NO905496L

NO905496L - Biologisk forenelige, stoff-spesifikke reagenser til behandling av fysiologiske vaesker.

Info

Publication number: NO905496L
Application number: NO90905496A
Authority: NO
Inventors: Charles Thayer White
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1988-06-20
Filing date: 1990-12-19
Publication date: 1990-12-19
Also published as: EP0427715A1; DK301190D0; JPH03505287A; NO905496D0; WO1989012390A1; DK301190A

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling og anvendelse av biologisk forenelige vannuoppløselige reagen-

ser til fjerning av stoffer fra fysiologiske væsker, om-fattene spesifikke bindingsligander og midler for biologisk forenelighet immobilisert på overflaten av et bærersubstrat.

Oppfinnelsens bakgrunn

Den selektive fjerning av skadelige stoffer fra blod, blodplasma eller andre fysiologiske væsker kan tilveiebringe viktige terapeutiske fordeler. Høye nivåer av sirkulerende lipider, spesielt kolesterol, som fraktes i lavtetthetslipo-protein (LDL), er f.eks. en årsak til atherosklerose. Når den ikke stoppes kan atherosklerose føre til alvorlige sykdommer i sirkulasjonssystemet, noe som fører til slag og/ eller biokardialt infarkt. Reduksjon av LDL-nivåene i plasma er antatt å vesentlig redusere forekomsten av slike tilfeller hos høyrisikopasienter (A.M. Gotto,et al Circulation, 69, 1065A-1090A (1984)). Selektiv fjerning av LDL bør være en effektiv metode for å redusere atherosklerose. På lign-ende måte er evnen til å gripe inn i utviklingen av artritt ved å fjerne sirkulerende rematoid faktor, immunrelaterte sykdommer ved å fjerne antistoffer, eller kreft ved å fjerne maligne celler, etterstrebet i medisinsk vitenskap. For tiden representerer selektiv uttynnelse-plasmaaferese som involverer passering av 2-4 liter blod eller plasma gjennom en utenom legemelig anordning inneholdende det selektive absorp-sjonsmiddel, en attraktiv terapi.

Klinisk anvendelse av slike nødvendige behandlingsmodaliteter bringer den fysiologiske væske i kontakt med fremmede overflater. I tilfelle av blod og blodplasma er en av de resulterende følgetilstander aktivering av komplementkaskaden som kan føre til livstruende anafylakse. Ved prakti-sering av slike behandlingsmodaliteter er blod eller plasma antikoagulert ved anvendelse av citrat og/eller heparin. Citrat anvendes ofte like mye for dens evne til å hemme komplementkaskaden som for dens evne til å blokkere koagu-lering. Avhengigheten av citrat for å inhibere komplementkaskaden kan være risikabel fordi citrat er toksisk ved doser som ligger meget nært opptil den dose som anvendes som et antikoagulasjonsmiddel. Citrat anvendes typisk i en dose hvor mild toksisitet observeres (nummenhet og kribling i leppene).Toksisiteten av citrat skyldes kalsium-gelat-dannelse som forstyrrer normal nerveledning. Anvendeligheten av utenom legemelige anordninger som inneholder ytterst selektive adsorberende materialer er derfor ikke kun avhengig av spesifisiteten og affiniteten av materialet, men også dets biologiske forenelighet med kroppsvev og bio-kjemiske systemer.

Stoffel og Demant (Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 78, 611-615 (1981)) beskriver anvendelsen og effektiviteten av immunadsorpsjonskromatografi for å fjerne lavtetthetslipo-protein fra plasma. Ved anvendelse av polyklonale anti-svin eller LDL-antistoffer kovalent bundet til Sepharose CL-4B, ble svin behandlet med en utenom legemelig anordning inneholdende en plasmaseparator og immunadsorpsjonsmidlet mellombrakt i serier i en arteriell-venøs parallellkrets. Plasma LDL-konsentrasjonen ble funnet å minske progressivt med varigheten av behandlingen og økningen av flytvolumet.

Koren et al. (Biochemica et Biophysica Acta. 8 7 6, 202-207 (1986)) beskriver anvendelsen av et muse-monoklonalt anti-humant-LDL-antistoff koplet til et agarose-støttemater-iale for å fjerne LDL fra plasmaprøver. Ingen aferese ble utført på noen organismer.

Parker et al. (Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 8^, 777-781 (1986)) behandlet pasienter ved hjelp av LDL-aferese ved anvendelse av saue-polyklonale-anti-LDL-antistoffer festet til Sepharose. Vesentlige reduksjoner i LDL-nivåer ble oppnådd ved hjelp av denne terapi.

