CN116874579A - 用于免疫组化和免疫荧光实验的第一一八位酪氨酸磷酸化mlc2抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于免疫组化和免疫荧光实验的第一一八位酪氨酸磷酸化MLC2抗体的制备方法。本方法采用氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽对动物进行免疫，即可获得MLC2抗体。本方法制备的MLC2抗体可用于免疫组化实验和免疫荧光实验。

Description

用于免疫组化和免疫荧光实验的第一一八位酪氨酸磷酸化 MLC2抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及用于免疫组化和免疫荧光实验的第一一八位酪氨酸磷酸化MLC2抗体的制备方法。

背景技术

在肿瘤进展过程中丙酮酸激酶M2(PKM2)高水平表达，对于细胞生长至关重要。但一直以来却少有信息能够确定它是否直接控制了细胞分裂。由于异常细胞分裂会影响肿瘤细胞生长和扩散，了解胞质分裂的出错机制至关重要。吕志民研究小组在小鼠中探讨了PKM2对脑肿瘤形成所起的作用。在对蛋白质编码基因MLC2进行分析后，吕志民研究小组揭示出了在脑瘤中PKM2磷酸化MLC2的机制。MLC2磷酸化控制了使得分裂母细胞能够分离成两个子细胞的过程。研究结果显示，受控于PKM2的MLC2磷酸化和相关胞质分裂有助于脑肿瘤形成，并精确地控制了细胞分裂。更重要的是，我们的研究表明受控于PKM2的胞质分裂发生于具有不良结局的恶性肿瘤中，例如胶质母细胞瘤、胰腺癌和黑色素瘤。因此，我们通过分析MLC2第一一八位氨基酸的磷酸化的情况可以分析出癌症的进展与预后。但是现在市场上并未有开发成功可以用于MLC2第一一八位氨基酸的磷酸化特异性抗体。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于免疫组化和免疫荧光实验的第十五位酪氨酸磷酸化MLC2抗体的制备方法，用于解决现有技术中通过免疫组化和免疫荧光的方式分析小鼠样本MLC2第118位氨基酸磷酸化分析的问题。

本发明的一方面提供了用于制备MLC2抗体的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明的另一方面提供了一种基因片段，所述基因片段能够编码上述多肽。

本发明的另一方面提供了上述多肽用于制备MLC2抗体的用途。

进一步地，所述多肽经过偶联以后用于制备MLC2抗体。

进一步地，所述多肽能够被免疫组化和/或免疫荧光实验检测。

本发明的另一方面提供了采用上述多肽制备MLC2抗体的方法，所述方法为利用所述多肽免疫动物，使得动物产生MLC2抗体，然后通过收集动物血清，即可获得含有MLC2抗体。

进一步地，所述动物为兔子或者羊。

进一步地，所述多肽经过偶联以后用于免疫动物。所述偶联的方法为本领域现有技术如，具体可以参考说明书实施例。

进一步地，所述免疫动物包括初次免疫和加强免疫。

进一步地，所述方法还包括对动物血清进行提取纯化。所述提取纯化可以采用层析的方法，例如采用多肽交联层析柱对动物血清进行亲和纯化。多肽交联层析柱可以通过购买获得，也可以自行制备，具体制备方法可以参考本文说明书实施例部分。

如上所述，本发明的第十五位酪氨酸磷酸化MLC2抗体的制备方法，具有以下有益效果：

采用本文中的方法制备的抗体可以制备出高效的磷酸化MLC2(Y118)抗体。该抗体可以有效的检测出第一一八位酪氨酸磷酸化后MLC2，对于癌症的进展与预后具有十分重要意义。

附图说明

图1显示为免疫组化的发放验证磷酸化MLC2(Y118)抗体示意图。

图2显示为免疫荧光的发放验证磷酸化MLC2(Y118)抗体示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1抗原氨基酸序列的确定及优化

利用Abdesigner软件对MLC2蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定MLC2的氨基酸序列为KGVLKADY(p)VREMLT(SEQ ID NO.1)多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在C末端增加一个半胱氨酸C，最终待合成多肽序列为KGVLKADY(p)VREMLTC(SEQ ID NO.2)。

