CN116606376B - 第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，包括抗原的制备、免疫、亲和层析柱的制备以及抗体的制备为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在多肽链C末端增加一个L‑半胱氨酸进行封闭，最终确定PI3Kp85的序列为KLHEY(p)NTQFQE；制备过程中采用两步法亲和纯化，先通过磷酸化层析柱，再通过非磷酸化层析柱做亲和去除；本发明的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，所制备的抗体能识别PI3Kp85第452络氨酸被磷酸化的状态，不识别非磷酸化状态，具备磷酸化特异性高，亲和力高的特点，比传统的ProteinA纯化更加高效。

Description

第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法和使用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法和使用方法。

背景技术

磷酸化抗体是一种广泛应用于细胞信号转导领域的抗体，其可以特异性地识别蛋白质磷酸化修饰，并用于检测和研究不同的信号通路。

磷酸化抗原的制备需要先根据所关注的蛋白质确定其磷酸化位置，例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。磷酸化抗原可以通过重组蛋白合成多肽或天然蛋白质进行化学修饰而得到，其中最常见的方式为多肽合成；具体流程如下

1.根据所需的磷酸化位点确认多肽序列并设计引物

通过合成机制制备肽链

合成后需要进行质谱HPLC等检测手段,确认合成多肽的结构和纯度

使用磷酸化酶将多肽在所需的位点磷酸化或者使用其他方法,如光化学或者人为合成等进行磷酸化修饰

最后对于磷酸化抗原的纯度和活性进行检测并保存

磷酸化抗体的制备与传统的抗体制备类似都采用动物免疫技术制备抗体,具体步骤如下:

1.将磷酸化抗原注射到小鼠等动物体内,为了增强免疫效果可以将其混合佐剂或抗原疫苗进行免疫,经过多次诱导,小鼠身体内产生特异性抗体。

2.取出小鼠的脾脏制备脾细胞融合Myloma细胞，经过细胞融合技术建立交流细胞库，筛选分离特异性的磷酸化抗体，经过上述抗体筛选过程获得特异性磷酸化抗体纯化和检测。

3.最后制备的磷酸化抗体可以保存在功能完备的条件下用于进一步的实验应用。

磷酸化抗体意义

1.磷酸化抗体可以用于检测蛋白质激酶的活性修饰，例如在磷酸化抗体的蛋白质免疫印迹实验中，可以通过比较非磷酸化的抗体和磷酸化抗体对同一蛋白的识别，来体现蛋白质激酶的活性。

2.磷酸化抗体可以用于检测信号通路激活的状态，例如在蛋白质芯片实验中可以上载磷酸化抗体检测蛋白质的磷酸化，通过这些研究可以全面了解蛋白质磷酸化与其参与的信号通路之间的关系，通过这些研究，可以全面了解蛋白质磷酸化预期参与的信号通路之间的关系。

3.磷酸化抗体可以用于细胞调亡的研究例如用于紫杉醇等化合物的对于细胞凋亡的引发程度等。

总结：磷酸化抗体的细胞信号转导领域是一种功能强大，应用广泛的工具。其制备需要多次免疫和严格的筛选过程，可以用于各种单向或双向转导通路的研究，为细胞信号转导研究提供十分重要的实验手段。

ELISA试剂盒在国内有许多种叫法，例如：ELISA检测试剂盒、ELISA Kit、酶联免疫试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒、酶联免疫分析试剂盒、酶免试剂盒等，比较常见的叫法是ELISA检测试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒等。

ELISA试剂盒自从60-70年代问世以来，得到*科研工作者的认可及推崇，在欧美及中国获得很大的推广，尤其是国内生化领域的长足发展。

Elisa生物试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒适用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎(HEV)病毒IgM抗体ELISA检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种磷酸化特异性高，亲和力高的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，包括抗原的制备、免疫、亲和层析柱的制备以及抗体的制备，利用Abdesigner软件对PI3Kp85的氨基酸序列进行抗原表位分析，分析内容包括亲水性、抗原性、表面可能性、柔性区评估，同时考虑氨基酸结构复杂程度、易氧化程度、合成难度、氨基酸类别和分布，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在多肽链C末端增加一个L-半胱氨酸进行封闭，最终确定PI3Kp85的序列为KLHEY(p)NTQFQE；制备过程中采用两步法亲和纯化，先通过磷酸化层析柱，再通过非磷酸化层析柱做亲和去除。

