CN114773480A - 一种抗topk第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体 - Google Patents

一种抗topk第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体 Download PDF

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Abstract

一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体，涉及生物和疾病诊断试剂盒。提供一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体p‑TOPK(S32)，由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的抗原多肽与载体蛋白偶联用作抗原，用该抗原免疫动物得到多抗血清，经纯化后得到抗体。抗体的制备：根据TOPK靶点序列及磷酸化位点S32，设计需要合成的磷酸化多肽序列；根据设计的磷酸化多肽序列合成多肽，将该多肽与载体蛋白偶联，用作抗原；用抗原免疫动物，得到多抗血清，纯化后即得。该抗体可应用于肿瘤细胞水平的蛋白印迹检测，可在制备肿瘤诊断试剂盒中应用。为肿瘤发生、发展的研究，肿瘤诊断、预后及治疗打下坚实基础。

Description

一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体
技术领域
本发明涉及生物和疾病诊断试剂盒，具体是涉及一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体。
背景技术
TOPK/PBK，是一个由322个氨基酸的丝-苏氨酸组成的MAPKK样蛋白激酶1,2，是MEK3/6相关MAPKK家族成员，共享特征性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶亚结构域和C端PDZ结合T/SXV基序，使其能够特异性结合hDlg3的PDZ2结构域或其他含有PDZ的蛋白质，在细胞周期调控和有丝分裂进程中起着重要作用4。TOPK在各种活跃增殖细胞(包括恶性肿瘤细胞，如肝癌5等肿瘤)以及正常细胞(如精子细胞2)中过度表达，表达量与多种肿瘤的恶性程度明显相关，在肿瘤的增殖、进展和转移等恶性生物学行为中发挥重要作用6,7。TOPK过度表达使肿瘤细胞绕过与G2/M检查点相关的自然监测机制，通过在S10位点磷酸化组蛋白H3，下调肿瘤抑制因子p53，上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21，导致细胞进入异常有丝分裂期，促进肿瘤的发生8,9。TOPK还可激活转录因子β-连环蛋白(β-Catenin)与其转录辅助激活因子T细胞因子/淋巴增强子结合因子(TCF/LEF)相互作用的能力，后者随后上调基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的转录，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移10。越来越多的研究发现TOPK在肿瘤的临床诊断以及预后预测中发挥重要作用，可能会成为肝癌5、乳腺癌11、淋巴瘤7、肺癌12,13,14和卵巢癌6等多种肿瘤有意义的分子靶点和预后标志物。
作为蛋白激酶，细胞内总的TOPK表达并不能准确体现TOPK的活性，激活状态的TOPK才能在细胞中发挥作用。因而发现能影响其活性的上游激酶、揭示相应的磷酸化位点是研究TOPK作用机制的关键。目前已有报道hDlg4，ERK1/215，C-Myc-E2F116，P538,13，E2F-CREB/ATF17,Cdk1/CyclinB18和Src19均能与TOPK相互作用并调节其功能。在有丝分裂时TOPK与纺锤体CDK1/cyclin B1复合物结合并被磷酸化激活18，促进有丝分裂的进行。Src也是PBK/TOPK的上游调节因子，它可以在Y74和Y272位点直接结合并磷酸化TOPK，增强其活性和稳定性，避免被泛素化降解19。