实施例2多肽偶联

1.KLH溶解：按下表比例将KLH复溶在已除气纯水中。

表1

2.加SMCC：按下表比例称取Sulfo-SMCC，加入KLH溶液。(注意：Sulfo-SMCC在水或其它常用缓冲液中的溶解度约为10mM，其溶解度随盐浓度的增加而降低。)

表2

3.反应：KLH-Sulfo-SMCC溶液在室温缓慢搅拌60分钟。

4.脱盐：KLH-Sulfo-SMCC溶液用脱盐柱去除游离的Sulfo-SMCC。脱盐柱用3个柱体积的交联缓冲液平衡，然后上样，若体积较大，可分几次上样。待KLH-SMCC溶液进入胶床后，用交联缓冲液洗脱。通过测定280nm的光吸收值收集KLH-SMCC所在的蛋白峰液并收集此峰液。合并每次峰收液。(注意：交联剂可与脱盐柱反应，所以这个脱盐柱只能用于去除游离SMCC。)

5.测定：用Lowry法测定收KLH-SMCC的浓度。

6.分装：根据所测蛋白浓度将KLH-SMCC按3mg/管分装。称取所需多肽(多肽与KLH的重量比为1:1)。

7.将多肽溶于除菌除气纯水中，多肽终浓度为20mg/ml。若溶解后发现完全溶解困难，可助溶。

8.将KLH-SMCC与多肽溶液混合。

9.混合液4℃静音混合仪上反应过夜。

10.称取L-半胱氨酸用于封闭，半胱氨酸与KLH的重量比为2:1。

11.将半胱氨酸加入适量水进行溶解，将溶解后的半胱氨酸溶液加入多肽-KLH混合液中。

12.混合液4℃轻摇反应2小时。

13.封闭完成后，将混合液转移至新处理好的透析袋中，用0.01M PBS透析，期间至少更换2次透析液，每次间隔不少于4小时。

14.透析完成后收集透析袋中全部内容物，尤其是透析中可能形成的沉淀(通常是最好的免疫原)，并用0.01M PBS冲洗透析袋，收集冲洗液。

15.根据经验，多肽与KLH的理论偶联率大约为30％，这个值适用于大部分多肽。例如，用10mg KLH与10mg多肽偶联，最后得到的多肽-KLH偶联物的理论量为13mg。根据理论得率，将多肽-KLH偶联物稀释为1mg/ml。

16.分装：按300ug与200ug分装，做好标记，放入样品盒。

实施例3利用抗原免疫动物

1.抗原乳化

1.1免疫前应根据计划安排，提前准备好抗原乳化所需双联注射器和免疫用玻璃注射器，并贴好标签。

1.2免疫当天根据计划安排，从-70℃冰箱中取出多肽-KLH抗原，根据免疫类型准备好福氏佐剂，基础免疫使用完全福氏佐剂，加强免疫使用不完全福氏佐剂，此步骤须由两人完成，一一核对。

1.3用0.01MPBS将抗原稀释到1ml/羊。

1.4将全部抗原吸入一支乳化用注射器，另一支注射器吸入与抗原液等体积的佐剂，要把注射器中的气体驱除干净。吸入液体前，可在注射器内柄上蘸少许石蜡油，以减少推拉乳化时的阻力。

1.5用双联针头将两只注射器连接起来，用镊子或止血钳拧紧针头，以防出现泄漏。

1.6用力将抗原液快速推入佐剂内(不能先将佐剂推入抗原液内)，然后反复推拉双联注射器，直至乳化完成。推拉时用力要适度，以免双联针头崩开。

1.7用干净平皿盛满冷水，将乳化好的抗原佐剂混合液滴一小滴到水中，如液滴无扩散现象则乳化成功，如有扩散现象，则继续推拉乳化，直至乳化成功。

1.8将经检验乳化合格的抗原通过双联针头转到注射用玻璃注射器中，安上针头待用。转移前必须核对乳化用注射器和注射用注射器及针头标签号是否一致。

2.基础免疫

2.1将需免疫的羊子从笼子中抓出放在操作台上，抓取羊子要按规定方法执行，动作轻柔，必要时要用手轻轻抚摸羊子，待其安静后再行抓取或进行其他操作，尽量避免造成羊子受惊和机械伤害。抓羊时必须核对羊耳号。