所述抗原的制备包括如下步骤：

a.多肽偶联

a1.在KLH溶液中加入Sulfo-SMCC，得到KLH-SMCC溶液，将KLH-SMCC溶液用脱盐柱去除游离的Sulfo-SMCC；脱盐柱用3个柱体积的交联缓冲液平衡，然后上样；待KLH-SMCC溶液进入胶床后，用交联缓冲液洗脱；通过测定280nm的光吸收值收集KLH-SMCC所在的蛋白峰液并收集此峰液；合并每次峰收液；

a2.用Lowry法测定收集KLH-SMCC的浓度，根据所测蛋白浓度将KLH-SMCC按3mg/管分装；

a3.加入20mg/ml的多肽溶液反应不少于6小时，再加入L-半胱氨酸溶液反应数小时；

a4.将混合液转移至新处理好的透析袋中，用PBS缓冲液透析，透析完成后收集透析袋中全部内容物，并用PBS冲洗透析袋，收集全部冲洗液；

a5.将多肽-KLH偶联物稀释为1mg/ml并分装，得到多肽-KLH抗原，低温保存。

优选地，所述免疫包括如下步骤：

b.抗原乳化

b1.用0.01MPBS将多肽-KLH抗原稀释到1ml/羊；

b2.将全部抗原吸入一支乳化用注射器，另一支注射器吸入与抗原液等体积的福氏佐剂；

b3.用双联针头将两只注射器连接起来；

b4.用力将抗原液快速推入佐剂内，然后反复推拉双联注射器，直至乳化完成；

b5.用干净平皿盛满冷水，将乳化好的抗原佐剂混合液滴一小滴到水中，如液滴无扩散现象则说明乳化成功，如有扩散现象，则继续推拉乳化，直至乳化成功；

b6.将经检验乳化合格的抗原通过双联针头转到注射用玻璃注射器中，安上针头待用；

c.免疫

c1.基础免疫：将需免疫的羊从笼子中抓出放在操作台上，皮下注射8－10个部位，每个部位0.3－0.5ml乳化合格的抗原；

c2.加强免疫:除背部皮下免疫5个点外，增加注射两个肌肉位点，每个部位注射0.1－0.3ml抗原；

c3.血清收集:采集两次检测用血，第一次加强免疫后第七天采集检测血A，第二次加强免疫后七天采集检测血B；第三次加强免疫后七天采集阳性血后留样作为检测血清；

c4.将收集的检测血A和检测血B离心后分离血清。

优选地，所述亲和层析柱的制备包括如下步骤：

d.亲和层析柱的制备

d1.多肽与Sulfolink Gel偶联：从4℃冰箱中取出Sulfolink Gel，放置使其达到室温；竖直放好柱子，打开顶盖；一个柱体积交联缓冲液清洗柱子，留少量交联缓冲液于柱子底部，装上底部disc胶固定片；

d2.取Sulfolink Gel混匀好的悬浮液装入层析柱，至少用20ml交联缓冲液平衡，然后装上层析柱底盖；

d3.将溶解好的2mg多肽稀释到2ml交联缓冲液中；

d4.将多肽溶液加入层析柱，层析柱采用Sulfolink Gel层析柱，在4℃下摇动混匀层析柱反应过夜，次日取层析柱在室温静置数十分钟，按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，让层析柱中的反应后的多肽溶液排出并收集；

d5.封闭Sulfolink Gel上非特异性位点：重新打开层析柱底盖，取2ml50mM L-半胱氨酸溶液加入柱中与胶反应，装上层析柱顶盖，室温混匀反应数小时；室温静置数十分钟，放出多余的L-半胱氨酸溶液；

d6.洗柱：按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，排出层析柱中的液体，用PBS洗涤层析柱，第一遍时把层析柱上部的disc胶固定片装上，然后分别用1mol/L NaCl溶液，PBS缓冲液，Gly-HCl缓冲液清洗层析柱，得到亲和层析柱；

d7.亲和层析柱的储存：重新装上底盖，向层析柱中加入储存液10ml，使其流出至上层液面与disc胶固定面相距0.8±0.2cm，然后重新装上顶盖，得到亲和层析柱。

