CN105646714A - 一种抗topk第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗TOPK第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体，属于生物和疾病诊断领域。该抗体是将氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示的多肽与载体蛋白偶联，用作抗原，并用该抗原免疫动物，得到多抗血清，纯化后得到的。该抗体能应用于肿瘤细胞水平的免疫印迹方法检测，目前市面上尚无针对TOPK？Y74磷酸化检测的任何抗体，本发明为肿瘤发生的研究及肿瘤的早期诊断及预后预测治疗打下了坚实的基础。

Description

一种抗TOPK第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物和疾病诊断领域，具体涉及一种抗TOPK第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体，本发明还涉及该抗体的制备方法和应用。

背景技术

TOPK，又名PBK，即PDZ连接激酶及淋巴因子激活的杀伤性T淋巴细胞源性蛋白激酶，其作为一种新的丝-苏氨酸蛋白激酶[1,2]，在乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肺癌、白血病等[3]多种肿瘤细胞中呈高表达，并且表达量与乳腺癌和结直肠癌的恶性程度明显相关[4]。TOPK参与了肿瘤细胞周期进程[5-8]、肿瘤细胞转化[9,10]、增殖[11]和凋亡[12,13]等功能的调控。

近年越来越多的研究发现TOPK在肿瘤的临床诊断以及预后预测中发挥了重要作用。2010年ZlobecI等探讨了在2000例结肠癌病例中TOPK的预后价值，提出TOPK高表达的病例预后差，同时提出TOPK高表达的病例与酪氨酸激酶抑制剂的耐受有关，TOPK抑制剂的发现将惠及30-40％结肠癌患者。另外，该研究组还指出TOPK激活相关机制的研究将对克服酪氨酸激酶抑制剂的耐受有重要意义[14]。DeschoolmeesterD等认为TOPK是结肠癌的最有价值的肿瘤标志物之一，与之相关的靶向治疗应逐步展开[15]。也有文献报道TOPK在肺癌中的表达与Ki67(细胞增殖标记物)和p53密切相关，可能会成为非小细胞肺癌独立的预后指标[16]。ShihMC等也认为TOPK通过调控PI3K/AKT/PTEN信号通路影响肺癌细胞的转移，并可作为肺癌预后的指标和潜在的治疗靶点[17]。另外，ChenF[18]等报道称TOPK表达水平在人肝癌组织和细胞系中显著上调，在肝癌SMMC-7721细胞中基因沉默TOPK后导致细胞周期停滞，抑制细胞生长和肿瘤形成，暗示着TOPK可能调节肝细胞的增殖，可能会成为肝癌有意义的分子靶点和预后标志物。Jae-Hyun等[19]在对81例乳腺癌的全基因组表达谱进行分析后发现TOPK上调，并且在其细胞的有丝分裂早期呈高表达，可能通过磷酸化HistoneH3促进有丝分裂，从而增强肿瘤细胞的增殖。除此之外，HuF[20]等人发现Myc–E2F1–TOPK信号通路在恶性淋巴瘤中起着调控作用，TOPK可能会成为淋巴瘤免疫治疗中的靶点。

随着研究的深入，TOPK正逐渐成为新的肿瘤发生的标志物和抗肿瘤治疗的靶点。然而，目前对于TOPK的研究，两个重要的研究瓶颈逐渐显现出来。一是TOPK晶体结构解析困难，导致其抑制剂领域的研究进行缓慢，阻碍了其用于临床疾病诊断和治疗的发展前景。其次是TOPK的上游调控机制尚不完全清楚，目前已有报道hDlg[2]，ERK2[9]，c-Myc-E2F1[20]，P53[21]，E2F-CREB/ATF[22]和Cdk1/CyclinB[1,23]能与TOPK相互作用并调节其功能。但是，非磷酸化的TOPK表达并不能准确体现TOPK在细胞内的活性，目前仅有研究表明蛋白激酶Cdk1/CyclinB和ERK2能在Thr9位点磷酸化激活TOPK，且研究证实Thr9位点磷酸化与TOPK促进肿瘤发生的关系无关。因此，进一步寻找与肿瘤关系密切的TOPK磷酸化修饰机制，即TOPK的上游激酶及磷酸化作用位点，并开发相应位点的磷酸化抗体，将有利于扩展TOPK在临床诊断、治疗方面的实际应用。

参考文献：

1.AbeY,MatsumotoS,KitoK,etal.CloningandexpressionofanovelMAPKK-likeproteinkinase,lymphokine-activatedkillerT-cell-originatedproteinkinase,specificallyexpressedinthetestisandactivatedlymphoidcells.JBiolChem2000；275:21525–21531.

2.GaudetS,BrantonD,LueRA.CharacterizationofPDZ-bindingkinase,amitotickinase.ProcNatlAcadSci2000；97:5167–5172.