2.2一人将羊固定，另一人用弯头手术剪在背部左侧从前到后剪毛，宽度1—2cm。

2.3用75％酒精棉球消毒剪毛处皮肤。

2.4核对注射器标签号与羊子耳号是否一致，然后开始免疫，基础免疫皮下注射8－10个部位，每个部位0.3－0.5ml抗原。

3.加强免疫

3.1按公司计划安排进行加强免疫，加强免疫的基本操作及注意事项同基础免疫。

3.2第一次加强免疫应在羊子背部右侧剪毛进行，切记不能将抗原接种到基础免疫溃疡或有肉芽肿处，以后的加强免疫也应注意这一点。

3.3加强免疫除背部皮下免疫5个点外，增加注射两个肌肉位点。用酒精棉消毒羊两后大腿内侧皮肤，然后将针头刺入肌肉，每个部位注射0.1－0.3ml抗原。

实施例4血清收集

1.检测用血一般采集两次，即第一次加强免疫后第七天采集检测血A，第二次加强免疫后七天采集检测血B。第三次加强免疫后七天采集阳性血后留样作为检测血清。

2.采血前应根据计划提前准备好采血管，写上明显标记，此步骤须有人复核。

3.检测血清按羊子编号每只羊子一管。

4.将需采血的羊子从笼子中抓出并在羊子固定器上固定好，抓取羊子要按规定方法执行，动作轻柔，必要时要用手轻轻抚摸羊子，待其安静后再行抓取或进行其他操作，尽量避免造成羊子受惊和机械伤害。抓羊时必须核对采血管号和羊耳号是否一致。

5.剪去羊耳缘的毛，用酒精棉球擦拭耳廓，并用指甲轻弹静脉部位，使静脉充血突出。

6.用75％乙醇消毒过的一次性注射器针头扎破静脉，出血后用0.5ml离心管采集全血，每只羊采集约0.3－0.4ml全血。

7.采完血后用酒精棉球对伤口进行消毒。

8.将羊子放回相应羊笼。

9.采集到的全血在室温放置1小时左右，使血清析出。

10.上述全血用手掌型离心机离心分离血清，离心时注意离心管平衡。

11.用移液枪吸出血清，转入一灭菌0.5ml小离心管中。

实施例5亲和层析柱的制备

1.多肽与Sulfolink Gel偶联

1.1从4℃冰箱中取出Sulfolink Gel，放置使其达到室温。竖直放好柱子，打开顶盖。一个柱体积交联缓冲液清洗柱子，留少量交联缓冲液于柱子底部，装上底部disc胶固定片。

1.2取Sulfolink Gel混匀好的悬浮液(最后得到胶床体积为2ml)装入层析柱，至少用20ml交联缓冲液平衡，然后装上层析柱底盖。

1.3将溶解好的2mg多肽稀释到2ml交联缓冲液中。

1.4将多肽溶液加入层析柱，装上层析柱顶盖，在层析柱上贴上标签。

1.5在4℃下摇动混匀层析柱反应过夜。

1.6次日取层析柱在室温静置30分钟。

1.7按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，让层析柱中的反应后的多肽溶液排出，并将其收集到一个洁净的管中。

