CN104844705B - Kctd12蛋白在细胞周期调控中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质科学技术领域，具体公开了KCTD12蛋白在细胞周期调控中的应用。KCTD12蛋白调控细胞周期，通过以下途径实现：在S期通过控制KCTD12蛋白的降解程度来调控细胞周期；或，在M期通过控制KCTD12蛋白的磷酸化与去磷酸化来调控细胞周期；或，在M期通过调节KCTD12蛋白与CDK1蛋白的相互作用来调控细胞周期。本发明所述的KCTD12蛋白可作为癌细胞增殖调控的新靶标；有利于开发更多的抗癌药物。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质科学技术领域，具体涉及KCTD12蛋白在细胞周期调控中的应用。
背景技术
细胞周期是指从细胞分裂结束开始到下一次细胞分裂结束为止的过程，是多细胞有机体生长，发育和功能的基础。真核细胞的细胞周期分为四个时期，G1期、S期、G2期和M期，其中S期负责DNA的复制，而M期负责将遗传物质精确的均分到两个子细胞中去。S期和M期在保证遗传稳定方面比其他两个期更重要。如果在这两个过程中发生了错误而没有得到纠正那就会产生严重的后果，如基因突变，甚至可能导致癌变的发生。
细胞周期这个高度有序而精确的生命过程需要多重调控机制来调控。目前关于细胞周期调控的研究已经取得了很大的突破。这种调控机制主要分为两大类，蛋白表达水平调控和翻译后修饰水平调控。周期蛋白(cyclins)就是蛋白表达水平调控中最经典的例子，他们这个家族的蛋白表达量随着周期的变化而呈现周期性的变化，他们调控周期蛋白依赖蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的活性以及底物的特异性，细胞周期蛋白表达量的变化受到基因表达和泛素化依赖蛋白质降解途径的调控。而受周期蛋白调控的CDK则属于翻译后修饰水平的调控。Cyclins和CDK形成复合物，激活CDK的激酶活性，然后对其底物进行一系列的磷酸化修饰，从而调控细胞周期的进程。然而细胞周期的调控非常复杂，虽然我们已经取得了一定的成果，但是还不能够完全的了解细胞周期的调控，其中之一就是发现参与细胞周期调控的新蛋白。
细胞周期是通过各个调节因子相互作用，保持动态平衡来维持细胞周期的正常运转。任何一类调节因子的异常变化都可能造成细胞周期的紊乱，从而引起功能的紊乱甚至是引发癌变。所以将细胞周期的调控机制研究透彻是非常有必要的。细胞周期中S期和M期相对来说比较重要，所以全面系统的了解S期和M期的调控机制，可以为研究细胞周期的调控提供非常重要的线索。
蛋白组学是研究样品中所有蛋白组成以及变化规律的科学。而定量蛋白质组学是将样品中所有蛋白进行精确的定量和鉴定的科学。细胞培养稳定同位素标记技术(StableIsotope Labeling with Amino Acids in Cell Cultures,SILAC)是目前基于质谱的定量蛋白组学的代表性技术。SILAC技术是将含有稳定同位素(H链)和天然同位素(L链)标记的氨基酸替代培养基中相应的氨基酸，用这样的培养基分别培养细胞，7代之后，细胞新合成蛋白质中的相应氨基酸都被稳定同位素标记的氨基酸所替代。这样就将细胞内的蛋白质全部替换成带有同位素标记的蛋白质。再将不同标记的细胞进行蛋白裂解，按照蛋白量或者细胞数目进行等比例混合，用SDS-PAGE进行预分离，酶解，质谱鉴定和定量分析。由于SILAC技术操作简单，标记效率可达到70％。同时这样的培养对细胞无毒性，对操作者也相对比较安全，以至于SILAC技术被广泛应用于生命科学研究的各个领域。
蛋白组学技术也被用于细胞周期的研究中，Yun-Lin Lee用双向电泳技术分析人类肝细胞在细胞周期中的蛋白组变化。Matthias Mann用SILAC技术发现蛋白激酶的磷酸化在细胞周期的调控中起着重要的作用。MtioCheck用蛋白组学技术鉴定到大约100个与有丝分裂有关的蛋白复合体。这些蛋白组学数据都是研究者根据自己的需要而特定鉴定的一些参与细胞周期调控的磷酸化蛋白或者蛋白复合体，这样发现的信息非常的有限，并不能全面真实的反映参与细胞周期调控的全部蛋白。本研究采用同步化的方法结合SILAC定量蛋白组学技术，全面系统的分析S期和M期的差异蛋白，并从中寻找到包括KCTD12在内的一系列的参与细胞周期调控的新蛋白。