已有研究发现TOPK可以磷酸化ERK1/2，有活性的ERK1/2也可以反过来磷酸化TOPK并增加其激酶活性，从而在两者之间形成正反馈环，这种正反馈作用可持续促进肿瘤的发生和发展15。关于ERK1/2磷酸化TOPK的位点，目前已有报道显示ERK1/2可以磷酸化TOPK的T9位点，但也有发现T9位点的磷酸化与细胞的增殖关系不大19。申请人研究发现，T9A突变的TOPK仍然可以促进肿瘤的增殖，这表明T9可能不是一个重要的磷酸化位点，除T9外，ERK1/2在其他丝氨酸或苏氨酸位点可能激活TOPK。在此基础上，申请人对ERK1/2磷酸化TOPK的丝苏氨酸磷酸化位点进行重新研究，通过软件预测和实验验证，发现S32是ERK1/2磷酸化TOPK的一个重要位点，且S32位点的磷酸化，对肾癌细胞的增殖和转化具有非常重要的作用。基于此，研究制备针对检测TOPK第32位丝氨酸磷酸化检测的抗体的方法，制备一款p-TOPK(S32)抗体,该抗体可用于蛋白印迹检测第32位丝氨酸磷酸化的TOPK。TOPK磷酸化抗体的制备有助于深入研究该蛋白激酶的功能，以期更好的在临床和科研中发挥作用。
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发明内容
本发明的第一目的提供一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化抗体的抗原多肽。
本发明的第二目的提供一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体。
本发明的第三目的提供一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体的制备方法。
本发明的第四目的提供一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。
本发明提供一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化抗体的抗原多肽，所述抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体，所述抗体为p-TOPK(S32)，由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的抗原多肽与载体蛋白偶联用作抗原，用该抗原免疫动物得到多抗血清，经纯化后得到所述抗体。
本发明提供一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)根据TOPK靶点序列及磷酸化位点S32，设计需要合成的磷酸化多肽序列；
2)根据步骤1)设计的磷酸化多肽序列合成多肽，将该多肽与载体蛋白偶联，用作抗原；
3)用步骤2)中的抗原免疫动物，得到多抗血清，纯化后得到抗体。
在步骤1)中，所述磷酸化多肽序列为：NH2-RRCNIPAp[S32]PFMQK-CONH2。
在步骤2)中，所述合成多肽采用固相合成法,用RP-HPLC条件进行纯化，纯度>85％；所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。
在步骤3)中，所述动物可采用兔子；所述免疫的方法是：在第2天和第14天每只兔子免疫200ug抗原，再分别在第28天、第42天和第56天每只兔子免疫100ug抗原；所述纯化可采用两步亲和纯化法进行纯化。
本发明提供一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。所述肿瘤为肾癌。
本发明具有如下优点：
1)ERK2是丝氨酸激酶，TOPK被预测有11个可能被磷酸化修饰的丝氨酸位点，本发明对ERK1/2磷酸化TOPK的丝苏氨酸磷酸化位点进行研究，发现ERK2直接磷酸化TOPK的第32位丝氨酸。
2)发现S32位点对TOPK功能影响重大，该位点磷酸化修饰会影响TOPK的活性，促进肿瘤发生。确定S32位点的磷酸化对肾癌细胞的增殖和转化的作用。
3)成功制备p-TOPK(S32)抗体，确定该抗体可用于细胞中蛋白表达的WB检测。该抗体可用于蛋白印迹检测第32位丝氨酸磷酸化的TOPK。
4)目前市面上尚无针对TOPK S32磷酸化检测的任何抗体，TOPK磷酸化抗体的制备有助于深入研究该蛋白激酶的功能，为其应用于肿瘤发生、发展的研究及肿瘤的诊断、预后及治疗打下坚实的基础。
附图说明
图1：本发明技术路线图。
图2：体外实验显示，ERK2可磷酸化TOPK的S32位点。
A.采用NetPhos3.0软件找到TOPK潜在的丝氨酸活化位点。“S”标注为预测打分较高的位点。图中条带所示为磷酸化的ERK2和TOPK。
B.肽谱磷酸化实验筛选出S32为ERK2磷酸化TOPK的位点。含有各不同位点的肽段作为底物与活化的ERK2在γ-32P和ATP共同作用下反应显影，结果显示S32可被ERK2磷酸化。
C.CL-MS/MS检测结果显示有活性的ERK2可以激活TOPK的第32位的丝氨酸残基。