Europeisk patentsøknad nr. 83112042.3, publisert 6. juni 1984, beskriver anvendelsen av immobilisert heparin eller dextransulfat for å fjerne LDL fra plasma. Det anvendte adsorpsjonsmiddel omfattet en vannuoppløselig porøs hard gel, til hvilken en bindingsligand var festet. Ligand-ene ble festet gjennom reaksjon med epoksygrupper innført i polymergeler ved hjelp av reaksjon med epiklorhydrin eller en polyoksyranforbindelse, eller i tilfelle av uorganiske geler, med epoksygrupper innført ved hjelp av reaksjon med epoksysilan-koplingsmidler. Geler med overflate-hydroksylgrupper ble derfor foretrukket. Selv om mange selektive bindingslegander ble beskrevet, ble kun heparin og dextransulfat (adsorpsjonsmidler som fjerner mange plasmaproteiner) eksemplifisert som LDL-fjerningssystemer.

Japansk patentsøknad JP60087854 skriver et blod-rensende adsorpsjonsmiddel til fjerning av maligne stoffer eller celler fra blod eller plasma. Adsorpsjonsmidlet omfatter en bærer som glass, trekull, cellulose-triacetat,

og forskjellige polymerer til hvilke en negativt ladet forbindelse og en organisk ligand er bundet. Bindingen krever imidlertid anvendelse av sterke elektrofile reagenser som ikke kan anvendes i samtidige eller etterfølgende reaksjoner som omfatter komplekse biologiske bindingsligander.

Europeisk patentsøknad EP-103184A beskriver biospesi-fikke polymerer som bærer imobiliserte biologiske midler.

Det biologisk forenelige polymer-støttemateriale vanligvis en hydrogel eller en annen fuktningsbar polymer, til hvilken et biologisk middel er kovalent bundet. Det er ikke beskrevet noen biologisk forenelige midler som generelt ville tilveiebringe beskyttelse mot motsatte reaksjoner in vivo.

Japansk patentsøknad J602239425 beskriver anvendelse av faste bærere til hvilke er bundet monoklonale antiapo-lipoprotein B-antistoffer, for å fjerne LDL fra humant plasma. Ingen biologiske forenelighetsmidler ble anvendt for å fremme beskyttelse mot motsatte reaksjoner med vev eller systemer in vivio.

Japansk patentsøknad JP59200655 beskriver anvendelse av et adsorpsjonsmiddel bestående av en uoppløselig bærer, fortrinnsvis hydrofil, med en bundet organisk forbindelse inneholdende en negetivt ladet gruppe. Immobiliseringen av bindingsliganden foregår gjennom den negativt ladede gruppe. Anvendelsen av adsorpsjonsmidlet for å fjerne maligne celler er diskutert.

Det eksisterer i dag et klart behov for et adsorpsjonsmiddel som inkorporerer spesifikke bindingsligander og biologiske forenelighetmidler for å fjerne skadelige stoffer fra fysiologiske væsker. Slike midler bør utvide både høy selektivitet og beskyttelse mot aktivering av komplement-systemet eller blodkoaguleringen. Forhøyet biologisk forenelighet av reagenset ville muliggjøre en reduksjon av mengdene av de administrerte anti-koaguleringsmidler. Aktiviteten av komplekset biologiske ligander er ytterst sensitive overfor immobiliseringsteknikken. Det er også påkrevet at en metode for fremstilling av slike reagenser er mild nok til å unngå denaturering, og likevel fleksibel nok til å tillate samtidig eller sekvensiell immobilisering av bindingslegander og biologiske forenelighetsmidler.

Sammendrag av oppfinnelsen

Det er oppfunnet en fremgangsmåte for immobilisering av både spesifikke bindingslegander og biologiske forenelighetsmidler på mange forskjellige bærersubstrater. De nye fremstilte reagenser fjerner stoffer fra fysiologiske væsker, mens motsatte reaksjoner som komplementaktivering minimali-seres. Et spesifikt aspekt av foreliggende oppfinnelse er et vannuoppløselig reagens for fjerning av et stoff fra fysiologiske væsker omfattende (a) et bærersubstrat, og immoblisert på overflaten av bærersubstratet, (b) en bindingsligand spesifikk overfor stoffet, og (c) et biologisk forenelighetsmiddel omfattende et organisk molekyl med en nukleofil del og en negativt ladet del adskilt ved hjelp av en avstandsarm, hvor det biologiske forenelighetsmiddel er immobilisert på overflaten gjennom reaksjon med den nukleofile del. Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse involverer en fremgangsmåte for fremstilling av et slikt vannuoppløselig reagens til fjerning av et stoff fra fysiologiske væsker, omfattende trinnet ved at et bærersubstrat bringes i kontakt og omsettes med en vandig løsning av en bindingsligand som er spesifikke overfor stoffet, og et biologisk forenelighetsmiddel omfattende et organisk molekyl med en nukleofil del og en negativt ladet del adskilt ved hjelp av en avstandsarm. Denne fremgangsmåte kan om-fatte at bærersubstratet bringes i kontakt med og omsettes med de vandige oppløsninger av bindingsligand og biologisk forenelighetsmiddel både samtidig og sekvensielt. Ytterligere et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse innbefatter en fremgangsmåte til behandling av en fysiologisk væske for å fjerne et stoff, omfattende at væsken bringes i kontakt med et vannuoppløselig reagens som beskrevet ovenfor. Som et siste aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en apparatur til utenom legemelig behandling av fysiologiske væsker for å fjerne et spesifikt stoff, omfattende metoder til fjerning av friskt blod fra et pattedyr, metoder for adskillelse av plasma fra det friske blod, metoder for behandling av plasmaet, innbefattende et kammer inneholdende et vannuoppløselig reagens som beskrevet ovenfor som vil reagere med og fjerne stoffet fra plasmaet, og fremgangsmåter for rekombinering av det vesentlig stoffrie plasma med resten av det friske blod og for returnering av det reKombinerte friste blod til pattedyr.