优选地，所述抗体的制备包括如下步骤：

e.血清处理:取出待处理的各批次血清，混合后，按血清量，加入1/10体积的1mol/L Tris PH7.5缓冲液调pH值，在室温下混匀静置一段时间后用除菌膜过滤；

f.偶联了磷酸化多肽的P肽柱层析；

f1.从4℃冰箱取出交联好的偶联了磷酸化多肽的亲和层析柱，放置至室温，先取下顶盖，避免空气进入胶床；

f2.取下底盖，让多余的储存缓冲液流出；用10mM PBS pH7.420ml清洗层析柱；

f3.从柱中取出P肽偶联的Sulfolink Gel 2ml，与处理后的血清样品混合，将混合样品在静音旋转仪上旋转混匀，在4℃条件下混匀反应过夜或在室温下混匀反应2小时；

f4.空层析柱直立放置于层析架上，加入10mlPBS用洗耳球吸吹以除去层析柱底片及底片下面的空气；将血清-Sulfolink Gel混合溶液分步装入层析柱，Sulfolink Gel沉积形成胶床，用PBS 5－7ml清洗层析柱，洗出胶内含血清，收集流出液；

f5.用20ml 10mM PBS pH7.4清洗层析柱，在液面距离胶面还有1－2cm时塞上层析柱的底盖，把胶上面disc胶片装上，再用10ml PBS pH7.4清洗层析柱，最后用10mM PBSpH7.4含0.05％Tween20溶液20ml清洗层析柱。

f6.每个样品准备2个含100ul 1M Tris·HCl PH7.5的1.5ml收集管及一个30ml的瓶子，做好标记；

f7.先用100mM甘氨酸缓冲液PH3.01ml洗层析柱，不收集洗脱液，再用100mM甘氨酸缓冲液PH3.01ml洗层析柱两次，每次流出液收集于1个1.5ml离心管中，混匀使其PH恢复中性，再根据蛋白多少决定是用瓶子接还是用比色杯接，直至收集至无蛋白为止；

f8.将各管收集液于280nm处比色，光吸收超过0.1的合并入洗脱液用于下一步纯化；

f9.P肽层析过的血清流出液，按f1-f8步骤重复吸收，直到抗体吸收完全为止；

f10.样品如果浓度过高产生沉淀则要先离心除去沉淀；测定最终洗脱液的吸光值；

f11.纯化过血清留样用于ELISA检测。

优选地，所述KLH-SMCC溶液按照KLH 100mg：水12.5ml：Sulfo-SMCC 25mg来配制。

优选地，c3中，每次每只羊采集约0.3－0.4ml全血。

优选地，所述第一次加强免疫应在羊背部右侧剪毛进行，并且不能将抗原接种到基础免疫溃疡或有肉芽肿处，其后的加强免疫也需注意这一点。

一种第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的使用方法，采用ELSIA法检测该抗体的磷酸化特异性，分别用磷酸化PI3Kp85多肽和非磷酸化PI3Kp85包被后进行识别比较。

本发明的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，适合规模化产出第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体，该抗体能识别PI3Kp85第452络氨酸被磷酸化的状态，不识别非磷酸化状态，具备磷酸化特异性高，亲和力高的特点，比传统的Protein A纯化更加高效。

附图说明

图1为免疫荧光验证结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”，“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