1.8用20ml交联缓冲液洗涤层析柱(交联缓冲液用量不少于5个柱床体积)。

2.封闭Sulfolink Gel上非特异性位点

2.1重新打开层析柱底盖。

2.2取2ml 50mM L-半胱氨酸溶液加入柱中与胶反应，装上层析柱顶盖(L-半胱氨酸溶液与胶的体积比为1:1)。

2.3室温混匀反应2小时。

2.4室温静置30分钟。

2.5放出多余的半胱氨酸溶液。

3.洗柱

3.1按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，排出层析柱中的液体。

3.2用20ml PBS洗涤层析柱，第一遍时把上部的disc胶固定片装上。

3.3然后分别用20ml1 M NaCl，20ml PBS，20ml 100mM Gly-HCl缓冲液清洗层析柱。

4.多肽交联柱的储存

4.1重新装上底盖，向层析柱中加入储存液10ml，使其流出至上层液面与disc胶固定面相距0.8cm左右。

4.2重新装上顶盖。

实施例6亲和纯化

材料

1.动物血清

2.多肽交联层析柱

3.1M Tris·HCl，pH7.5

4.100mM甘氨酸(glycine)缓冲液，PH3.0

5.10mM PBS pH7.4

6.10mM PBST pH7.4(含0.05％Tween20)

7.储存液

注意：所有进入层析柱的液体均须经过除气处理。

操作步骤

1.血清处理

1.1取出待处理的各批次血清，混合。控制每次反应体积为40ml左右，留样用于ELISA检测。

1.2按血清量，加入1/10体积的1M Tris pH7.5缓冲液调pH值，在室温下混匀静置20分钟。

1.3将调过pH值血清样品用除菌0.45um膜过滤。

2.P肽柱层析

2.1从4℃冰箱取出交联好的P肽层析柱，放置至室温。首先取下顶盖，避免空气进入胶床。

2.2取下底盖，让多余的储存缓冲液流出。用10mM PBS pH7.4 20ml清洗层析柱。

2.3从柱中取出P肽偶联的Sulfolink Gel 2ml，与处理后的血清样品混合，将混合样品在静音旋转仪上旋转混匀，在4℃条件下混匀反应过夜或在室温下混匀反应2小时。

2.4空层析柱直立放置于层析架上，加入10mlPBS用洗耳球吸吹以除去层析柱底片及底片下面的空气。将血清-Sulfolink Gel混合溶液分步装入层析柱，Sulfolink Gel沉积形成胶床(防止胶床流干)，用PBS 5－7ml清洗层析柱(洗出胶内含血清)。收集流出液于一个干净瓶子中。

2.5用20ml 10mM PBS pH7.4清洗层析柱，在液面距离胶面还有1－2cm时塞上层析柱的底盖，把胶上面disc胶片装上，再用10ml PBS pH7.4清洗层析柱，最后用10mM PBSpH7.4含0.05％Tween20溶液20ml清洗层析柱。

2.6每个样品准备2个含100ul 1M Tris·HCl PH7.5的1.5ml收集管及一个30m的瓶子，做好标记。

2.7先用100mM甘氨酸(glycine)缓冲液pH3.0 1ml洗层析柱，不收集洗脱液，再用100mM甘氨酸(glycine)缓冲液pH3.0 1ml洗层析柱两次，每次流出液收集于1个1.5ml离心管中，混匀使其pH恢复中性，再根据蛋白多少决定是用瓶子接还是用比色杯接,最后收集至无蛋白为止。