I tilfelle av fjerning av LDL fra blodplasma vil foretrukne reagenser og fremgangsmåter innbefatte et aktivert, nøytralt polymer-bærersubstrat, et polyklonalt anti-LDL-antistoff, og et biologisk forenelighetsmiddel, hvor immobiliseringen utføres i to trinn ved en pH fra tilnærmet 4 til 10, kontrollert av en ikke-nukleofil buffer. Fortrinnsvis, på grunn av letthet ved fremstilling og/eller effekti-vitet ved anvendelse, dannes reagenset ved immobilisering av monoklonalt anti-LDL-antistoff og sulfamidsyre på tresyl-sepharose i en entrinns samtidig reaksjon ved tilnærmet pH

8 i kaliumfosfatbuffer.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er et søylediagram som representerer LDL- og HDL-plasmakonsentrasjoner før og etter behandling for to eksperimenter ved anvendelse av humant plasma in vitro.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Fremstilling av materialer

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en allsidig fremgangsmåte for syntetisering av nye biologiske forenelige reagenser til fjerning av spesifikke stoffer fra fysiologiske væsker gjennom immobiliseringen av spesifikke bindingsligander og biologiske forenelighetsmidler på substratbærere under milde betingelser, som konserverer aktiviteten av sensitive biologiske ligander. Innen rammen av foreliggende betingelse anvendes et antall betegnelser. Som anvendt heri betegner et "bærersubstrat" en fast støttematriks "aktivert" ved hjelp av velkjent koplingskjemi for å introdusere re-aktive overflatedeler som er mottakelige overfor nukleofile angrep og forskyvninger ved hjelp av bindingsligander eller biologiske forenelighetsmidler som skal immobiliseres på bærersubstratet. "Bindingsligand" refererer til ethvert stoff, eller gruppe av stoffer, som har spesifikk bindings-affinitet overfor stoffet som skal fjernes fra den fysiologiske væske og utelukker andre stoffer. Bindingsliganden kan bestå av et polyklonalt eller monoklonalt antistoff i form av antiserum eller ascitesvæske, en IgG-fraksjon eller i form av et aktivt fragment av slike materialer. Andre spesifikke bindingsproteiner, f.eks. lectiner, antigener eller protein A kan anvendes. Som anvendt heri refererer "biologisk forenelighetsdel" til et stoff som gjør bærersubstratet mer biologisk forenelig overfor komplementaktivering. Betegnelsen "nukleofil del" refererer til kjemiske grupper, f.eks. NH^, SH eller OH, som inneholder et uopptatt elektronpar og vanligvis angriper et annet molekyl på et sted hvor atom-kjernen er dårlig beskyttet av yttre elektroner. Som anvendt heri refererer betegnelsen "negativt ladet del" til kjemiske grupper, f.eks. OSO^, RSO^, RSC^, C00 , som inneholder en negativ nettoladning. Den nukleofile del og den negativt ladete del inneholdes innen den samme molekylære entitet som utgjør en "avstandsarm" som adskiller de to funksjonelle deler.

Som anvendt heri refererer betegnelsen "nøytral polymer" til et vannuoppløselig materiale, enten naturlig eller syntetisk, som består av gjentagende underenheter og som kan utformes i mange forskjellige mulige konfigurasjoner slik som flate plater, fibere, perler, porøse perler, membraner og skum.

"Ikke-nukleofil buffer" refererer til ethvert vann-buffrende stoff som ikke inneholder en nukleofil del slik som R-OH, R-SH, R-NH^, R2NH. "Polyklonalt antistoff" refe-

rerer til enhver samling av antistoffer mot et stoff, hvor samlingen av antistoffer mot et stoff oppstår fra mange forskjellige antistoffproduserende celler. "Monoklonalt antistoff" refererer til ethvert antistoff som dannes fra en enkel antistoffproduserende cellelinje.