一、抗原设计

利用Abdesigner软件对PI3Kp85的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定PI3Kp85的序列为KLHEY(p)NTQFQE同时，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在C末端增加一个L-半胱氨酸C，最终待合成多肽序列为KLHEY(p)NTQFQE；半胱氨酸的作用是巯基可以通过SMCC和KLH进行偶联，目前全球尚无可以用于相关实验的抗体，区别于常规的Protein A纯化，我们采取了两步法亲和纯化，先通过磷酸化层析柱，再通过非磷酸化层析柱做亲和去除。

二、多肽偶联

1.KLH溶解：按下表比例将KLH复溶在已除气纯水中。

2.加SMCC：按下表比例称取Sulfo-SMCC，加入KLH溶液。(注意：Sulfo-SMCC在水或其它常用缓冲液中的溶解度约为10mM，其溶解度随盐浓度的增加而降低。

3.反应：KLH-SMCC溶液在室温缓慢搅拌60分钟。

4.脱盐：KLH-SMCC溶液用脱盐柱去除游离的Sulfo-SMCC。脱盐柱用3个柱体积的交联缓冲液平衡，然后上样，若体积较大，可分几次上样。待KLH-SMCC溶液进入胶床后，用交联缓冲液洗脱。通过测定280nm的光吸收值收集KLH-SMCC所在的蛋白峰液并收集此峰液。合并每次峰收液。(注意：交联剂可与脱盐柱反应，所以，这个脱盐柱只能用于去除游离SMCC。)

5.测定：用Lowry法测定收KLH-SMCC的浓度。

6.分装：根据所测蛋白浓度将KLH-SMCC按3mg/管分装。

称取所需多肽(多肽与KLH的重量比为1:1)。

7.将多肽溶于除菌除气纯水中，多肽终浓度为20mg/ml。若溶解后发现完全溶解困难，可助溶。

8.将KLH-SMCC与多肽溶液混合。

9.混合液4℃静音混合仪上反应过夜。

10.称取L-半胱氨酸用于封闭，L-半胱氨酸与KLH的重量比为2:1。

11.将L-半胱氨酸加入适量水进行溶解，将溶解后的L-半胱氨酸溶液加入多肽-KLH混合液中。

12.混合液4℃轻摇反应2小时。

13.封闭完成后，将混合液转移至新处理好的透析袋中，用0.01M PBS透析，期间至少更换2次透析液，每次间隔不少于4小时。

14.透析完成后收集透析袋中全部内容物，尤其是透析中可能形成的沉淀(通常是最好的免疫原)，并用0.01M PBS冲洗透析袋，收集冲洗液。

15.根据经验，多肽与KLH的理论偶联率大约为30％，这个值适用于大部分多肽。例如，用10mg KLH与10mg多肽偶联，最后得到的多肽-KLH偶联物的理论量为13mg。根据理论得率，将多肽-KLH偶联物稀释为1mg/ml。

16.分装：按300ug与200ug分装，做好标记，放入样品盒。

三、兔子免疫

1.抗原乳化

1.1免疫前应根据计划安排，提前准备好抗原乳化所需双联注射器和免疫用玻璃注射器，并贴好标签。

1.2免疫当天根据计划安排，从-70℃冰箱中取出多肽-KLH抗原，根据免疫类型准备好福氏佐剂，基础免疫使用完全福氏佐剂，加强免疫使用不完全福氏佐剂，此步骤须由两人完成，一一核对。

1.3用0.01MPBS将抗原稀释到1ml/羊。

1.4将全部抗原吸入一支乳化用注射器，另一支注射器吸入与抗原液等体积的佐剂，要把注射器中的气体驱除干净。吸入液体前，可在注射器内柄上蘸少许石蜡油，以减少推拉乳化时的阻力。