2.8将各管收集液于280nm处比色，光吸收超过0.1的合并入洗脱液用于下一步纯化。

2.9P肽层析过的血清流出液，可按2.1—2.8步骤重复吸收，直到抗体吸收完全为止。

2.10样品如果浓度过高产生沉淀要先离心(3000转10分钟)除去沉淀。测一下最终洗脱液的光吸收。

2.11纯化过血清留样用于ELISA检测。

实施例7ELSIA法检测该抗体的磷酸化特异性

1包被:取蛋白20ul多肽5ul放入1ml包被液中用旋涡混合器混匀，取150ul加入聚乙烯板中，37摄氏度包被2小时。包被好后，用pbst清洗三次，每次五分钟。

2封闭：加封闭剂150ul，37摄氏度封闭一小时。封闭好后，用pbst清洗三次，每次五分钟。

3一抗：取4ul的抗体加入1ml的封闭剂中充分混匀，加150ul到聚乙烯板中，37摄氏度一小时。用pbst清洗三次，每次五分钟。

4二抗：加兔抗加入封闭剂中(1：8000)混匀，加150ul到聚乙烯板中，37摄氏度一小时。用pbst清洗三次，每次五分钟。

5显色：显色液A与显色液B(1：1)混合，放在暗处，取125ul，放入暗处10分钟。

6终止：加2m的硫酸

7结果：用酶标仪测定

表3

实施例8免疫组化

Step1.烤片

烤片的目的是将带有蜡的组织切片牢固地黏在载玻片上，以免染色过程中切片脱落。切片在56～60℃的恒温箱中至少放置1小时才能达到此目的，通常为2～6小时，肉眼观察组织表面的蜡融化彻底即可。由于高温干燥可加速组织中抗原的氧化，因此高温烤片对抗原有破坏作用，可能导致阳性降低，染色定位错误。

Step2.脱蜡和水化

分别在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15～30分钟，以脱掉组织中的蜡。但是，进人组织中的二甲苯不能与水溶性染色液相溶，故需进一步通过下行梯度乙醇把组织中的二甲苯逐步替代出来。切片在100％乙醇工、Ⅱ中分别浸泡5分钟，95％、90％、80％和70％乙醇中分别浸泡2分钟，PBS漂洗3次，每次3分钟，置蒸馏水中待用。

Step3.抗原修复

推荐使用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法，适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法,使得免疫组化结果更加可靠。方法：取一定量pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液(800-1500ml)于压力锅中，大火加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，从喷汽开始计时，3-4分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS(pH＝7.2-7.4)冲洗两次，每次3分钟(2×3')。

Step4.细胞膜打孔

切片置于0.1％～0.3％TritonX-100中，室温浸泡25分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。TritonX-100为去污剂，其脂溶性可使细胞膜穿孔，增加细胞膜对抗体的渗透性。检测细胞膜抗原时可免去此步骤。

Step5.灭活内源性酶及封闭内源性生物素

切片浸泡在3％的H2O2中20分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。在一些细胞中存在过氧化物酶和过氧化氢酶等，最常见的是红细胞(血红蛋白)，另外还有横纹肌细胞(肌球蛋白)、粒细胞和单核细胞(细胞色素)、肝细胞和肾细胞(过氧化氢酶)等，内源性H2O2酶会导致底物H2O2分解，DAB沉淀。注：3％H2O2要现用现配，洗H2O2时用的PBS要与洗其它用的PBS分开。用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。

Step6.非免疫血清封闭

抗体能被组织切片中富有电荷的胶原和结缔组织成分吸附。从而导致背景着色，为了防止这种现象发生，最好在特异性抗体处理切片之前，选择与二抗种属相同的非免疫血清封闭电荷，阻止一抗与之结合，抑制非特异性背景着色。常用方法是用2％～10％羊血清或2％～5％牛血清白蛋白在室温下作用10～30分钟。但应注意此种结合不牢固，所以最好不要冲洗，倾去余液直接加一抗。滴加特异性一抗于切片上，4℃孵育过夜(冰箱拿出后可37℃复温45分钟)，也可在37℃孵育1～2小时。之后，用PBS冲洗3次，每次5分钟。稀释特异性抗体常用含1％～3％非免疫血清的PBS，需现配现用，稀释后的一抗存放时间不可超过三天。不同组织中目的蛋白含量有差异，因此抗体稀释比应参考抗体说明书推荐浓度做梯度稀释，确定最适浓度。注：不要干片，试剂要充分覆盖组织，应超出边缘2mm，用PAP Pen时要超出3-4mm。

Step8.二抗孵育

滴加稀释度合适酶标二抗于切片上，室温孵育30-60min，继而PBS漂洗3次，每次5分钟。二抗有抗鼠、抗兔和抗羊等之分，特异性要与一抗匹配，否则，一抗和二抗连接有误可导致假阴性染色结果。例如，兔抗鼠或人的一抗需与抗兔的二抗匹配，小鼠抗大鼠或人的一抗需与抗小鼠的二抗匹配。注：如二抗为生物素标记，还需要滴加链酶亲和素-HRP。