3.DoughertyJD,GarciaAD,NakanoI,etal.PBK/TOPK,aproliferatingneuralprogenitor-specificmitogenactivatedproteinkinasekinase.JNeurosci,2005；25(46):1077-10785.

4.NandiA,TidwellM,KarpJ,etal.ProteinexpressionofPDZ-bindingkinaseisup-regulatedinhematologicmalignanciesandstronglydown-regulatedduringterminaldifferentiationofHL-60leukemiccells.BloodCellsMolDis,2004；32(1):240-245.

5.MatsumotoS,AbeY,FujibuchiT,etal.CharacterizationofaMAPKK-likeproteinkinasePBK/TOPK.BiochemBiophysResCommun2004；325:997–1004.

6.ParkJH,NishidateT,NakamuraY,etal.CriticalrolesofT-LAKcell-originatedproteinkinaseincytokinesis.CancerSci2010；101:403–411.

7.FukukawaC,UedaK,NishidateT,etal.CriticalrolesofLGN/GPSM2phosphorylationbyPBK/TOPKincelldivisionofbreastcancercells.GenesChromosomesCancer2010；49:861–872.

8.ShindeSR,GangulaNR,KavelaS,etal.PBK/TOPKandPTENparticipateinCHFRmediatedmitoticcheckpoint.CellSignal2013；25:2511–2517.

9.ZhuF,ZykovaTA,KangBS,etal.BidirectionalsignalstransducedbyPBK/TOPK-ERKinteractionincreasetumorigenesisofHCT116colorectalcancercells.Gastroenterology2007；133:219–231.

10.OhSM,ZhuF,ChoYY,etal.T-lymphokine-activatedkillercell-originatedproteinkinasefunctionsasapositiveregulatorofc-Jun-NH2-kinase1signalingandH-Ras-inducedcelltransformation.CancerRes2007；67:5186–5194.

11.AyllónV,O'connorR.PBK/TOPKpromotestumourcellproliferationthroughp38MAPKactivityandregulationoftheDNAdamageresponse.Oncogene2007；26:3451–3461.

12.ZykovaTA,ZhuF,LuC,etal.Lymphokine-activatedkillerT-cell-originatedproteinkinasephosphorylationofhistoneH2AXpreventsarsenite-inducedapoptosisinRPMI7951melanomacells.ClinCancerRes2006；12:6884–6893.

13.ZykovaTA,ZhuF,VakorinaTI,etal.T-LAKcell-originatedproteinkinase(PBK/TOPK)phosphorylationofPrx1atSer-32preventsUVB-inducedapoptosisinRPMI7951melanomacellsthroughtheregulationofPrx1peroxidaseactivity.JBiolChem2010；285:29138–29146.

14.ZlobecI,MolinariF,KovacM,etal.PrognosticandpredictivevalueofTOPKstratifiedbyKRASandBRAFgenealterationsinsporadic,hereditaryandmetastaticcolorectalcancerpatients.BrJCancer2010；102:151–161.

15.SiegelRL,MillerKD,JemalA.Cancerstatistics,2015.CACancerJClin2015；65:5–29.

16.LeiB,LiuSG,QiWJ,etal.PBK/PBK/TOPKexpressioninnon-small-celllungcancer:itscorrelationandprognosticsignificancewithKi67andp53expression[J].Histopathology,2013,63(5):696-703.

17.ShihMC,ChenJY,WuYC,etal.PBK/TOPKpromotescellmigrationviamodulationofthePI3K/PTEN/AKTpathwayandisassociatedwithpoorprognosisinlungcancer[J].Oncogene,2011,31(19):2389-400.

18.ChenF,LiRW,WangCJ,etal.T-LAKcell-originatedproteinkinaseisessentialfortheproliferationofhepatocellularcarcinomaSMMC-7721cells[J].CellBiocheFunct,2013,31(8):736-742.

19.ParkJH,LinML,NishidateT,etal.PDZ-bindingkinase/T-LAKcell-originatedproteinkinase,aputativecancer/testisantigenwithanoncogenicactivityinbreastcancer[J].CancerRes.2006,66(18):9186-95.

20.HuF,GartenhausRB,ZhaoXF,etal.c-MycandE2F1drivePBK/TOPKexpressioninhigh-grademalignantlymphomas[J].LeukemiaResearch,2013,37(4):447–454.

21.HuF,GartenhausRB,EichbergD,etal.PBK/TOPKinteractswiththeDBDdomainoftumorsuppressorp53andmodulatesexpressionoftranscriptionaltargetsincludingp21.Oncogene2010；29:5464–5474.

22.NandiAK,RapoportAP.ExpressionofPDZ-bindingkinase(PBK)isregulatedbycellcycle-specifictranscriptionfactorsE2FandCREB/ATF.LeukRes2006；30:437–447.