1.5用双联针头将两只注射器连接起来，用镊子或止血钳拧紧针头，以防出现泄漏。

1.6用力将抗原液快速推入佐剂内(不能先将佐剂推入抗原液内)，然后反复推拉双联注射器，直至乳化完成。推拉时用力要适度，以免双联针头崩开。

1.7用干净平皿盛满冷水，将乳化好的抗原佐剂混合液滴一小滴到水中，如液滴无扩散现象则乳化成功，如有扩散现象，则继续推拉乳化，直至乳化成功。

1.8将经检验乳化合格的抗原通过双联针头转到注射用玻璃注射器中，安上针头待用。转移前必须核对乳化用注射器和注射用注射器及针头标签号是否一致。

2.基础免疫

2.1将需免疫的羊从笼子中抓出放在操作台上，抓取羊要按规定方法执行，动作轻柔，必要时要用手轻轻抚摸羊，待其安静后再行抓取或进行其他操作，尽量避免造成羊受惊和机械伤害。抓羊时必须核对羊耳号。

2.2一人将羊固定，另一人用弯头手术剪在背部左侧从前到后剪毛，宽度1—2cm。

2.3用75％酒精棉球消毒剪毛处皮肤。

2.4核对注射器标签号与羊耳号是否一致，然后开始免疫，基础免疫皮下注射8－10个部位，每个部位0.3－0.5ml抗原。

3.加强免疫

3.1按公司计划安排进行加强免疫，加强免疫的基本操作及注意事项同基础免疫。

3.2第一次加强免疫应在羊背部右侧剪毛进行，切记不能将抗原接种到基础免疫溃疡或有肉芽肿处，以后的加强免疫也应注意这一点。

3.3加强免疫除背部皮下免疫5个点外，增加注射两个肌肉位点。用酒精棉消毒羊两后大腿内侧皮肤，然后将针头刺入肌肉，每个部位注射0.1－0.3ml抗原。

四.血清收集

1.检测用血一般采集两次，即第一次加强免疫后第七天采集检测血A，第二次加强免疫后七天采集检测血B。第三次加强免疫后七天采集阳性血后留样作为检测血清。

2.采血前应根据计划提前准备好采血管，写上明显标记，此步骤须有人复核。

3.检测血清按羊编号每只羊一管。

4.将需采血的羊从笼子中抓出并在羊固定器上固定好，抓取羊要按规定方法执行，动作轻柔，必要时要用手轻轻抚摸羊，待其安静后再行抓取或进行其他操作，尽量避免造成羊受惊和机械伤害。抓羊时必须核对采血管号和羊耳号是否一致。

5.剪去羊耳缘的毛，用酒精棉球擦拭耳廓，并用指甲轻弹静脉部位，使静脉充血突出。

6.用75％乙醇消毒过的一次性注射器针头扎破静脉，出血后用0.5ml离心管采集全血，每只羊采集约0.3－0.4ml全血。

7.采完血后用酒精棉球对伤口进行消毒。

8.将羊放回相应羊笼。

9.采集到的全血在室温放置1小时左右，使血清析出。

10.上述全血用手掌型离心机离心分离血清，离心时注意离心管平衡。

11.用移液枪吸出血清，转入一灭菌0.5ml小离心管中。

五、亲和层析柱的制备

1.多肽与Sulfolink Gel偶联

1.1从4℃冰箱中取出Sulfolink Gel，放置使其达到室温。竖直放好柱子，打开顶盖。一个柱体积交联缓冲液清洗柱子，留少量交联缓冲液于柱子底部，装上底部disc胶固定片。

1.2取Sulfolink Gel混匀好的悬浮液(最后得到胶床体积为2ml)装入层析柱，至少用20ml交联缓冲液平衡，然后装上层析柱底盖。

1.3将溶解好的2mg多肽稀释到2ml交联缓冲液中。

1.4将多肽溶液加入层析柱，装上层析柱顶盖，在层析柱上贴上标签。

1.5在4℃下摇动混匀层析柱反应过夜。

1.6次日取层析柱在室温静置30分钟。

1.7按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，让层析柱中的反应后的多肽溶液排出，并将其收集到一个洁净的管中。