Bærersubstrat

De vandige oppløselige reagenser ifølge foreliggende oppfinnelse involverer immobiliseringen av bindingsligander og biologiske forenelighetsmidler på aktiverte faste støtte-matrikser (bærersubstrater), ved anvendelse av en slik mild koplingskjemi at sensitive biologiske ligander og biologiske forenelighetsmidler kan reageres samtidig. Immobiliserings-prosessen er vist skjematisk i reaksjonsligning 1,

som viser muligheten av enten sekvensiell eller samtidig reaksjon av bindingsliganden (L) og det biologiske forenelighetsmiddel (BA). Aktivering av forskjellige faste støtte-matrikser oppnås ved anvendelse av en egnet kjemi for materialet for å innføre en kjemisk del (ACT) som er mottakelig for nukleofilt angrep av kjemiske grupper i bindings-legandmolekylene og det biologiske forenelighetsmiddel.

Mange forskjellige materialer er egnede som faste støttematerialer for foreliggende oppfinnelse. Disse materialer har generelt de følgende karakteristika: (1) tilstrek-kelig overflateareale til effektivt å fange opp og fjerne målsubstansen, enten på grunn av tilstedeværelsen av porer eller tilgjengeligheten i en finfordelt tilstand, (2) fysiologisk væske tillates å strømme over eller gjennom materialet når det innelukkes i en utenom legemelig behandlings-apparatur, (3) kjemiske overflategrupper som kan aktiveres etterfølgende reaksjon med bindingslegand og biologisk forenelighetsmiddel, (4) stabile overfor biologisk miljø. Materialer som oppfyller disse kriterier innbefatter syntetiske polymerer, naturlige polymerer, silisiumoksyd, aluminiumoksyd og zirkoniumoksyd. Den fysiske geometri av den faste støttematriks kan være i form av en partikkel, perle, fiber, hul fiber, tynt ark, skum, eller enhver annen form som tillater væskestrøm over eller gjenommaterialet. Tabell I viser en liste over forskjellige kommersielt tilgjengelige bærersubstrater som kan anvendes for å utøve foreliggende oppfinnelse Listen er representativ for de andre materialer og aktiveringskjemier som tilfredsstiller de ovenfor angitte fire kriterier vil være kjent for fagmannen.

Aktivering av støttematriksmaterialer for å frem-stille egnede bærersubstrater med overflategrupper mottakelige for nukleofile angrep utføres ved hjelp av velkjente kjemiske teknikker og prosessreagenser. Se Scouten, W.H., Affinity Chromatography: Bioselective Adsorption on Inert Matrices, Wiley&Sons, New York, (1981), inkorporert heri ved referanse. I tilfelle av syntetiske og naturlige polymerer, kan aktiveringsreagenser innbefatte cyanogenhalider epyklorhydriner, polyoksyraner, periodrater, polyetylen-iminer, eller glutaraldehyd. Når det mest foretrukne reagens for fjerning av LDL fra blodplasma, omsettes Sepharose^4B (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige; agarosegel-perler) inneholdende overflate-hydroksylgrupper, med tresylklorid (2,2,2-trifluoretansulfonylklorid) for å produsere en overflate-sulfonatester (tresyl-aktivert Sepharose<®>4B, Pharmacia Fine Chemical) som avbildet skjematisk i reaksjonsligning 2.

agarose-tresylklorid "tresyl-aktivert" agarose

Slike sulfonatestere er rapportert å undergå nukleofil forskyvning av aminer, tioler, hydroksyl, og imidazol-grupper for å produserer stabile kjemiske bindinger som immobiliserer forskjellige bindingsligander (Nilsson, K. og Mosbach, K., Biochem Biophys. Res. Comm., 102, 449-457 (1981)

og Methods in Enzymology, 104, 56-69 (1984).

Når det gjelder uorganisk støttematriksmateriale innbefattende silisiumoksyd, aluminiumoksyd eller zirkoniumoksyd, kan aktivering oppnås ved hjelp av en reaksjon med et epoksysilan som gamma-glysidoksypropyltrimetoksysilan, et aminosilan som gamma-aminopropyltrietoksysilan, "eller polyetylenimin-glutaraldehyd.

Bindingsligand

Mange forskjellige bindingsligander kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse avhengig av det spesifikke stoff som skal fjernes fra den fysiologiske væske. Bindingsligander som besitter høy spesifisitet tillater den selektive fjerning av stoffet med den minste totale innvirkning på sammensetningen av den fysiologiske væske som behandles. En representativ liste over bindingsligander, konjugert stoff som skal fjernes, og sykdommen som skal behandles tilveie-bringes i tabell II.

Det skal underforstås at bindingsligandene ifølge foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til de som er oppført i tabell II, som er ment å være illustrerende.