23.AbeY,TakeuchiT,Kagawa-MikiL,etal.AmitotickinasePBK/TOPKenhancesCdk1/cyclinB1-dependentphosphorylationofPRC1andpromotescytokinesis.JMolBiol2007；370:231–245.

发明内容

本发明的目的是：

1)发现酪氨酸激酶Src是TOPK新的上游激酶，并确认了磷酸化位点：Y74和Y272。

2)发现Src在Y74和Y272磷酸化修饰TOPK后影响了TOPK的功能，与肿瘤发生密切相关。

3)制备了抗TOPK的Y74磷酸化抗体：p-TOPK(Y74)。

4)确定制备的p-TOPK(Y74)抗体能应用于肿瘤细胞水平的Westernblot检测。

本发明是这样实现的：

1.确定Src是TOPK的直接上游激酶。

1)通过生物信息学分析，我们发现TOPK的蛋白序列中存在着Src底物的磷酸化保守序列：(pY[A/G/S/T/E/D])。

2)运用体外激酶实验证实活性的Src可磷酸化修饰TOPK。

3)运用NetPhos2.0软件对TOPK可能被磷酸化修饰的酪氨酸位点进行分析，并通过肽谱磷酸化筛选，确定TOPK的Y74和Y272两个位点能被活性的Src磷酸化修饰。

4)在细胞水平采用荧光共聚焦技术显示Src和TOPK在细胞内共定位。

5)采用pulldown技术证实Src能与TOPK相互作用。

2.确定Y74和Y272两个磷酸化位点对TOPK功能的重要性。

1)采用定点突变技术制备了TOPK突变体，并建立相应突变体的稳定表达细胞系，观察细胞表型变化。我们发现当TOPK的Y74和Y272被突变后，TOPK的促肿瘤发生能力降低，表明TOPK的Y74、Y272位点促进肿瘤的发生。

2)通过裸鼠体内成瘤实验证实稳定表达TOPKY74、Y272突变体的细胞系成瘤能力下降。

3)采用Westernblot技术证实在稳定表达TOPK的JB6细胞系及Src^+/+、Src^-/-细胞系中通过EGF刺激激活Src可磷酸化修饰TOPK并增强TOPK的活性。

4)我们进一步在细胞水平证实Src磷酸化修饰TOPK增强TOPK的稳定性。

3.制备抗TOPKY74及Y272磷酸化抗体。

1)设计合成多肽的序列。根据TOPK靶点序列及指定磷酸化位点Y74和Y272，设计需要合成的磷酸化多肽序列。

2)制备磷酸化抗体。根据设计的序列合成纯度高于90％的磷酸化多肽，然后进行抗原偶联，并将偶联的磷酸化多肽免疫入兔，收集血清，采用两步亲合法纯化抗体。

3)ELISA验证TOPK-Y74、TOPK-Y272磷酸化抗体的效价。

4.体内外验证抗TOPKY74及Y272磷酸化抗体。

1)体外激酶实验检测磷酸化抗体：p-TOPK(Y74)、p-TOPK(Y272)。其中p-TOPK(Y74)抗体在体外激酶实验验证成功。

2)细胞实验检测磷酸化抗体。在结肠癌细胞系中验证p-TOPK(Y74)。

3)在肺癌吉非替尼耐药株中验证p-TOPK(Y74)的表达。

4)在胶质瘤细胞系中验证p-TOPK(Y74)的表达。

本发明具有如下优点：

1)本发明首次发现Src是TOPK直接上游激酶。

2)Src是酪氨酸蛋白激酶，TOPK被预测有5个可能被磷酸化修饰的酪氨酸位点，本发明首次发现Src直接磷酸化TOPK的Y74和Y272位点。

3)首次发现Y74和Y272位点对TOPK功能影响重大，这两个位点磷酸化修饰会影响TOPK的稳定性和活性，促进肿瘤发生。

4)首次成功制备了p-TOPK(Y74)抗体，该抗体可用于细胞内检测。

5)目前市面上尚无针对TOPKY74磷酸化检测的任何抗体，本发明首次确定p-TOPK(Y74)抗体可用于westernblot分析，为其应用于肿瘤发生的研究及肿瘤的早期诊断及预后预测治疗打下了坚实的基础。

附图说明

图1：本发明技术路线图。

图2：体外实验显示，Src可磷酸化TOPK的Y74和Y272位点。

A.体外激酶实验：用同位素放射自显影技术显示活化的Src能激活无活性的TOPK。图中条带所示为磷酸化的Src和TOPK。

B.采用NetPhos2.0软件找到TOPK潜在的酪氨酸活化位点。“Y”标注为预测打分较高的位点。

C.肽谱磷酸化实验筛选出Y74和Y272为Src磷酸化TOPK的位点。含有各不同位点的肽段作为底物与活化的Src在γ-³²P和ATP共同作用下反应显影，结果显示Y74和Y272可被Src磷酸化。