1.8用20ml交联缓冲液洗涤层析柱(交联缓冲液用量不少于5个柱床体积)。

2.封闭Sulfolink Gel上非特异性位点

2.1重新打开层析柱底盖。

2.2取2ml 50mM(毫摩尔/升)L-半胱氨酸溶液加入柱中与胶反应，装上层析柱顶盖(L-半胱氨酸溶液与胶的体积比为1:1)。

2.3室温混匀反应2小时。

2.4室温静置30分钟。

2.5放出多余的L-半胱氨酸溶液。

3.洗柱

3.1按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，排出层析柱中的液体。

3.2用20ml PBS洗涤层析柱，第一遍时把上部的disc胶固定片装上。

3.3然后分别用20ml1 M NaCl，20ml PBS，20ml 100mM Gly-HCl缓冲液清洗层析柱。

4.多肽交联柱的储存

4.1重新装上底盖，向层析柱中加入储存液10ml，使其流出至上层液面与disc胶固定面相距0.8cm左右。

4.2重新装上顶盖。

六、亲和纯化

材料

1.动物血清

2.多肽交联层析柱

3.1M Tris·HCl，PH7.5

4.100mM甘氨酸(glycine)缓冲液，PH3.0

5.10mM PBS pH7.4

6.10mM PBST pH7.4(含0.05％Tween20)

7.储存液

注意：所有进入层析柱的液体均须经过除气处理。

操作步骤

1.血清处理

1.1取出待处理的各批次血清，混合。控制每次反应体积为40ml左右，留样用于ELISA检测。

1.2按血清量，加入1/10体积的1M Tris PH7.5缓冲液调pH值，在室温下混匀静置20分钟。

1.3将调过pH值血清样品用除菌0.45um膜过滤。

2.P肽柱层析

2.1从4℃冰箱取出交联好的P肽层析柱，放置至室温。首先取下顶盖，避免空气进入胶床。

2.2取下底盖，让多余的储存缓冲液流出。用10mM PBS pH7.420ml清洗层析柱。

2.3从柱中取出P肽偶联的Sulfolink Gel 2ml，与处理后的血清样品混合，将混合样品在静音旋转仪上旋转混匀，在4℃条件下混匀反应过夜或在室温下混匀反应2小时。

2.4空层析柱直立放置于层析架上，加入10mlPBS用洗耳球吸吹以除去层析柱底片及底片下面的空气。将血清-Sulfolink Gel混合溶液分步装入层析柱，Sulfolink Gel沉积形成胶床(防止胶床流干)，用PBS 5－7ml清洗层析柱(洗出胶内含血清)。收集流出液于一个干净瓶子中。

2.5用20ml 10mM PBS pH7.4清洗层析柱，在液面距离胶面还有1－2cm时塞上层析柱的底盖，把胶上面disc胶片装上，再用10ml PBS pH7.4清洗层析柱，最后用10mM PBSpH7.4含0.05％Tween20溶液20ml清洗层析柱。

2.6每个样品准备2个含100ul 1M Tris·HCl PH7.5的1.5ml收集管及一个30ml的瓶子，做好标记。

2.7先用100mM甘氨酸(glycine)缓冲液PH3.01ml洗层析柱，不收集洗脱液，再用100mM甘氨酸(glycine)缓冲液PH3.01ml洗层析柱两次，每次流出液收集于1个1.5ml离心管中，混匀使其PH恢复中性，再根据蛋白多少决定是用瓶子接还是用比色杯接。最后收集至无蛋白为止。

2.8将各管收集液于280nm处比色，光吸收超过0.1的合并入洗脱液用于下一步纯化。

2.9P肽层析过的血清流出液，可按2.1—2.8步骤重复吸收，直到抗体吸收完全为止。

2.10样品如果浓度过高产生沉淀要先离心(3000转10分钟)除去沉淀。测一下最终洗脱液的光吸收。

2.11纯化过血清留样用于ELISA检测。

七、ELSIA法检测该抗体的磷酸化特异性

ELISA数值如下：

磷酸化PI3Kp85抗体检测，分别用磷酸化PI3Kp85多肽和非磷酸化PI3Kp85包被；

免疫荧光验证结果见图1。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (9)