KCTD(potassium channel tetramerization domain containing)钾离子通道四聚蛋白。目前这个家族的成员有26个，他们中大部分的蛋白功能还不清楚。在结构上他们具有相似性，在N端都具有一个BTB/POZ的结构域，而C端具有一个独特的结构域。关于BTB/POZ结构域的功能目前有报道显示它除了是一个电压门控的钾离子通道之外，还与转录抑制，骨架调节等有关，它还会与泛素化的E3连接酶相互作用形成复合物。
KCTD12是KCTD家族中的一员，KCTD12具有两个结合非常紧密的结构域，和所有的家族成员一样在N端有一个BTB/POZ的结构域富含α螺旋和β折叠，而在C端是一个富含β折叠的一个结构域。
关于KCTD12的功能目前研究的还很少，前期的报道显示KCTD12在胎儿的耳蜗和脑中高表达。最近两年一个日本的研究所通过利用双向电泳的手段发现KCTD12可能是胃肠间质瘤的预后Marker。而KCTD12具体的功能以及跟细胞周期的关系，至今未见任何报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供KCTD12蛋白在细胞周期调控中以及作为癌细胞增殖调控靶标的应用。
本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
KCTD12蛋白在细胞周期调控中的应用。
作为一种优选方案，KCTD12蛋白调控细胞周期，通过以下途径实现：在S期通过控制KCTD12蛋白的降解程度来调控细胞周期；或，在M期通过控制KCTD12蛋白的磷酸化与去磷酸化来调控细胞周期；或，在M期通过调节KCTD12蛋白与CDK1蛋白的相互作用来调控细胞周期。
作为一种优选方案，KCTD12蛋白调控细胞周期，通过以下途径实现：在M期通过控制KCTD12蛋白243位处丝氨酸的磷酸化与去磷酸化来调控细胞周期；或，在M期通过KCTD12蛋白与CDK1蛋白的相互作用调节p-CDK1-Thr14/Tyr15的水平来调控细胞周期。
本发明研究表明，KCTD12调控细胞周期的机理(见图1)为：KCTD12与CDK1相互作用，使p-CDK1-Thr14/Tyr15水平下调，激活CDK1，而活化的CDK1对Aurora激酶进行活化，而Aurora激酶又反过来使KCTD12磷酸化促进细胞周期的进程。
KCTD12蛋白作为癌细胞增殖调控靶标的应用。
本发明提供一种筛选治疗癌症药物的方法，所述方法为：将待测药物与细胞接触，进一步检测细胞中S期KCTD12蛋白的降解程度，或M期KCTD12蛋白的磷酸化程度，或M期p-CDK1-Thr14/Tyr15的水平来实现药物筛选目的；当待测药物能抑制S期KCTD12蛋白的降解程度，或在M期使KCTD12蛋白的243位处丝氨酸去磷酸化，或在M期增加p-CDK1-Thr14/Tyr15的水平，则指示待测药物为抗癌药物。
作为一种优选方案，所述的癌症为卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、肾癌、或头颈癌。
本发明还提供一种制备治疗癌症药物的方法，所述方法为：采用抑制剂制备治疗癌症药物，所述抑制剂在S期能抑制KCTD12蛋白的降解；或，在M期所述抑制剂能使KCTD12蛋白的243位处丝氨酸去磷酸化；或，在M期所述抑制剂增加p-CDK1-Thr14/Tyr15的水平。
作为一种优选方案，所述抑制剂与其他抗癌或抗肿瘤药物联合施用。
作为一种优选方案，所述的癌症为卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、肾癌、或头颈癌。