D.体外激酶实验：用同位素放射自显影技术显示活化的ERK2能激活无活性的TOPK。
图3.p-TOPK S32抗体在体外检测S32位磷酸化的TOPK。
A.TOPK突变位点示意图
B.体外激酶实验显示制备的p-TOPK(S32)抗体能在体外识别该位点被活化。本实验中用活化的ERK2分别与野生型TOPK原核表达蛋白(His-TOPK(WT))，单突变型(His-TOPK(S32A))，在ATP作用下发生反应，免疫印迹结果显示p-TOPK(S32)的信号在His-TOPK(WT)组非常强，而His-TOPK(S32A)组未见明显信号。
C.细胞外激酶实验结果表明组成型激活的ERK2(R67S)可以激活没有活性的TOPK蛋白。
D.在EGF的刺激下，在293T细胞中，TOPK的磷酸化对ERK2有剂量依赖性。
图4：TOPK S32位点磷酸化可以促进细胞转化。
A，B.JB6和Caki-1细胞中稳定转染pCDNA-Mock,HA-TOPK-WT和HA-TOPK S32A。
C，D.JB6和Caki-1细胞成功稳转TOPK-WT和TOPK S32A，细胞生长曲线结果显示显著促进细胞的增殖能力，TOPK S32A细胞增殖能力较WT组细胞差。JB6细胞结果显示与对照组(pcDNA3-Mock)细胞相比，过表达TOPK野生型(WT)细胞增殖能力增强，克隆数量较多，克隆体积较大；与转染野生型TOPK的细胞相比，过表达TOPK S32位点突变的细胞克隆数量和克隆体积均下降，(*P<0.05，**P<0.01，差异具有统计学意义)。
E,F.JB6和Caki-1稳转细胞株软琼脂集落形成实验(锚定非依赖克隆形成实验)pcDNA3-Mock(JB6/Mock),pcDNA3-TOPK-WT(JB6/WT),pcDNA3-TOPK-S32A。结果显示与对照组(pcDNA3-Mock)细胞相比，过表达TOPK野生型(WT)细胞增殖能力增强，克隆数量较多，克隆体积较大；与转染野生型TOPK的细胞相比，过表达TOPK S32位点突变的细胞克隆数量和克隆体积均下降，(*P<0.05，**P<0.01，差异具有统计学意义)。图显示EGF刺激后与WT组比，突变组细胞克隆数小而少。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细地说明。需要说明的是，本发明的实施例仅限于对本发明进行说明，而没有限制作用。实施例中所涉及的有关试验方法和其它各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
见图1，本发明的技术路线为：生物信息学分析，预测TOPK上游蛋白激酶→体外激酶实验：ERK2磷酸化TOPK→通过NetPhos3.0软件预测，肽谱磷酸化筛选出S32为ERK2磷酸化TOPK位点→体内外实验发现ERK2在S32磷酸化TOPK促进细胞的转化和肿瘤细胞的增殖→制备特异性磷酸化抗体：p-TOPK(S32)→体外验证ERK2磷酸化p-TOPK(S32)/肾癌细胞系证实当ERK2过表达或活性被抑制后p-TOPK(S32)水平增强或随之降低。
本发明所需解决的技术问题是：
1.确认丝/苏氨酸激酶ERK2磷酸化TOPK的位点:S32。
2.发现ERK2在S32磷酸化TOPK后影响了TOPK的功能，促进肾癌细胞的增殖和转化能力。
3.制备抗TOPK的S32磷酸化抗体：p-TOPK(S32)。
4.确定制备的p-TOPK(S32)抗体能应用于肿瘤细胞水平的蛋白印迹(WesternBlotting)检测。
本发明是这样实现的：
1.确认丝/苏氨酸激酶ERK2磷酸化TOPK的位点:S32。
1)通过生物信息学分析，发现TOPK的蛋白序列中存在着ERK2底物的磷酸化保守序列：(pS[P/F/M/Q/])。
2)运用NetPhos3.0软件对TOPK可能被磷酸化修饰的丝氨酸位点进行分析，并通过肽谱磷酸化和LC-MS/MS质谱筛选，确定TOPK S32位点能被有活性的ERK2磷酸化修饰。
2.确定S32磷酸化位点对TOPK功能的重要性。
1)采用定点突变技术制备了TOPK突变体TOPK-S32A的质粒，并建立相应突变体的肾癌稳定表达细胞系，观察细胞表型变化。发现当TOPK的S32被突变后，TOPK的促肿瘤发生能力较对照组和野生型降低，表明TOPK的S32位点促进肿瘤的发生。
2)采用Western blot技术证实在稳定表达TOPK的JB6细胞系及肾癌细胞系Caki-1细胞系中通过EGF刺激激活ERK2可磷酸化修饰TOPK并增强TOPK的活性。
3)通过集落形成实验证实稳定表达TOPK S32突变体的细胞系成瘤能力下降。
3.制备抗TOPK S32磷酸化抗体。