Disse bindingsligander kan anvendes alene eller i bland-inger hvis hensiktsmessig.

I tilfelle av fjerning av LDL fra blodplasma, er høyspesifikke monoklonale antistoffer mest foretrukkne som bindingsligander. Et anti-LDL-antistoff ble fremstilt ved anvendelse av en standard monoklonal antistoff-immuniserings-protokoll og fusjonsprotokoll (Vernon T. Oi og Leonard A. Herzenberg. Selected Methods in Cellular Immunology, Eds.

B. MØishell og S. Shiigi, 1980, s. 351-372) Balb/CJ-mus ble immunisert med renset humant LDL med og uten fullstendig Freunds hjelpemiddel. Musene ble injisert med en booster

med regelmessige mellomrom og tappet for blod ved forskjellige tidspunkter i flere uker etter immuniseringene. Serum-prøver ble testet ved hjelp av ELISA for å bestemme mengden av tilstedeværende anti-LDL-antistoffer i de immuniserte mus i forhold til de ikke-immuniserte Balb/CJ.

Flere måneder etter den første immunisering ble musene på nytt injisert med antigen og den første fusjon ble utført. En miltcellesuspensjon fra en behandlet mus ble fusjonert med SP2/O-myelomceller, blandet med en bestrålet milt-matecellesuspensjon og utspredt. Klonene ble tilført næring ved forskjellige mellomrom og observert for vekst.

Kloner ble utvalgt og analysert for å bestemme mengden av produsert IgG, og hver klon ble isotypebestemt. Kloner ble testet regelmessig for å overvåke IgG-produksjon. Ved et senere tidspunkt ble cellesupernatanter fra utvalgte kloner testet i en LDL ELISA for å bestemme spesifikk aktivitet av hver utvalgt klon. De mest produktive kloner ble utvalgt og dypfrosset i flytende nitrogen. Flere av de bedre kloner ble subklonet og analysert for å sikre at et monoklonalt anti-LDL ble produsert, og for å prøve å øke IgG-produksjonen og LDL-spesifisitet. Alle klonene'som pro-duserte spesifikt anti-LDL-monoklonalt antistoff ble analysert videre med hensyn til andre faktorer, som stabilitet, antistoffproduksjon og affinitet,som ville tilveiebringe ut-velgelse av de beste kloner for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse.

Biologisk forenelighetsmiddel

Et antall bifunksjonelle kjemiske entiteter som omfatter både en nukleofil del, for reaksjon med bærersubstratet, og en negativt ladet del adskilt ved hjelp av en avstandsarm, betraktes som biologiske forenelighetsmidler ifølge foreliggende oppfinnelse. Den negativt ladete del festes til overflaten etter reaksjonen av den nukleofile del med bærersubstratet for å immobilisere det biologiske forenelighetsmiddel.

Mange kombinasjoner av nukleofil del og negativt ladet del vurderes ved foreliggende oppfinnelse. Nukleofile deler innbefattende f.eks. RNH2, RHS, ROH eller R2NH kan anvendes. Negativt ladete deler innbefattende OSO^, RSO^, RSC>2, CC>2, er egnede. En representativ liste over biologiske forenelighetsmidler er vist i tabell III.

Det fremgår fra tabell III at et antall bifunksjonelle molekyler med adskilte nukleofile og negativt ladete deler kan virke som biologiske forenelighetsmidler. Det er underforstått at den molekylære struktur, i hvilken slike deler inkorporeres, tjener som en avstandsarm for å adskille delene og tillate uavhengig funksjon, dvs. reaksjon med bærersubstrat og beskyttelse mot motsatte biologiske inter-aksjoner. I seg selv er avstandsarmen ikke kritisk og fagmannen kan utvelge forskjellige molekylære strukturer som avstandsarmer hvori de funksjonelle deler skal inkorporeres.

Vannuoppløselig reagens

Bindingsligander og biologiske forenelighetsmidler immobiliseres på overflaten av bærersubstratet ved hjelp av nukleofile fortregningsreaksjoner som involverer en nukleofil del av bindingsliganden eller det biologiske forenelig-hetsmidddel, og den aktiverte del på bærersubstratet. I tilfelle av proteinbindingsligander som antistoffer, tjener det store antall aminogrupper innen antistoffet som nukleofile deler for en egnet reaksjon. Prosessen ifølge foreliggende oppfinnelse er vist skjematisk i reaksjonslign-

ing 1.

