2．第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150μl 1％BSA 37°C封闭1个半小时。

3.PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗(goat ant-ribbitIgG-HRP：sc-2030，SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC)，37°C孵育1小时。

4.PBST洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品(未免疫兔血清)，37°C孵育2小时。

5.PBST洗涤5次后，显色剂显色20min后，加终止液50μl终止反应，酶标仪上读取A₄₅₀吸收值

6.结果详见表2(均为平均值，每个浓度梯度设置四个复孔。)

表2

如表2中数据显示，按照上述方法制备的抗体的高效价和对指定位点磷酸化芳香化酶高度的专一性。

实施例2免疫印迹法对SKBR3细胞株中Tyr361位点磷酸化芳香化酶的检测

一、溶液和试剂：

1×磷酸盐缓冲液(PBS)

改性的RIPA缓冲液(Tris-HCl；50mM，pH 7.4；NP-40：1％；Na-deoxycholate：0.25％；NaCl：150mM；EDTA：1mM；PMSF：1mM；Aprotinin，leupeptin，pepstatin：1microgram/ml each；Na3VO4：1mM；NaF：1mM)

1×SDS样品缓冲液：62.5mM Tris-HCl(pH 6.8于25°C)，2％w/v SDS，10％甘油，50mM DTT，0.01％w/v溴酚蓝

转移缓冲液：25mM Tris base，0.2M甘氨酸，20％甲醇(pH 8.3)

10×Tris缓冲盐(TBS)：准备1L 10×TBS：24.2g Tris base，80g NaCl；用1N HCl调pH为7.6

脱脂奶粉，BSA

甲醇

TBS/T缓冲液：1×TBS，0.1％Tween-20

封闭缓冲液(TBS/T)：1×TBS，0.1％Tween-20加5％w/v脱脂奶粉

一抗的稀释：1×TBS，0.1％Tween-20加5％BSA

二抗的稀释：1×TBS，0.1％Tween-20加5％脱脂奶粉

二、按照如下步骤制备样品：

1、培养细胞，SKBR3，MCF-7(10％牛血清DMEM中瓶培养瓶内培养)。

2、弃培养基，用1×PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。

3、加入1×SDS样品缓冲液，刮落细胞，转移到Ep管，在冰上操作

4、煮沸样品5minutes。

5、离心12000g，5min，取上清。

6、用RIPA裂解液(1ml per 10⁷cells/100mm dish/150cm²flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min(4℃)，弃沉淀，测蛋白浓度。

三、上样：

1、用1mm玻璃板，10空梳子，上样量MARKER：8μl，SKBR3，hSKBR3,MCF-7，分别上40μg。

2、用5×SDS上样Buffer配好上样体积，按上述顺序加入每个泳道，80V跑30min，100V 90min。

四、转膜：

1.将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。

2.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min，PVDF膜先用纯甲醇浸泡饱和10秒钟，再用蒸馏水平衡2min，最后置于转移缓冲液平衡20min。

3.装配转移三明治：海绵→3层滤纸→胶→膜→3层滤纸→海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。

4.将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液，插上电极，100V，1h(电流约为0.3A)。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

五、免疫杂交与显色：

1、用25ml TBS洗膜5min，室温，摇动。

2、置膜于25ml封闭缓冲液(5％牛奶TBST)中2h，室温，摇动。

3、15ml TBS/T洗3次(5min/T)。

4、将膜从MRKER中间竖切成两片：A、加入抗血清一抗3ml(含5％BSA稀释至TBST稀释1∶500)，4°C摇床过夜；B、加入抗血清一抗2ml和前述做ELISA用抗原母液1ml(抗血清一抗同A，抗原母液浓度为100μg/ml)，4°C摇床过夜。

5、15ml TBS/T洗3次(5min/T)。

6、辣根过氧化酶(H RP)标记的二抗(山羊抗兔，用含5％牛奶的TBST稀释至1∶3000)，室温孵育1h，缓慢摇动。

7、15ml TBS/T洗3次(5min/T)。

8、15ml TBS洗1次。

9、用化学发光液曝光。

实验结果如图1-2所示，其中，MCF-7不表达芳香化酶，SKBR3是高表达芳香化酶的乳腺癌细胞株，hSKBR3细胞裂解液为无血清培养基24h后提取蛋白，SKBR3+pp2细胞裂解液为SKBR3无血清培养基+pp224h后提取蛋白。图1如预期在SKBR3细胞裂解液内检测到我们的目的条带，大概72KD-55KD之间；SKBR3无血清培养下+PP2，此组细胞裂解液内磷酸化芳香化酶表达降低，阴性对照MCF-7细胞裂解液内未检测到目的蛋白条带；图2为CYTOCHROME P450AROMATASE抗体(购自AbD serotec公司)检测上述四种细胞裂解液内CYTOCHROME P450芳香化酶表达情况，可见SKBR3内该蛋白表达未受影响。

实施3抗Tyr361位点磷酸化芳香化酶的抗体以免疫组化法检测ER阳性乳腺癌病人病理切片

按如下步骤进行试验：

1．石蜡切片脱蜡至水：(石蜡切片染色前应置60℃ 30分钟)。

(1)二甲苯I、II，各10分钟。

(2)梯度酒精：100％，2分钟→95％，2分钟→80％，2分钟→70％2分钟。

(3)蒸馏水洗：5分钟，2次(置于摇床)。

2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3％H₂O₂，室温10分钟(避光)。

3．蒸馏水洗：5分钟，2次(置于摇床)。

4．抗原修复：抗原修复液(10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液)