1)设计合成多肽的序列。根据TOPK靶点序列及指定磷酸化位点S32，设计需要合成的磷酸化多肽序列。
2)制备磷酸化抗体。根据设计的序列合成纯度高于90％的磷酸化多肽，然后进行抗原偶联，并将偶联的磷酸化多肽免疫入兔，收集血清，采用两步亲合法纯化抗体。
4.体内外验证抗TOPK S32磷酸化抗体。
1)体外激酶实验检测磷酸化抗体：p-TOPK(S32)。p-TOPK(S32)抗体在体外激酶实验验证成功。
2)细胞实验检测磷酸化抗体。在肾癌细胞系中验证p-TOPK(S32)抗体用于蛋白印迹(WB)的检测。
以下给出具体实施例。
实施例1
制定技术路线
本发明的技术路线为如下：1)生物信息学分析，预测TOPK上游蛋白激酶；2)体外激酶实验：证明有激酶活性的ERK2可以磷酸化无活性的TOPK；3)通过NetPhos3.0软件预测，肽谱磷酸化筛选出S32为ERK2磷酸化TOPK位点；4)细胞实验发现ERK2在S32位点磷酸化TOPK可以促进细胞的转化和肿瘤细胞的增殖；5)制备特异性磷酸化抗体：p-TOPK(S32)；6)体外激酶实验验证有活性的ERK2可以在S32位点磷酸化TOPK，同时肾癌细胞系内实验证实当ERK2过表达或活性被抑制后p-TOPK(S32)水平增强或随之降低。(技术路线见图1)。
实施例2
确定ERK2是TOPK上游蛋白激酶，在S32位点磷酸化TOPK。
1.利用NetPhos3.0软件预测TOPK可被磷酸化修饰的丝苏氨酸位点。
ERK2是非受体酪氨酸蛋白激酶，利用NetPhos 3.0软件对TOPK蛋白序列的丝、苏氨酸位点进行分析预测，打分高者为潜在的磷酸化位点。结果显示：S13、S18、S32、S51、S51、S56、S58、S75、S121、S250、S263、S309、T9、T103、T224、T259位点为ERK2磷酸化TOPK的潜在位点(见图2中的A图)。
2.通过肽谱磷酸化筛选出ERK2可磷酸化含S32位点的肽段。
将网站预测的15个可能位点合成相应的肽段，然后通过体外激酶实验，将活化的ERK2与15个不同肽段在1mCi[γ-32P]ATP存在下一起孵育，结果显示：含S32位点的肽段可被激活，即ERK2可磷酸化这两个位点(见图2中的B)。
3.通过体外激酶实验发现有活性的ERK2可磷酸化TOPK。
体外激酶实验具体步骤如下：
1)在E.coli BL21菌中表达并纯化TOPK蛋白：将pET46-His-TOPK-WT质粒转化进E.coli BL21感受态细胞中，挑单菌落37℃过夜培养。过夜的菌再次接种，37℃振荡培养至OD600为0.6～0.8，而后加入1mM IPTG 30℃振荡诱导4h，随后反复冻融裂解菌体，加入Ni-NTA-His-binding beads(购自QIAGEN公司)，4℃孵育过夜，而后分别用PNI 20、PNI 40洗涤，最后PNI 400洗脱，定量，电泳，考马斯亮蓝染色鉴定。
2)将制备好的TOPK蛋白2ug、ERK2活性激酶0.2ug(购自Milipore公司)与1×激酶缓冲液一起在1mCi[γ-32P]ATP存在下32℃孵育40min。
3)上述样品加入5×上样缓冲液，电泳分离，通过放射自显影技术结果显示：在TOPK位置(38kD)有较强的磷酸化信号，说明ERK2可以磷酸化TOPK(见图2中的B)。
实施例3
探讨ERK2磷酸化TOPK后对TOPK功能的影响。
1.通过亚克隆技术对TOPK的S32位点进行突变。首先将丝氨酸位点突变成苯丙氨酸要求设计合成对应引物(上海英骏生物技术有限公司合成)，然后以pcDNA3-HA-TOPK为模板，进行PCR，分别得到突变后产物：
单突变pcDNA3-HA-TOPK(S32A)，pcDNA3-HA-TOPK(WT)再转化到TOP10，扩增后提取质粒。
2.在JB6和Caki-1肾细胞系中建立过表达稳定细胞系，并做生长曲线比较各组细胞的增殖变化。
1)利用Lipofectamine2000脂质体将pcDNA3.1、pcDNA3-HA-TOPK(WT)、pcDNA3-HA-TOPK(S32A)、分别转入JB6和Caki-1细胞中，并进行蛋白水平的鉴定(见图4中的A、B)，通过G418(sigma公司)进行筛选得到JB6/mock、JB6/WT、JB6/S32A和Caki-1/mock、Caki-1/WT、Caki-1/S32A。
2)生长曲线测定：将细胞消化计2×105个种入10cm皿，分别在24h、48h、72h和96h消化计数，取平均值生成生长曲线。结果显示：在JB6和Caki-1稳定细胞系中，突变组稳定细胞系较野生组细胞系增殖减慢(见图4中的C、D)。
3.通过软琼脂克隆形成实验发现突变后稳定细胞系克隆形成数减少，细胞锚定非依赖性生长能力下降。