本发明还提供一种预防或治疗癌症的药物，包含一种抑制剂，所述抑制剂在S期能抑制KCTD12蛋白的降解；或，在M期所述抑制剂能使KCTD12蛋白的243位处丝氨酸去磷酸化；或，在M期所述抑制剂增加p-CDK1-Thr14/Tyr15的水平。
作为一种优选方案，所述药物还包括其他药学上可接受的载体。
作为一种优选方案，所述的癌症为卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、肾癌、或头颈癌。
有益效果：本发明通过研究表明在S期通过控制KCTD12蛋白的降解程度可调控细胞周期；或在M期通过控制KCTD12蛋白的磷酸化与去磷酸化可调控细胞周期；或在M期通过调节KCTD12蛋白与CDK1蛋白的相互作用可调控细胞周期；因此，KCTD12蛋白可作为癌细胞增殖调控的新靶标；有利于开发更多的抗癌药物。
附图说明
图1为KCTD12调控细胞周期的机理示意图。
图2为MG132对各期细胞中KCTD12表达量的影响图。
图3为MG132对细胞周期的影响图。
图4为CIP处理M期蛋白图。
图5为用VX-680处理M期细胞图。
图6为KCTD12重组质粒构建和测序结果图。
图7为KCTD12的氨基酸序列图。
图8为突变体mut1的部分序列图。
图9为突变体mut1表达效果的检测图。
图10为突变效果的检测图。
图11为突变体Vmut1和野生型克隆形成图。
图12为干扰和过表达KCTD12影响CDK1的磷酸化水平图。
图13为KCTD12在癌症组织及其在癌旁组织的表达图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对发明不做任何形式的限制。
实施例1KCTD12在S期对细胞周期的影响
将细胞同步在G1/S期，释放的同时加入终浓度为10μM的MG132处理细胞。MG132是一种蛋白酶体抑制剂，它能够抑制蛋白酶体对泛素化修饰的蛋白进行降解。根据同步化的方法收集各期的细胞，用Western Bolt的方法检测各期细胞的KCTD12的表达水平(图2)。再用流式细胞仪对收集的各期细胞进行流式检测，检测其周期的变化(图3)。
MG132是蛋白酶体抑制剂，它能够抑制蛋白酶体对泛素化修饰的蛋白进行降解。图2表明，MG132明显抑制了KCTD12在S期和G2的降解。图3表明，添加MG132抑制蛋白质KCTD12的降解，明显阻滞了细胞周期的进程。
本实施例中的细胞同步化的方法如下：
(1)取对数期的细胞，分别接种到5个细胞培养瓶中分别编号①、②、③、④、⑤；同时加入终浓度为2.5mM胸苷(Thymidine)，培养18小时，进行第一次阻断；
(2)用PBS洗细胞3次，彻底除去Thymidine，加入37℃预热的培养基进行第一次释放，培养10小时；
(3)再次加入终浓度为2.5mM的Thymidine，进行第二次阻断，培养16小时；
(4)收集①号瓶G1/S期细胞。其它4瓶用PBS洗细胞3次，彻底除去Thymidine，加入37℃预热的培养基，进行第二次释放，继续培养；
(5)第二次释放4小时后收集②号瓶S期细胞。③和④号瓶加入终浓为100ng/mL有丝分裂抑制剂(Nocodazole)，继续培养；
(5)第二次释放8小时后收集③号瓶G2期细胞；
(6)第二次释放10小时后收集④号瓶M期细胞；
(7)第二次释放15小时后收集⑤号瓶G1期细胞。
实施例2KCTD12在M期受Aurora激酶的调控进行磷酸化修饰
由于细胞周期调控的一种重要的手段就是对蛋白进行磷酸化或者去磷酸化修饰进而激活或者抑制蛋白的活性从而达到调控的目的，由此推测可能是KCTD12进行了磷酸化修饰，导致分子量变大，位置上移(在Western Bolt中)。为了证实推测，用碱性磷酸酶(CIP)处理M期的蛋白，结果图4显示，经过CIP处理之后KCTD12的位置下移了。确认了KCTD12在M期的位置上移是因为进行了磷酸化修饰。