Samtidig binding av en bindingsligand og et biologisk forenelighetsmiddel til bærersubstratet: I denne prosess fremstilles det vannløselige reagens ved å tilsette bærersubstratet til en reaksjonsløsning inneholdende det biologiske forenelighetsmiddel og bindingsliganden, eller omvendt. Bærersubstratet, slik som de som er oppført i tabell I, kan tilsettes i form av et tørt materiale, eller fuktet ved hjelp av en egnet buffer. Reaksjons-løsningen inneholder bindingslegand i en konsentrasjon fra tilnærmet 10 mg/ml til 100 mg/ml, og biologisk forenelighetsmiddel i en konsentrasjon fra tilnærmet 0,01 M til 5 M. Re-aks j onsløsningen kan også buffres med enhver ikke-nukleofil buffer, slik som fosfat, ved en bufferkonsentrasjon fra tilnærmet 0,01 M til 5 M. pH-området av reaksjonsløsningen kan variere fra tilnærmet 4 til 10. Etter kombinasjon av re-aks j onsløsningen med bærersubstratet, omrøres den resulterende blanding i 30 minutter eller lengere, inntil flere dager hvis nødvendig, ved enhver temperatur som ikke fryser blandingen eller deformerer bærersubstratet, typisk 4 °C til 45 °C. Etter kopling adskilles reaksjonsløsningen fra det vannløselige reagens og skylles for å fjerne ureagert biologisk forenelighetsmiddel og bindingslegand. Det resulterende derivatiserte bærersubstrat omfatter det vannuoppløselige reagens.

Trinnvis binding av en bindingsligand og et biologisk forenelighetsmiddel til bærersubstratet: I denne prosess fremstilles det vannuoppløselige reagens først ved omsetning av bærersubstratet med bindingsligand og deretter tilsetning av biologisk forenelighetsmiddel til reaksjonsløsningen i et andre trinn. Dette er den foretrukne fremgangsmåte i de tilfeller hvor biningsliganden og det biologiske forenelighetsmiddel ikke er forenelige i den samme løsning, eller dersom reaksjonsbetingelsene for immobilisering av bindingsligand og biologisk forenelighetsmiddel er vesentlig forskjellige. Områdene for reaksjons-parameterene i trinnvise reaksjoner er de samme som for de samtidige reaksjoner beskrevet ovenfor.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av Anti- LDL vannuoppløselig reagens ved anvendelse av samtidig binding av anti- LDL- monoklonalt antistoff CLLl ( bindingsligand) og sulfamidsyre ( biologisk forenelighetsmiddel) : Tresyl-Sepharose (bærersubstrat; 35 g) ble sterili-sert ved vask med aceton og filtrert gjennom en steril sintret glasstrakt. De acetonvaskede perler ble deretter overført til en steril rotasjonskolbe (som en hjelp til å overføre perlene anbefales at perlene fuktes lett med aceton). Til rotasjonsbeholderen ble tilsatt 105 ml av re-aks j onsblandingen inneholdende monoklonalt antistoff CLLl (3,0 mg/ml), sulfamidsyre (0,25 M) og kaliumfosfat (0,25 M) ved pH 8,0. Blandingen ble forsiktig omrørt over natten (16 timer) ved omgivelsestemperatur. Etter omrøring over natten ble blandingen filtrert ved anvendelse av en sintret glasstrakt og det kombinerte sorbsjonsmiddel ble vasket med 1 liter sitronsyre (pH 3,0), etterfulgt av 1 1 buffret salt-løsning (pH 7,1). Filtratet ble innsamlet for behandling og anvendelse på nytt. Det sterilse anti-LDL sorbsjonsmiddel ble overført til en steril beholder hvor mertiolat var tilsatt (sluttkonsetrasjon 0,1 %) som et steriliserende konserveringsmiddel inntil videre anvendelse.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av anti- LDL vannuoppløselig reagens ved anvendelse av trinnvis binding av anti- LDL- monoklonalt antistoff CLLl ( bindingsligand) og sulfamidsyre ( biologisk for-ene lignetsmidde1: Tresyl-sepharose (bærersubstrat; 0,5 g) ble "sterili-sert ved vask med aceton og filtrering gjennom en steril sintret glasstrakt. De acetonvaskede perler ble deretter over-ført til et sterilt sentrifugerør (som en hjelp til å over-føre perlene anbefales at perlene fuktes lett med aceton). Til sentrifugerøret ble tilsatt 5 ml av reaksjonsløsningen inneholdende monoklonalt antistoff CLLl (3,0 mg/ml), og natriumbikarbonat (0,10 M) ved pH 8,0. Blandingen ble omrørt forsiktig i 4 timer ved omgivelsestemperatur. Antistoffløsn-ingen ble adskilt fra bærersubstratet ved hjelp av sentri-fugering ved 1000 x g i 10 min. og dekantering av det ureagerte antistoff. Sulfamidsyre (0,20 M) i natriumkarbonat-buffer (0,05 M), pH 9,0, ble deretter tilsatt og blandingen ble omrørt over natten (16 timer) ved omgivelsestemperatur. Etter omrøring over natten ble blandingen filtrert ved anvendelse av en sintret glasstrakt og det anti-LDL vannuopp-løselige reagens ble vasket med 1 1 sitronsyre (pH 3,0), etterfulgt av 1 1 buffret saltløsning (pH 7,1). Den dekan-terte supernatant og filtratet ble innsamlet for behandling og anvendelse på nytt. Den sterile anti-LDL vannuoppløselige reagensblanding ble overført til en steril beholder som var tilsatt mertiolat (sluttkonsentrasjon 0,1 %) som et steriliserende konserveringsmiddel inntil videre anvendelse.