D.免疫荧光实验通过荧光共聚焦显微镜显示Src(红色)与TOPK(绿色)共定位。二者在胞浆和胞核均有表达，主要在胞浆表达。

E.pulldown实验显示SW480细胞中Ni柱结合的TOPK能结合内源性的Src。

图3：细胞实验显示，Src在Y74和Y272位点磷酸化TOPK促进肿瘤细胞的转化。

(A)JB6和(B)SW480细胞系分别稳定转染pcDNA3-Mock(JB6/Mock),pcDNA3-TOPK-WT(JB6/WT),pcDNA3-TOPK-74F(JB6/74F),pcDNA3-TOPK-272F(JB6/272F)，或double-mutantpcDNA3-TOPK-FF(JB6/FF)质粒后建立的JB6和SW480稳定细胞系生长曲线图。结果显示与野生型(WT)细胞相比，单突变组(74F和272F)和双突变组(FF)细胞生长均减缓。(*P<0.05，**P<0.01，差异具有统计学意义。)插入上面小图分别为JB6和SW480稳定细胞系的免疫印迹检测结果，显示转染成功。

(C)和(D)分别为JB6和SW480稳定细胞系的锚定非依赖克隆形成实验结果。(C)图显示EGF刺激后与WT组比，JB6各突变组细胞克隆数小而少。(D)图结果显示与WT组相比较，SW480突变组细胞克隆数减少。

图4：裸鼠成瘤实验显示，Src磷酸化TOPK促进结肠肿瘤的发生。

A.野生型SW480稳定细胞系(SW480/WT)和突变型SW480稳定细胞系(SW480/FF)在裸鼠体内成瘤大小对比。结果显示，与SW480/WT组比，SW480/FF组形成的肿瘤明显减小。

B.SW480/WT和SW480/FF组裸鼠成瘤体积曲线图。从图中可以看出，从打入细胞30天起，SW480/FF组的肿瘤体积明显小于SW480/WT。(*P<0.05，**P<0.01，差异具有统计学意义。)

C.两组肿瘤的H&E染色及磷酸化HistoneH3的IHC染色。H&E染色结果显示两组均为低分化腺癌。磷酸化HistoneH3在SW480/WT的表达较SW480/FF组显著增强。(标尺放大倍数：400×)

图5：细胞实验显示，Src磷酸化TOPK增强TOPK的活性。

A.EGF刺激后磷酸化HistoneH3在JB6稳定细胞系：野生型组(JB6/WT)和双突变组(JB6/FF)中的表达变化。免疫印迹法显示JB6/FF组磷酸化HistoneH3表达水平较JB6/WT组降低。

B.EGF刺激后磷酸化HistoneH3在Src^+/+和Src^-/-MEF细胞中的表达变化。免疫印迹法显示EGF刺激后磷酸化HistoneH3在Src^+/+MEF中的表达较Src^-/-MEF高。

图6：细胞实验证实，Src磷酸化修饰TOPK增强TOPK的稳定性。

A.Src阻滞TOPK泛素化结合。pcDNA4-His-Src(His-Src)、pcDNA3-HA-TOPK(HA-TOPK)和pCMV-Flag-ubiquitin(Flag-Ub)瞬转入293T细胞,用HA抗体免疫沉淀TOPK后检测Flag的表达情况。结果显示：转入His-Src组TOPK泛素化结合信号明显减弱。

B.TOPK的Y74、Y272位点双突变后稳定性较TOPK野生型差。

C.Src^+/+MEF细胞中TOPK蛋白较Src^-/-MEF细胞稳定。

图7：体外和细胞内实验显示p-TOPK(Y74)抗体能检测到Y74位点的活化。

A.体外激酶实验显示制备的p-TOPK(Y74)抗体能在体外识别该位点被活化。本实验中用活化的Src分别与野生型TOPK原核表达蛋白(His-TOPK(WT))，单突变型(His-TOPK(74F))，单突变型(His-TOPK(Y272))及双突变型(His-TOPK(FF))在ATP作用下发生反应，免疫印迹结果显示p-TOPK(Y74)的信号在His-TOPK(WT)组非常强，而His-TOPK(74F)和His-TOPK(FF)组未见明显信号。

B.免疫印迹法检测Src和TOPK在四种结肠癌细胞系HCT116、HCT15、DLD1和SW480中的表达情况。

C.瞬时转染pcDNA4-His-Src(His-Src)和pcDNA3-HA-TOPK(HA-TOPK)到293T细胞并用EGF刺激，利用免疫印迹法检测p-TOPK(Y74)的表达。结果显示共转染His-Src和HA-TOPK后p-TOPK(Y74)的表达明显增强，EGF刺激后该表达进一步增加。

D.免疫印迹法检测EGF刺激后SW480中p-TOPK(Y74)的表达增强。

E.免疫印迹结果表明SW480、HCT15和HCT116细胞在不同浓度达沙替尼作用后，p-TOPK(Y74)的表达随着p-Src(Y416)的表达降低而降低，呈浓度依赖性。