1.一种第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，包括抗原的制备、免疫、亲和层析柱的制备以及抗体的制备，其特征在于，利用Abdesigner软件对PI3Kp85的氨基酸序列进行抗原表位分析，分析内容包括亲水性、抗原性、表面可能性、柔性区评估，同时考虑氨基酸结构复杂程度、易氧化程度、合成难度、氨基酸类别和分布，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在多肽链C末端增加一个L-半胱氨酸进行封闭，最终确定PI3Kp8抗原表位多肽的序列为KLHEY(p)NTQFQE；所述多肽通过半胱氨酸与KLH偶联；制备过程中采用两步法亲和纯化，先通过磷酸化层析柱，再通过非磷酸化层析柱做亲和去除；

所述免疫阶段的方法如下：

c1.基础免疫：将需免疫的羊从笼子中抓出放在操作台上，皮下注射8－10个部位，每个部位注射0.3－0.5ml乳化合格的抗原；

c2.加强免疫:除背部皮下免疫5个点外，增加注射两个肌肉位点，每个部位注射0.1－0.3ml抗原；

c3.血清收集:采集两次检测用血，第一次加强免疫后第七天采集检测血A，第二次加强免疫后七天采集检测血B；第三次加强免疫后七天采集阳性血后留样作为检测血清；

c4.将收集的检测血A和检测血B离心后分离血清。

2.根据权利要求1所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，其特征在于，所述抗原的制备包括如下步骤：

a.多肽偶联

a1.在KLH溶液中加入Sulfo-SMCC，得到KLH-SMCC溶液，将KLH-SMCC溶液用脱盐柱去除游离的Sulfo-SMCC；脱盐柱用3个柱体积的交联缓冲液平衡，然后上样；待KLH-SMCC溶液进入胶床后，用交联缓冲液洗脱；通过测定280nm的光吸收值收集KLH-SMCC所在的蛋白峰液并收集此峰液；合并每次峰收液；

a2.用Lowry法测定收集KLH-SMCC的浓度，根据所测蛋白浓度将KLH-SMCC按3mg/管分装；

a3.加入20mg/ml的多肽溶液反应不少于6小时，再加入L-半胱氨酸溶液反应数小时；

a4.将混合液转移至新处理好的透析袋中，用PBS缓冲液透析，透析完成后收集透析袋中全部内容物，并用PBS冲洗透析袋，收集全部冲洗液；

a5.将多肽-KLH偶联物稀释为1mg/ml并分装，得到多肽-KLH抗原，低温保存。

3.根据权利要求2所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫包括如下步骤：

b.抗原乳化

b1.用0.01MPBS将多肽-KLH抗原稀释到1ml/羊；

b2.将全部抗原吸入一支乳化用注射器，另一支注射器吸入与抗原液等体积的福氏佐剂；

b3.用双联针头将两只注射器连接起来；

b4.用力将抗原液快速推入佐剂内，然后反复推拉双联注射器，直至乳化完成；

b5.用干净平皿盛满冷水，将乳化好的抗原佐剂混合液滴一小滴到水中，如液滴无扩散现象则说明乳化成功，如有扩散现象，则继续推拉乳化，直至乳化成功；

b6.将经检验乳化合格的抗原通过双联针头转到注射用玻璃注射器中，安上针头待用。

4.根据权利要求3所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，其特征在于，所述亲和层析柱的制备包括如下步骤：

d.亲和层析柱的制备

d1.多肽与Sulfolink Gel偶联：从4℃冰箱中取出Sulfolink Gel，放置使其达到室温；竖直放好柱子，打开顶盖；一个柱体积交联缓冲液清洗柱子，留少量交联缓冲液于柱子底部，装上底部disc胶固定片；

d2.取Sulfolink Gel混匀好的悬浮液装入层析柱，至少用20ml交联缓冲液平衡，然后装上层析柱底盖；

d3.将溶解好的2mg多肽稀释到2ml交联缓冲液中；

d4.将多肽溶液加入层析柱，层析柱采用Sulfolink Gel层析柱，在4℃下摇动混匀层析柱反应过夜，次日取层析柱在室温静置数十分钟，按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，让层析柱中的反应后的多肽溶液排出并收集；