在确定KCTD12在M期进行磷酸化修饰之后，通过检索磷酸化蛋白的数据库以及基序的比对发现KCTD12存在Aurora激酶的作用位点。由此联想到Aurora激酶可能与KCTD12存在一定的联系，所以采用了Aurora激酶的抑制剂VX-680处理细胞，检测KCTD12在M期的磷酸化是不是受Aurora激酶的调控。结合同步化的方法(见实施例1)，在第二次释放的同时加入终浓度为5nM的VX-680处理细胞，收集M期的细胞，Western Bolt方法检测KCTD12(图5)。结果显示经过VX-680处理之后，KCTD12的磷酸化形式减少。说明KCTD12在M期的磷酸化受Aurora激酶的调控。
实施例3 243位的丝氨酸是KCTD12的磷酸化位点
实施例2结果确认了KCTD12在M期受Aurora激酶的调控，进行磷酸化修饰。根据预存的磷酸化位点，构建其突变载体，来确定其磷酸化的位点。首先在pCMV-N-flag的骨架上构建pCMV-N-flag-KCTD12的重组质粒，再在已经构建好的pCMV-N-flag-KCTD12的基础上，对其进行点突变，构建磷酸化位点突变载体(mut1)。
以质粒pCMV-N-flag作为骨架构建pCMV-N-flag-KCTD12。KCTD12以HeLa细胞的cDNA为模板，设计引物进行PCR扩增，KCTD12基因PCR产物长度为1kb左右。PCR产物和质粒均经EcoR I、XbaI 37℃酶切4h后，16℃连接过夜，然后用E.coli感受态进行转化，涂板，16h左右挑取6个重组质粒阳性克隆。提取质粒，进行双酶切鉴定，pCMV-N-flag-KCTD12由EcoR I和Xba I 37℃酶切4h，跑琼脂糖胶(图6)，显示1和4号克隆为阳性克隆，其他为假阳性。送一号克隆的质粒去测序，结果证实序列完全正确，KCTD12的重组质粒构建成功。
Aurora激酶的作用位点位于KCTD12(图7)的243位丝氨酸处。设计突变方案，将243位的丝氨酸突变为丙氨酸。根据突变方案设计突变引物，根据QuiKChang Lightning Site-Directed Mutagenesis kit进行突变。转化，挑取阳性克隆，提取质粒，送去测序。突变质粒的测序结果与设计的完全一致。
构建好突变载体之后，将重组质粒和mut1转染到HeLa细胞中，检测它们的表达效果(图9)。结果显示重组质粒和突变体都可以在细胞中正常表达。
将细胞同步化的同时转染KCTD12和mut1的重组质粒，收取M期的细胞。检测M期时KCTD12的磷酸化形式是否减少或者不见。结果如图10所示，突变之后KCTD12的磷酸化形式比野生型的明显要少。说明成功将磷酸化位点突变掉了，也就是说243位的丝氨酸确实是KCTD12的磷酸化位点。
实施例5突变KCTD12的243位的磷酸化位点细胞克隆形成能力减弱
首先利用克隆形成实验，检测突变体Vmut1(实施例4中形成)对细胞增殖以及细胞成瘤能力的影响，结果(图11)显示突变体Vmut1(实施例4中形成)的克隆形成能力明显比VKCTD12(未突变的野生型)要弱，说明了突变体的增殖能力以及成瘤能力比野生型要弱，也就是说突变KCTD12的磷酸化位点会抑制细胞的增殖，减慢细胞周期的进程。
实施例6KCTD12通过降低p-CDK1-Thr14/Tyr15的水平来激活CDK1促进细胞周期的进程
通过siRNA干扰KCTD12的表达和过表达KCTD12来检测KCTD12对CDK1以及CDK1磷酸化水平的影响(图12)，结果显示，干扰和过表达KCTD12对CDK1没有影响，但是干扰KCTD12会上调p-CDK1-Thr14/Tyr15水平，而过表达KCTD12会下调p-CDK1-Thr14/Tyr15水平，但磷酸化位点突变之后p-CDK1-Thr14/Tyr15水平比野生型要上调。这说明了KCTD12与CDK1相互作用，降低p-CDK1-Thr14/Tyr15的水平，激活CDK1从而促进细胞周期的进程，而且这种相互作用需要磷酸化修饰的帮助。