图8：p-TOPK(Y74)在肺癌吉非替尼耐药株中的表达增强。

图9：p-TOPK(Y74)检测TMZ作用后神经胶质瘤细胞U87中TOPK的磷酸化水平下降。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细地说明。需要说明的是，本发明的实施例仅限于对本发明进行说明，而没有限制作用。实施例中所涉及的有关试验方法和其它各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。

实施例一确定Src是TOPK上游蛋白激酶，在Y74和Y272位点磷酸化TOPK。

1.通过体外激酶实验发现活性的Src可磷酸化TOPK。

体外激酶实验具体步骤如下：

1.1在E.coliBL21菌中表达并纯化TOPK蛋白：将pET46-His-TOPK-WT质粒转化进E.coliBL21感受态细胞中，挑单菌落37℃过夜培养。过夜的菌再次接种，37℃振荡培养至OD600为0.6～0.8，而后加入1mMIPTG30℃振荡诱导4h，随后反复冻融裂解菌体，加入Ni-NTA-His-bindingbeads(购自QIAGEN公司)，4℃孵育过夜，而后分别用PNI20、PNI40洗涤，最后PNI400洗脱，定量，电泳，考马斯亮蓝染色鉴定。

1.2我们将制备好的TOPK蛋白2ug、Src活性激酶0.2ug(购自Milipore公司)与1×激酶缓冲液一起在1mCi[γ-32P]ATP存在下32℃孵育40分钟。

1.3上述样品加入5×上样缓冲液，电泳分离，通过放射自显影技术结果显示：在TOPK位置有较强的磷酸化信号，说明Src可以磷酸化TOPK。(见图2A)

2.利用NetPhos2.0软件预测TOPK可被磷酸化修饰的酪氨酸位点。

Src是非受体酪氨酸蛋白激酶，我们利用NetPhos2.0软件对TOPK蛋白序列的酪氨酸位点进行分析预测，打分高者为潜在的磷酸化位点。结果显示：Y74、Y131、Y271、Y272和Y290位点为Src磷酸化TOPK的潜在位点。(见图2B)

3.通过肽谱磷酸化筛选出Src可磷酸化含Y74和Y272位点的肽段。

首先我们将网站预测的5个可能位点合成相应的肽段，然后通过体外激酶实验(具体步骤同1.2)，将活化的Src与5个不同肽段在1mCi[γ-32P]ATP存在下一起孵育，结果显示：含Y74和Y272位点的肽段可被激活，即Src可磷酸化这两个位点。(见图2C)

4.荧光共聚焦结果显示Src和TOPK共定位。

步骤如下：

4.1准备细胞爬片：将无菌清洁盖片置于12孔板内，接种结肠癌细胞SW480于盖片上。

4.2培养24小时后，固定细胞：先将细胞用1.5ml冷PBS轻洗3次，每次5分钟，再加入1.5ml1％多聚甲醛孵育10分钟，吸弃多聚甲醛，加入1.5ml在-20℃提前预冷的100％甲醇，孵育5分钟，然后吸弃甲醇，加入1.5ml-20℃提前预冷的80％丙酮，孵育2分钟，最后弃丙酮，自然晾干5分钟。

4.3免疫荧光染色：

4.3.1每孔用1.5mlPBS/0.05％tween-20振洗细胞5分钟。

4.3.2每孔加入50ulPBS/0.05％tween-20/NGS封闭1小时。

4.3.3加入Src/TOPK抗体，每孔50ul(Src：1:50，cellsignaling公司，#2123)(TOPK:1:50，Santacruz公司，sc-393313)，4℃孵育过夜。

4.3.4每孔用1.5mlPBS/0.05％tween-20洗，3次，每次10分钟。

4.3.5加入荧光标记二抗，每孔50ul(Alexa546红色:1:1000，Invitrogen公司)(Alexa488绿色:1:1000，Invitrogen公司)，室温避光孵育1小时。

4.3.6每孔用1.5mlPBS/0.05％tween-20洗，3次，每次15分钟，洗涤完后吸净盖片上液体。

4.4DAPI染核：取10ulDAPI混合物(Beyotime公司)滴加在细胞上，盖片覆盖封片，避免气泡产生。

4.5荧光共聚焦显相系统拍照：Src(红色)和TOPK(绿色)主要在胞浆内表达，大部分融合成黄色，说明二者共定位。(见图2D)

5.通过pull-down实验证实TOPK在细胞内与Src结合。

步骤如下(以SW480细胞为例)：

5.1用1％CHAPS(LifeScienceProducts&Services公司)裂解液裂解SW480细胞，分装两管(500ug每管)。

5.2分别取20ulNi-NTA-His-bindResin(Ni-control)和Ni-NTA-His-TOPK(Ni-TOPK)，加入1ml1％BSA封闭30分钟，3000rpm离心3分钟，弃上清。