Step9.显色

显色是免疫组化染色的最后关键步骤，一般过氧化物酶的检测系统选用DAB或AEC显色。前者显色为棕色，后者为红色。要得到最佳的显色效果，必须在镜下严格控制，以检出物达到最强显色效果而背景无色为终止点。根据经验，DAB在配制后最长放置时间是30分钟以内，过时则不能使用，DAB滴加到组织切片时作用时间最长不宜超过10分钟(最好在5分钟内)，否则不管有无阳性结果均应终止反应。对一些富含内源性酶的组织用DAB显色时极易出现背景色，应尽早在镜下控制，以达到最佳分辨效果。DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时洗手，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24小时后方能再次使用。AEC显色系统的弊端是易溶于有机溶剂，所以封片时应以水性封片剂为主，故染色切片不能长期保存。免疫酶染色时，酶底物浓度的增加或孵百盯面雨延长，均可增强染色强度。过氧化物酶显色时，H2O2浓度较大使显色反应过快而致背景加深，且过量H₂O₂能抑制酶的活性，故H₂O₂浓度要适中。如果上述步骤使用链霉亲和素―生物素―碱性磷酸酶复合物，则需选用NBT/BCIP作为显色系统.阳性结果为蓝黑色。显色后蒸馏水或自来水冲洗。采用碱性磷酸酶作为标记物底物时，染色过程中的缓冲液用0.02mol/LTBS(pH 8.2)较好。

Step10.苏木精复染细胞核

为使组织切片清晰的显示组织结构，便于准确定位，常对切片进行复染。最常使用的细胞核染料为苏木精，也可根据情况使用甲基绿和核快红。染色约10秒，镜下控制着色程度，效果好时自来水冲洗返蓝。

Step11.封片

如果选用DAB显色，则切片经过梯度乙醇脱水(80％乙醇2分钟，95％乙醇2分钟)，乙醇Ⅰ和100％Ⅰ乙醇Ⅱ各5分钟，二甲苯Ⅰ和Ⅱ各透明5分钟，最后中性树脂封固；如果选用AEC显色，则切片不能经乙醇脱水，冲洗后拭干直接用水性封片剂封片。

该抗体用于小鼠脾脏石蜡切片的免疫组化结果，稀释比为1:200。结果如何1所示，表明该抗体能够准确的用于IHC实验分析内源性MLC2第一一八位氨基酸的磷酸化状态。

实施例9免疫荧光

1.样本前处理

(1)弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温TBS，清洗2次，每次5秒；

(2)细胞固定：在细胞上覆盖4％中性甲醛固定液(TBS缓冲液配制)，置于4℃，固定15min；固定液需足量；

(3)固定液的清洗：去除固定液，使用4℃预冷的TBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟；

注意：需避免实验操作时温差过大或温度骤变；固定液需保证足量，可过量使用；甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。

2.染色步骤

(1)封闭：用5％空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；

(2)一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于4℃孵育过夜；

(3)复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；

(4)二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；

(5)染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2±0.2TBS缓冲液配制，DAPI溶液：TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；

(6)细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞爬片可取出，盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后，于荧光显微镜下观察并采集图像。

蓝色为DAPI染色细胞核，绿色为tubulin染色，红色为磷酸化MLC2 Y118染色，如图2，图上可以看见hela细胞正在进行有丝分裂，由结果可以判断，该可以可以在细胞层面通过细胞免疫荧光的方式来分析磷酸化MLC2第十五位氨基酸磷酸化的状态。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种用于制备MLC2抗体的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或如SEQ ID NO.2所示的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的衍生的多肽。

2.一种基因片段，其特征在于：所述基因片段能够编码如权利要求1所述的多肽。

3.如权利要求1所述的多肽用于制备MLC2抗体的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述多肽经过偶联以后用于制备MLC2抗体。

5.一种制备MLC2抗体的方法，所述方法为利用所述多肽免疫动物，使得动物产生MLC2抗体，然后通过收集动物血清，即可获得含有MLC2抗体的血清。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述动物为兔子或者羊。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述多肽经过偶联以后用于免疫动物。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述免疫动物包括初次免疫和加强免疫。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对动物血清进行提取纯化。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述提取纯化采用多肽交联层析柱对动物血清进行纯化。