步骤如下：
1)JB6细胞为正常表皮细胞，刺激后易转化，是研究肿瘤转化的常用模型。将各种JB6稳定细胞系分为加EGF和不加EGF组，每组三个副孔的数量准备六孔板。
首先配制混有10％FBS的胶浓度为0.5％的BME(基本培养基，sigma公司)，将其加入六孔板，每孔3ml，待凝固后形成底胶。然后将各组细胞混入含有10％FBS的胶浓度为0.33％的BME中，充分混匀，均匀滴加入各底胶之上，每孔1ml，每孔细胞数8000，待上层胶凝固后置于37℃，5％CO2培养箱培养5～10天。最后拍照计克隆数比较各组差异。结果显示：EGF刺激后，突变各组与野生组相比较，细胞形成的克隆明显小而少(见图4中的E)。
2)Caki-1为TOPK低表达的肾癌细胞，可形成克隆，无EGF刺激组。方法同上。结果显示：突变组较野生组细胞形成的克隆小而少(见图4中的F)。
实施例4
TOPK磷酸化抗体的制备。
1.根据TOPK靶点序列及已知的磷酸化位点S32，设计需要合成的磷酸化及非磷酸化多肽序列。
NH2-RRCNIPAp[S32]PFMQK-CONH2
NH2-RRCNIPASPFMQK-CONH2
2.制备磷酸化抗体。
具体步骤如下：
1)根据设计的序列采用固相合成法合成多肽，用RP-HPLC条件进行纯化，并通过LC/MS鉴定，纯度>85％。
2)使用KLH载体蛋白偶联得到多肽，作抗原蛋白用。
3)免疫兔子，得到兔多抗血清，纯化血清。在第2天和第14天每只兔子免疫200ug抗原，再分别在第28天、第42天和第56天每只兔子免疫100ug抗原，期间采血做elisa检测，转阳(1:4000即1:4K,OD值>1)后收集30～50ml阳性血，通过两步亲和纯化法进行纯化。
Elisa检测流程如下：
①将抗原按适当浓度溶解于包被液中，在对应的孔中加入100ul抗原，4℃过夜；
②倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
③每孔加入200μl封闭液，37℃孵育1h；
④倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
⑤每孔加入100μl一抗，37℃孵育1h；
⑥倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
⑦每孔加入100μl二抗，37℃孵育1h；
⑧倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；
⑨拍干残留液体，每孔加入100μl显色液，37℃避光显色10min；
⑩每孔加50μl 2M H2SO4终止显色，并立即读取450nm OD值。
血清Elisa检测结果如表1。
表1
Figure BDA0003681742260000101
3、通过Elisa验证磷酸化抗体符合标准，即磷酸化抗体与磷酸化肽的反应在0.125ug/ml时有效OD值应大于或等于磷酸化抗体与非磷酸化肽反应在0.125ug/ml时有效OD值的5倍，抗体Elisa检测结果见表2。
表2
Figure BDA0003681742260000111
实施例5
p-TOPK(S32)抗体在体外及细胞内的检测应用。
1.体外激酶实验证实p-TOPK(S32)识别TOPK的磷酸化。
鉴于在实施例2的功能实验中发现TOPK的S32位点突变后产生的效应，首先利用亚克隆技术对pET46-His-TOPK的S32位点进行突变(具体方法同实施例1)，再原核表达出pet46-His-TOPK(WT)、pet46-His-TOPK(S32A)蛋白，然后以它们为底物，以ERK2为活性激酶进行体外激酶反应(方法同实施例1)，免疫印迹法检测p-TOPK(S32)的表达，结果表明：p-TOPK(S32)识别ERK2激活的TOPK，当位点突变后信号消失(见图2中的B图)。
1.证实p-TOPK(S32)抗体能识别EGF诱导的ERK2活化的TOPK，且对ERK2有剂量依赖性。
1)用Lipofectamine2000将0、2、4、6μg外源pcDNA3-V5-ERK2(V5-ERK2)转入293T细胞，分别用EGF(80ng/ml)刺激30min，免疫印迹法检测p-TOPK(S32)p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的表达。结果显示：EGF刺激后p-TOPK(S32)的表达随着p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的表达增强而增强。说明ERK2可在S32位点磷酸化TOPK，此抗体能识别此位点的磷酸化，且p-TOPK(S32)对p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)有剂量依赖性(见图3中的D)。