5.3将两管细胞裂解液分别加入上述Ni-control和Ni-TOPK中4℃颠倒孵育过夜。

5.43000rpm离心3分钟，弃上清。加入1ml1％CHAPS洗3次，每次5分钟，最后一次弃尽上清。

5.5加入50ul1％CHAPS，吹匀，加入12ul5*上样缓冲液，95℃，煮沸5分钟，上样电泳。

5.6免疫印迹结果显示Ni-TOPK可与细胞内Src结合。(见图2E)

实施例二探讨Src磷酸化TOPK后对TOPK功能的影响。

1.通过亚克隆技术对TOPK的Y74和Y272位点分别进行单突变及双突变。

首先据两个位点酪氨酸突变成苯丙氨酸要求设计合成对应引物(上海英骏生物技术有限公司合成)，然后以pcDNA3-HA-TOPK为模板，进行PCR，分别得到突变后产物：单突变pcDNA3-HA-TOPK(Y74F)，pcDNA3-HA-TOPK(Y272F)和双突变pcDNA3-HA-TOPK(FF)，再转化到TOP10，扩增后提取质粒。

2.在JB6和SW480细胞系中建立过表达稳定细胞系，并做生长曲线比较各组细胞的增殖变化。

2.1利用simpleFect(购自武汉信号曙光生物科技有限公司)将pcDNA3.1、pcDNA3-HA-TOPK(WT)、pcDNA3-HA-TOPK(Y74F)、pcDNA3-HA-TOPK(Y272F)和pcDNA3-HA-TOPK(FF)分别转入JB6和SW480细胞中，通过G418(sigma公司)进行筛选得到JB6/mock、JB6/WT、JB6/74F、JB6/272F、JB6/FF和SW480/mock、SW480/WT、SW480/74F、SW480/272F、SW480/FF。

2.2生长曲线测定：将细胞消化计2×10⁵个种入10cm皿，分别在24小时、48小时、72小时和96小时消化计数，取平均值生成生长曲线。结果显示：在JB6和SW480稳定细胞系中，突变组稳定细胞系较野生组细胞系增殖减慢。(见图3A、3B)

3.通过软琼脂克隆形成实验发现突变后稳定细胞系克隆形成数减少，细胞锚定非依赖性生长能力下降。

步骤如下：

3.1JB6细胞为正常表皮细胞，刺激后易转化，是研究肿瘤转化的常用模型。我们将各种JB6稳定细胞系分为加EGF和不加EGF组，每组三个副孔的数量准备六孔板。首先配制混有10％FBS的胶浓度为0.5％的BME(基本培养基，sigma公司)，将其加入六孔板，每孔3ml，待凝固后形成底胶。然后将各组细胞混入含有10％FBS的胶浓度为0.33％的BME中，充分混匀，均匀滴加入各底胶之上，每孔1ml，每孔细胞数8000，待上层胶凝固后置于37℃，5％CO₂培养箱培养5-10天。最后拍照计克隆数比较各组差异。结果显示：EGF刺激后，突变各组与野生组相比较，细胞形成的克隆明显小而少。(见图3C)

3.2SW480为TOPK低表达的结肠肿瘤细胞，可形成克隆，无EGF刺激组。方法同上。结果显示：突变组较野生组细胞形成的克隆小而少。(见图3D)

4.裸鼠体内成瘤实验证实Y74和Y272位点突变后细胞成瘤能力降低。

我们将2.1中得到的SW480/WT和SW480/FF稳定细胞注射到裸鼠皮下，观察其成瘤情况及组织蛋白表达情况，步骤如下：

4.1将4-6周龄裸鼠(购自北京HFK生物科学有限公司)随机分为两组：WT和FF组，每组8只。

4.2分别消化SW480/WT和SW480/FF细胞，皮下注射到老鼠一侧，每只3×10⁶个。

4.3从注射细胞后21天开始，每隔一天测量肿瘤长、宽、高，计算其体积＝0.52(长×宽×高)。结果显示：细胞注射30天，肿瘤体积大于100mm³后，FF组肿瘤增殖明显较WT组慢，差异具统计学意义。(见图4B)

4.4肿瘤体积达到1000mm³后处死老鼠，剥离瘤块，送病理科(西京医院病理科)固定，包埋，切片，用于苏木素和伊红(H&E)染色以及p-HistoneH3(Ser10)(cellsignaling公司，#3377s)免疫组织化学染色分析。瘤块体积图显示：与WT组相比较，FF组成瘤体积明显减小。(见图4A)H&E结果显示：两组所形成的肿瘤均为低分化腺癌，具有高核浆比，核异质性，细胞有丝分裂旺盛以及血管增多的特征。(见图4C左)HistoneH3Ser10位点的磷酸化是细胞有丝分裂的标记，且TOPK可在Ser10磷酸化HistoneH3，所以我们通过免疫组织化学方法检测p-HistoneH3(Ser10)的表达，染色结果显示：p-HistoneH3(Ser10)的表达在WT组明显强于FF组。(见图4C右)这些结果说明Y74Y272位点突变后TOPK成瘤能力下降。