Anvendelse

Det vannuoppløselige reagens beskrevet ovenfor kan anvendes for selektiv fjerning av stoffer fra fysiologiske væsker som er bundet ved hjelp av bindingsliganden. Det vannuoppløselige reagens kan inneholdes i en beholder som tillater strømming av den fysiologiske væske gjennom det vannuoppløselige reagens. Dersom den fysiologiske væske er blod eller blodplasma kan det vannuoppløselige reagens anvendes for å fjerne et stoff som er forbundet med en sykdom eller en sykdomsprosess, fra blodet eller plasmaet. Dette kan være tilfelle i et antall sykdommer hvor det er kjent eller antatt at fjerningen av det sykdomsassosierte stoff ville være fordelaktig. Disse sykdommer innbefatter auto-immunsykdommer, metabolske forstyrrelser og andre. En mer fullstendig liste av sykdommer som kan være mottakelig for denne terapi, stoffet (stoffene) som skal fjernes, og de mulige ligander som kan utføre dette er vist i tabell II. Det vannuoppløselige reagens er oppført i tabell I, en eller flere av bindingsligandene er oppført i tabell II, og en eller flere av de biologiske forenelighetsmidler er oppført i tabell III.

For illustrere anvendelsen av foreliggende oppfinnelse vil et terapeutisk formål, inneholde et volum eller en mengde av et reagens som beskrevet ovenfor i en beholder som vil tillate gjennomstrømningen av blod eller plasma. Antikoagulert blod eller plasma fra en pasient pumpes gjennom beholderen som inneholder det vannuoppløselige reagens og bringes deretter tilbake til pasienten. Blodet eller plasmaet som behandles på denne måte vil således være upåvirket med unntak av at det uønskede stoff bundet ved hjelp av bindingsliganden i det vannuoppløselige reagens er fjernet. Det foreligger to parametere som kan benyttes for evaluering av utførelsen eller anvendeligheten av systemet: 1) effektiviteten av bindingsliganden, og; 2) effektiviteten av det biologisk forenelige middel.

Effektiviteten av bindingsliganden kan bestemmes ved å måle mengden av et stoff i den fysiologiske væske før og etter passering gjennom det vannuoppløselige reagens. Mengden av det fjernede stoff er et mål for ytelsen av reagenset. Analysesystemet for måling av den mengde stoff som er fjernet er selvsagt avhengig av stoffet. For ytterligere å illustrere hvordan dette kan gjennomføres, når det gjelder LDL, dynkes plasma som er antikoagulert over et anti-LDL vannuoppløselig reagens. Prøver av plasmaet, før og etter dynking over det kombinerte sorbsjonsmiddel, innsamles og analyseres. Plasmaprøver analyseres deretter for total kolesterol og HDL. LDL-nivåene beregnes lett fra verdiene for HDL og totalt kolesterol, fordi det totale kolesterolnivå i

plasma antas å være summen av HDL og LDL.

Bestemmelsene av totalt kolesterol utføres ved hjelp av standard kliniske laboratoriefremgangsmåter. Denne fremgangsmåte er en kvantitativ enzymatisk reaksjon ved anvendelse av kolesteroloksydase etterfulgt av kjemisk forsåpning av kolesterolesterne. Biproduktet av kolesteroloksydasen ^H2^2^ koples med peroksydase og et kolerimetrisk substrat. Denne reaksjon fører til et farget sluttprodukt som kan måles ved anvendelse av et spektrofotometer (Stein, E. A., In, Textbook of Clinical Chemistry, Tietz, N. W., Ed.,

WB Saunders, Philadelphia, 1986, s. 879-886, 1818, og 1829).

HDL-bestemmelsene utføres ved først å utfelle LDL, ved anvendelse av et utfellingsmiddel, etterfulgt av analy-sering av supernatanten via den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for bestemmelse av totalt kolesterol.