d5.封闭Sulfolink Gel上非特异性位点：重新打开层析柱底盖，取2ml 50mM L-半胱氨酸溶液加入柱中与胶反应，装上层析柱顶盖，室温混匀反应数小时；室温静置数十分钟，放出多余的L-半胱氨酸溶液；

d6.洗柱：按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，排出层析柱中的液体，用PBS洗涤层析柱，第一遍时把层析柱上部的disc胶固定片装上，然后分别用1mol/L NaCl溶液，PBS缓冲液，Gly-HCl缓冲液清洗层析柱，得到亲和层析柱；

d7.亲和层析柱的储存：重新装上底盖，向层析柱中加入储存液10ml，使其流出至上层液面与disc胶固定面相距0.8±0.2cm，然后重新装上顶盖，得到亲和层析柱。

5.根据权利要求4所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，其特征在于，所述抗体的制备包括如下步骤：

e.血清处理:取出待处理的各批次血清，混合后，按血清量，加入1/10体积的1mol/LTris PH7.5缓冲液调pH值，在室温下混匀静置一段时间后用除菌膜过滤；

f.偶联了磷酸化多肽的P肽柱层析；

f1.从4℃冰箱取出交联好的偶联了磷酸化多肽的亲和层析柱，放置至室温，先取下顶盖，避免空气进入胶床；

f2.取下底盖，让多余的储存缓冲液流出；用10mM PBS pH7.420ml清洗层析柱；

f3.从柱中取出P肽偶联的Sulfolink Gel 2ml，与处理后的血清样品混合，将混合样品在静音旋转仪上旋转混匀，在4℃条件下混匀反应过夜或在室温下混匀反应2小时；

f4.空层析柱直立放置于层析架上，加入10mlPBS用洗耳球吸吹以除去层析柱底片及底片下面的空气；将血清-Sulfolink Gel混合溶液分步装入层析柱，Sulfolink Gel沉积形成胶床，用PBS 5－7ml清洗层析柱，洗出胶内含血清，收集流出液；

f5.用20ml 10mM PBS pH7.4清洗层析柱，在液面距离胶面还有1－2cm时塞上层析柱的底盖，把胶上面disc胶片装上，再用10mlPBS pH7.4清洗层析柱，最后用10mM PBS pH7.4含0.05％Tween20溶液20ml清洗层析柱；

f6.每个样品准备2个含100ul 1M Tris·HCl PH7.5的1.5ml收集管及一个30ml的瓶子，做好标记；

f7.先用100mM甘氨酸缓冲液PH3.01ml洗层析柱，不收集洗脱液，再用100mM甘氨酸缓冲液PH3.01ml洗层析柱两次，每次流出液收集于1个1.5ml离心管中，混匀使其PH恢复中性，再根据蛋白多少决定是用瓶子接还是用比色杯接，直至收集至无蛋白为止；

f8.将各管收集液于280nm处比色，光吸收超过0.1的合并入洗脱液用于下一步纯化；

f9.P肽层析过的血清流出液，按f1-f8步骤重复吸收，直到抗体吸收完全为止；

f10.样品如果浓度过高产生沉淀则要先离心除去沉淀；测定最终洗脱液的吸光值；

f11.纯化过血清留样用于ELISA检测。

6.根据权利要求2所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，其特征在于，所述KLH-SMCC溶液按照KLH 100mg：水12.5ml：Sulfo-SMCC 25mg来配制。

7.根据权利要求3所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，其特征在于，c3中，每次每只羊采集0.3－0.4ml全血。

8.根据权利要求3所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，其特征在于，所述第一次加强免疫应在羊背部右侧剪毛进行，并且不能将抗原接种到基础免疫溃疡或有肉芽肿处，其后的加强免疫也需注意这一点。

9.一种权利要求1-8任意一项所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的使用方法，其特征在于，采用ELSIA法检测该抗体的磷酸化特异性，分别用磷酸化PI3Kp85多肽和非磷酸化PI3Kp85包被后进行识别比较。