5.细胞实验表明Src增强TOPK的活性。

5.1我们将2.1中建立的JB6/WT和JB6/FF细胞系分别用EGF(20ng/ml)刺激15分钟，然后采用免疫印迹技术检测p-HistoneH3(Ser10)的表达情况。结果显示：突变组细胞(JB6/FF)的p-HistoneH3(Ser10)水平较JB6/WT低，说明Src磷酸化TOPK后增强其活性。(见图5A)

5.2我们用EGF(20ng/ml)分别刺激Src^+/+、Src^-/-细胞15分钟后，同上检测p-HistoneH3(Ser10)的表达，结果显示：EGF刺激后Src^+/+细胞内p-HistoneH3(Ser10)的水平明显高于Src^-/-细胞。(见图5B)

6.Src使TOPK泛素化结合降低，增强了TOPK的稳定性。

6.1我们瞬时转染pcDNA4-His-Src(His-Src)、pcDNA3-HA-TOPK(HA-TOPK)和pCMV-Flag-ubiquitin(Flag-Ub)到293T细胞,用HA抗体免疫沉淀TOPK后检测Flag的表达情况。具体步骤如下：

6.1.1利用simpleFect分别将Flag-Ub、HA-TOPK以及His-Src、Flag-Ub和HA-TOPK转入到293T细胞，48h后用1％CHAPS收样。

6.1.2用anti-HA(北京普瑞金公司，1:200)免疫沉淀裂解液中的TOPK蛋白，免疫印迹法检测Flag(sigma公司，1：1000)的表达。结果表明：Src的加入降低了TOPK的泛素化结合水平。(见图6A)

6.2我们用放线菌酮(CHX)(sigma公司)处理细胞阻滞新蛋白的合成，继而检测TOPK在不同细胞中的表达衰减情况，发现Src增强TOPK的稳定性。具体如下：

6.2.1我们瞬转pcDNA3-HA-TOPK(WT)(TOPK-WT)和pcDNA3-HA-TOPK(FF)(TOPK-FF)到293T细胞，24h后用EGF(80ng/ml)刺激15分钟，然后加入100μg/mlCHX，分别在0h、6h和12h收样，通过免疫印迹法检测HA的表达，反映TOPK的衰减情况。结果发现：Y74Y272突变后TOPK稳定性较野生型差。(见图6B)

6.2.2我们在Src^+/+、Src^-/-细胞模型中作如上CHX处理，结果也发现Src^+/+中TOPK更稳定。(见图6C)

实施例三TOPK磷酸化抗体的制备。

1.根据TOPK靶点序列及已知的磷酸化位点Y74和Y272，设计需要合成的磷酸化及非磷酸化多肽序列。

p-TOPK(Y74):NH₂-CysAsnAspHisp[Tyr]SerValTyrGlnLysArgLeuMetAspGlu-CONH₂

NP-TOPK(Y74):NH₂-CysAsnAspHisTyrSerValTyrGlnLysArgLeuMetAspGlu-CONH₂

p-TOPK(Y272):NH₂-CysAspGluSerAspPheAspAspGluAlaTyrp[Tyr]Ala-CONH₂

NP-TOPK(Y272):NH₂-CysAspGluSerAspPheAspAspGluAlaTyrTyrAla-CONH₂

2.制备磷酸化抗体。

具体步骤如下：

2.1根据设计的序列采用固相合成法合成多肽，用RP-HPLC条件进行纯化，并通过LC/MS鉴定，纯度>85％。

2.2使用KLH载体蛋白偶联得到多肽，作抗原蛋白用。

2.3免疫兔子，得到兔多抗血清，纯化血清。我们在第2天和第14天每只兔子免疫200ug抗原，再分别在第28天、第42天和第56天每只兔子免疫100ug抗原，期间采血做elisa检测，转阳(1:4000即1:4K,OD值>1)后收集30-50ml阳性血，通过两步亲和纯化法进行纯化。

Elisa检测流程如下：

2.3.1将抗原按适当浓度溶解于包被液中，在对应的孔中加入100ul抗原，4℃过夜；

2.3.2倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；

2.3.3每孔加入200μl封闭液，37℃孵育1小时；

2.3.4倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；

2.3.5每孔加入100μl一抗，37℃孵育1小时；

2.3.6倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；

2.3.7每孔加入100μl二抗，37℃孵育1小时；

2.3.8倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；

2.3.9拍干残留液体，每孔加入100μl显色液，37℃避光显色10分钟；

2.3.10每孔加50μl2MH₂SO₄终止显色，并立即读取450nmOD值。

表1.血清Elisa检测结果如下：

3、通过Elisa验证磷酸化抗体符合标准，即磷酸化抗体与磷酸化肽的反应在0.125ug/ml时有效OD值应大于或等于磷酸化抗体与非磷酸化肽反应在0.125ug/ml时有效OD值的5倍。(见下表)