2)在肾细胞系中进一步证实，当ERK2活性被抑制后，TOPK的磷酸化水平下降，且p-TOPK(S32)抗体能够识别出这种变化。
首先检测四种肾癌细胞系786-O、Caki-1、ACHN、SN12C、769-P中ERK1/2和TOPK的表达情况(见图3中的E)，选取ERK1/2表达相对较高的786-O细胞系，以病毒包装的方法进行了ERK2的基因沉默(见图3中的F)。以p-TOPK(S32)和p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)检测TOPK和ERK1/2磷酸化的变化情况。结果表明，p-TOPK(S32)的表达随着p-ERK1/2的降低而下降(见图3中的G)。
2.p-TOPK(S32)在肿瘤转化以及在肾癌中的功能。
将pCDNA-Mock、野生型的pCDNA HA TOPK WT、突变型的pCDNA HA TOPK S32A质粒分别稳定转染进JB6和Caki-1细胞中。分别进行生长曲线的测定和软琼脂集落成瘤实验。生长曲线结果表明转染野生型TOPK的细胞生长速度较转染S32位点突变的TOPK的细胞的生长速度明显快。克隆形成实验结果也表明转染野生型TOPK的细胞较转染S32位点突变的TOPK的细胞形成的克隆数量多而且体积大(见图4中的E,F)。
序列表
<110> 厦门大学附属翔安医院
<120> 一种抗TOPK 第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequences)
<400> 1
Arg Arg Cys Asn Ile Pro Ala Ser Pro Phe Met Gln Lys
1 5 10

Claims (10)

1.一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化抗体的抗原多肽，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体，其特征在于由权利要求1所述抗原多肽与载体蛋白偶联用作抗原，用该抗原免疫动物得到多抗血清，经纯化后得到。
3.如权利要求2所述一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体的制备方法，其特征于所述制备方法具体包括以下步骤：
1)根据TOPK靶点序列及磷酸化位点S32，设计需要合成的磷酸化多肽序列；
2)根据步骤1)设计的磷酸化多肽序列合成多肽，将该多肽与载体蛋白偶联，用作抗原；
3)用步骤2)中的抗原免疫动物，得到多抗血清，纯化后得到抗体。
4.如权利要求3所述一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体的制备方法，其特征于在步骤1)中，所述磷酸化多肽序列为：NH2-RRCNIPAp[S32]PFMQK-CONH2。
5.如权利要求3所述一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体的制备方法，其特征于在步骤2)中，所述合成多肽采用固相合成法,用RP-HPLC条件进行纯化，纯度>85％。
6.如权利要求3所述一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体的制备方法，其特征于在步骤2)中，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。
7.如权利要求3所述一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体的制备方法，其特征于在步骤3)中，所述动物采用兔子。
8.如权利要求3所述一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体的制备方法，其特征于在步骤3)中，所述免疫的方法是：在第2天和第14天每只兔子免疫200ug抗原，再分别在第28天、第42天和第56天每只兔子免疫100ug抗原；所述纯化可采用两步亲和纯化法进行纯化。
9.如权利要求2所述一种抗TOPK第32位丝氨酸残基磷酸化的抗体在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于所述肿瘤为肾癌。
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