KCTD12通过与CDK1作用，降低p-CDK1-Thr14/Try15的水平激活CDK1，从而促进细胞周期的进程。而CDK1活化之后会对其下游的一些分子进行磷酸化修饰，进行调控细胞周期，而Aurora激酶就是其下游受其调控的一个激酶。前面的结果显示KCTD12在M期时受Aurora激酶调控在其243位进行磷酸化修饰进而促进细胞从G2期进入M期。因此KCTD12调控细胞周期的机理(图1)为：KCTD12与CDK1相互作用，使p-CDK1-Thr14/Tyr15水平下调，激活CDK1，而活化的CDK1对Aurora激酶进行活化，而Aurora激酶又反过来使KCTD12磷酸化促进细胞周期的进程。
实施例7用免疫组化组织芯片检测KCTD12在癌症组织中的表达
检测方法如下：
(1)将芯片放入烘箱中，63℃，1h；
(2)烘烤完之后取出芯片，进行脱蜡。二甲苯两缸，每缸15分钟；无水乙醇两缸，每缸7分钟；90％酒精1缸，5分钟；80％酒精1缸，5分钟；70％酒精1缸，5分钟；
(3)从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，一次1分钟；冲洗过程中将柠檬酸修复液放至电磁炉上开始加热；
(4)抗原修复：柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待出气后开始计时，5分钟；时间到后终止加热，将高压锅盖打开，使其自然冷却30分钟；
(5)阻断，将片子放入阻断剂中15分钟；(阻断剂：38.4ml无水甲醇+12ml 30％浓度的H2O2+9.6ml纯水)
(6)取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟；
(7)取出一抗，用DAKO抗体稀释液1：2000稀释一抗；滴加一抗，室温
孵育半小时；
将片子用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟；
滴加DAKO公司的EnVisionTM+/HRP兔工作液，孵育30分钟；
PBS冲洗3次，一次1分钟；
按1ml DAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；(来自DAKO液体DAB+底物系统)在片子上滴加稀释后的DAB，显色5分钟，到时后自来水冲洗5分钟；
在片子上滴加哈氏苏木素(SIGMA)40秒，时间到后在0.25％的盐酸酒精(400ml70％酒精+1ml浓盐酸)中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟；
脱水，脱水过程：75％酒精1缸，5分钟；85％酒精1缸，5分钟；
95％酒精1缸，5分钟；无水乙醇两缸，每缸7分钟；二甲苯两缸，每缸15分钟。
封片。
实验结果判读标准：
(1)染色强度判定：在低倍镜下对组织点整个视野进行观察，将其分为弱阳性、中阳性及强阳性。弱阳性为浅黄色(+或1)、中阳性为棕黄色(++或2)、强阳性为棕褐色(+++或3)。(备注：如果组织中既有中阳性又有强阳性时我们一般记为2-3，类似结果如上；本公司免疫组化实验以DAB显色)
(2)染色阳性率判定：首先在低倍镜下把组织点进行整个视野的观察，然后选取3个染色强度不同的视野在高倍镜下进行判读，如果是定位于胞核时，在每个视野中随机记100个细胞，然后记100个细胞中阳性细胞占的百分率X1％，同样原理看另外2个视野的阳性细胞占的百分率X2％、X3％，最终该组织点染色阳性率取X1％、X2％及X3％的平均数；如果定位于胞浆或胞膜，则同样选取3个不同的染色强度视野，分别进行估算其阳性率后取其平均值。
(3)评分标准，阳性率＜10％的为0分；10％-30％的为1分；30％-50％的为2分；50％-80％为3分；80％-100％为4分。
判读及统计结果如图13所示，KCTD12在癌症组织中的表达显著高于癌旁组织，表明KCTD12有可能作为癌基因而成为诊断标志物和药物靶点。
Claims (1)
1.一种筛选治疗癌症药物的方法，其特征在于，将待测药物与细胞接触，进一步检测细胞中M期KCTD12蛋白的磷酸化程度；当待测药物能使M期KCTD12蛋白的243位处丝氨酸去磷酸化，则指示待测药物为抗癌药物。
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