表2.抗体Elisa检测结果如下：

实施例四p-TOPK(Y74)抗体在体外及细胞内的检测应用。

1.体外激酶实验证实p-TOPK(Y74)识别TOPK的磷酸化。

鉴于在实施例二的功能实验中我们发现TOPK的Y74和Y272这两个位点突变后产生的效应一致，我们在此详细探讨双突变后体内外的TOPK磷酸化变化。首先我们利用亚克隆技术对pET46-His-TOPK的Y74和Y272位点进行了双突变(具体方法同实施例二(1))，再原核表达出pet46-His-TOPK(WT)、pet46-His-TOPK(74F)、pet46-His-TOPK(272F)和pet46-His-TOPK(FF)蛋白，然后以他们为底物，以Src为活性激酶进行体外激酶反应(方法同实施例一)，免疫印迹法检测p-TOPK(Y74)和p-TOPK(Y272)的表达，结果表明：p-TOPK(Y74)识别Src激活的TOPK，当位点突变后信号消失。(见图7A)而p-TOPK(Y272)不能特异性识别激活的TOPK。

2.证实p-TOPK(Y74)抗体能识别EGF诱导的Src活化的TOPK。

我们用simple-fect将外源pcDNA4-His-Src(His-Src)和pcDNA3-HA-TOPK(HA-TOPK)转入293T细胞，分别用EGF(80ng/ml)刺激30分钟，免疫印迹法检测p-TOPK(Y74)和p-Src(Y416)的表达。结果显示：EGF刺激后p-Src(Y416)的表达增强，p-TOPK(Y74)在共转入His-Src和HA-TOPK组表达水平较单转HA-TOPK组高，且EGF刺激后信号更强。说明Src可在Y74位点磷酸化TOPK，且抗体能识别此位点的磷酸化。(见图7B)

3.p-TOPK(Y74)抗体识别EGF诱导的细胞内源性的TOPK磷酸化。

以结肠癌细胞SW480为例，我们用EGF(80ng/ml)分别给予SW480细胞5分钟、15分钟以及30分钟的刺激，收样，免疫印迹法检测p-TOPK(Y74)的表达，结果表明EGF作用后，细胞内源性的TOPK磷酸化能被p-TOPK(Y74)抗体识别。(见图7C)

4.我们在结肠癌细胞系中进一步证实，当Src活性被抑制后，TOPK的磷酸化水平下降，且p-TOPK(Y74)抗体能够识别出这种变化。

4.1首先我们检测了四种结肠癌细胞系HCT15、HCT116、DLD1、SW480中Src和TOPK的表达情况，选取Src表达相对较高的三种做后续实验。(见图7D)

4.2达沙替尼(Dasatinib，selleck公司)是一种众所周知的靶向Src的小分子抑制剂。在HCT116、HCT15和SW480三种细胞中，我们用10nM、20nM和50nM的dasatinib分别作用24h后检测p-TOPK(Y74)的表达情况。结果表明：在三种细胞中，p-TOPK(Y74)的表达随p-Src(Y416)水平的下降而降低，具浓度依赖性。(见图7E)

5.我们证实p-TOPK(Y74)在肺癌吉非替尼耐药细胞株中表达增强，其可能在肺癌耐药的研究及临床应用中发挥作用。(见图8)

6.p-TOPK(Y74)抗体识别神经胶质瘤细胞中TOPK的磷酸化变化。

以神经胶质瘤细胞U87为例，我们利用基因沉默技术将胶质瘤细胞中的TOPK沉默，用p-TOPK(Y74)抗体检测到抗瘤药物替莫唑胺(TMZ)100uM作用48h后p-TOPK(Y74)的表达降低。(见图9)。

Claims (8)

1.一种抗TOPK第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体，其特征在于是按包括以下步骤的方法制备而成的：

1)将氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的多肽与载体蛋白偶联，用作抗原；

2)用步骤1)中的抗原免疫动物，得到多抗血清，纯化后得到抗体。

2.一种抗TOPK第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的多肽与载体蛋白偶联，用作抗原；

2)用步骤1)中的抗原免疫动物，得到多抗血清，纯化后得到抗体。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述动物为兔。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述免疫的方法是：在第2天和第14天每只兔子免疫200ug抗原，再分别在第28天、第42天和第56天每只兔子免疫100ug抗原。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：采用两步亲和纯化法进行纯化。

7.权利要求1所述抗TOPK第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为结肠、肺癌和胶质瘤。