微波处理技术：用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择高档，5min，取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择低档，15min。

5．PBS：5分钟，2次(置于摇床)。

6．滴加第一抗体：滴加第一抗体，置于4℃冰箱过夜。

附配液方式：

A：阳性对照抗体：0.1％牛血清白蛋白的PBST溶液稀释至1∶3000μl

B：阴性对照抗体：0.1％牛血清白蛋白的PBST溶液稀释至1∶3000100μl+100μg/ml抗原溶液10μl

7．PBS：5分钟，2次(置于摇床)。

9．滴加生物素化的二抗，37℃，25分钟。

10．PBS：5分钟，2次(置于摇床)。

11．DAB显色，镜下观察，3分钟左右终止(蒸馏水冲终止)。

12．自来水(细水)充分冲洗。

13．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。

14．自来水冲洗返蓝，15分钟。

15．梯度酒精脱水：80％，2分钟→95％，2分钟→100％，2次，5分钟。

16．二甲苯透明：

I，II(二甲苯)各5分钟

17．封片：中性树胶封片。

免疫组化学实验完成后，切片置于光学显微镜下观察，取代表性的视野拍照分析，结果如图3-4所示，可见抗Tyr361位点磷酸化芳香化酶抗体在本试验中都检测到了阳性，用该抗血清检测乳腺癌组织内芳香化酶中Tyr361磷酸化位点的蛋白，会在细胞浆内见染色，而用该抗血清与相应抗原(免疫兔子用的抗原)中和反应后的抗血清检测则会出现阴性结果。其中，图3为阳性对照抗体：0.1％牛血清白蛋白的PBST溶液稀释至1∶3000100μl溶液，Tyr361位点磷酸化芳香化酶高表达。图4为阴性对照抗体：0.1％牛血清白蛋白的PBST溶液稀释至1∶3000100μl+100μg/ml抗原溶液10μl，Tyr361位点磷酸化芳香化酶低表达。从而说明该抗体在免疫组化中应用的特异性，以预测ER阳性患者对芳香化酶抑制剂(AI)耐药(表达强说明对AI耐药，表达低说明对AI敏感)。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种磷酸化芳香化酶的特异性抗体，其特征在于，所述抗体是针对Tyr361位点磷酸化的芳香化酶的特异性抗体。

2.根据权利要求1所述的磷酸化芳香化酶的特异性抗体，其特征在于，所述抗体制备时采用针对芳香化酶中Tyr361磷酸化位点设计的抗原多肽，该抗原多肽的具体序列为：VMENPIPpYSMRY，该序列中pY为磷酸化的氨基酸。

3.根据权利要求2所述的磷酸化芳香化酶的特异性抗体，其特征在于，所述抗原多肽N-端被乙酰基化以维持其稳定性，该抗原多肽偶联于载体蛋白KLH上。

4.根据权利要求3所述的磷酸化芳香化酶的特异性抗体，其特征在于，所述磷酸化芳香化酶的特异性抗体通过以下方法获得：通过人工合成所述抗原多肽后，采用偶联剂将抗原多肽偶联到载体蛋白KLH上，形成适合动物免疫的KLH-多肽抗原系统，然后经动物免疫产生磷酸化芳香化酶的特异性抗体；再经过抗血清制备和抗体分离纯化，最终获得抗Tyr361位点磷酸化芳香化酶的特异性抗体。

5.根据权利要求3所述的磷酸化芳香化酶的特异性抗体，其特征在于，所述磷酸化芳香化酶的特异性抗体，是采用如下方法获得的抗体：

(4)动物免疫与阳性血清的采集：

免疫之前将偶联到载体蛋白KLH上的多肽用生理盐水稀释成0.25mg/ml；而后每只兔子按照表1中的方案进行免疫：

第一次注射1mg多肽，注射时用等体积的弗氏佐剂充分乳化，经背部皮下多点注射。以后每次免疫量为0.75mg，注射时用不完全弗氏佐剂将抗原也充分乳化，经背部皮下多点注射；

阳性血清采取：兔子免疫两次之后开始，兔子饥饿24h后，经耳缘静脉或者髂内静脉取血，约3-5ml左右；

(5)取血后，37℃下，在不加抗凝剂的条件下让血液凝固1到2小时；当血清自然析出后，取上清液4℃，12000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物；将血清移至一干净试管，并分装成小份，不加防腐剂储藏在-20℃冰箱中。

6.一种检测磷酸化芳香化酶抗体的试剂盒，包括抗体检测板和ELISA反应液，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括包被抗体检测板的包被抗原，所述抗原为针对芳香化酶中Tyr361磷酸化位点设计的抗原多肽。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗原多肽的具体序列为：VMENPIPpYSMRY，该序列中pY为磷酸化的氨基酸。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗原多肽N-端被乙酰基化以维持其稳定性，该抗原多肽偶联于载体蛋白KLH上。

9.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中ELISA反应液包括：酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，酶结合物工作液，阳性对照包括磷酸化芳香化酶特异性抗体标准品和非磷酸化芳香化酶特异性抗体标准品，阴性对照为无芳香化酶特异性抗体的阴性血清，所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG。

10.一种权利要求1所述的磷酸化芳香化酶的特异性抗体在制备测定Tyr361位点磷酸化芳香化酶的试剂盒中的应用。