Effektiviteten av det biologiske forenelighetsmiddel kan bestemmes ved måling av mengden komplementaktivering i plasmaet som et resultat av innvirkning av det kombinerte sorbsjonsmiddel. Svekkelse av komplementaktiveringen sammenlignet med den ubehandlede polymerbærer viser ytelsen av det biologiske forenelighetsmiddel. Aktivering av komplementkaskaden ved hjelp av et fremmed stoff foregår via aktivering av en alternativ reaksjonsvei. Bestanddelene til komplementkaskaden som bestemmes kvantitativt for å bestemme aktiveringsmengden er C, og • C^a(eller ) bestemmes ved hjelp av en kjent RIA-teknikk (se Chenweth, D.E. og Hugli, T.E., J. Biol. Chem 250. 8293 (1975), inkorporert heri ved referanse) hvori antistoffer spesifikke overfor humant C3 , a (eller Cv Id a) tillates å reagere med en heparin-antikoagulert plasmaprøve som er utsatt for det vannuopp-løselige reagens. Anvendelse av andre antikoaguleringsmidier som citrat, kan føre til en betydelig endring av komplementaktivering. Bindingsgraden av det spesifikke antistoff til ^/-i3a (eller C^g) bestemmes ved hjelp av en radioisotopprobe. Mengden av Cj0 a (eller Cc ba) i en plasmaprøve kan deretter beregnes av den målte radioaktivitetsmengde. Mengdene av C^g og C^asummeres for å gi en verdi som er representativ for den totale in vitro komplementaktivering av det testede materiale.

Det vannuoppløselige reagens kan inneholdes i forskjellige utformede beholdere avhengig av den fysiske form av det faste støttemateriale eller anvendelsen. Utformingen av den anvendte apparatur er ikke kritisk i denne forbindelse, enhver apparatur som tilbakeholder det vannuoppløse-lige reagens og tillater gjennomstrømming av den fysiologiske væske kan anvendes.

Ved anvendelse av de ovenfor beskrevne teknikker kan effektiviteten av det vannuoppløselige reagens til å fjerne LDL fra plasma demonstreres ved måling av LDL-nivåene før og etter dynking av en plasmaprøve over det vannuoppløselige reagens. Ved anvendelse av det vannuoppløselige reagnes ifølge eksempel 1, omfattende anti-LDL monoklonalt antistoff CLLl (bindingsligand) og sulfamidsyre (biologisk forenelighetsmiddel) immobilisert på tresylsepharose, illustreres påvisningen av LDL-binding til immunsorbsjonsmidlet og fjerning av LDL fra plasma, ved de to eksperimenter vist i figur 1. Verdiene for LDL-kolesterol (fylte søyler) og HDL-kolesterol (skraverte søyler; totalt kolesterol er summen av HDL og LDL) før og etter plasmabehandling med immun-sorbsj onsmidlet er vist. Immunsorbjonsmidlet fjerner effektivt LDL fra plasma enten det anvendes et plasma med høyt kolesterolinnhold (> 300 mg/dl) eller et plasma med lavt kolesterolinnhold (155 mg/dl). Det bør også bemerkes at HDL-nivåer er upåvirket av behandlingen med LDL-immunsorbsjonsmidlet, noe som bekrefter spesifisiteten av de vannuoppløse-lige reagenser.

Effektiviteten av det biologiske forenelighetsmiddel til å dempe komplementaktivering i plasmaet, sammenlignet den ubehandlede polymerbærer, er vist i tabell IV.

Som tidligere angitt er denne totale komplementaktivering summen av C^aog C og uttrykkes som jjg/ml i testplasmaet. Behandling med sulfanilsyre og sulfamidsyre fører til anvendelse av et biologisk forenelighetsmiddel fra tabell III, og det observeres en vesentlig reduksjon i komplimentaktiveringen av dette materiale. Behandling med tris (tris(hydroksymetyl)aminometan, Sigma Chemical Company)) eller vannhydrolysert tresyl-sepharose inkorporerer ikke den negativt ladete del i overflaten og gir ikke den beskyttelse som erholdes fra anvendselsen av det biologiske forenelighetsmiddel.

Et kombinasjons-sorbsjonsmiddel fremstilt med en bindingsligand og et biologisk forenelighetsmiddel gir både bindingsegenskaper og biologiske forenelighetsegenskaper til det vannuoppløselige reagens. Det vannuoppløselige reagens fremstilt ved anvendelse av anti-LDL-antistoff CLLl og sulfamidsyre (eksempel 1) viser spesielt den kombinerte effekt; det biologiske forenelighetsmiddels evne til å svekke komplement, og bindingsligandens evne til å binde og fjerne LDL. Resultatene i tabell V viser mengden bundet LDL

i mg pr. ml vannuoppløselig reagens, så vel som den assosi-erte komplementaktivering.

Eksempel 1

Anvendelse av anti- LDL kombinert sorbsjonsmiddel for å fjerne LDL fra plasma;

Anti-LDL-reagenset, som beskrevet ovenfor (1,5 ml) ble pakket i 1,0 x 10 cm kolonne inneholdende en frittet skive på bunnen for å tilbakeholde det vannuoppløselige re-agensmateriale. Det pakkede regens ble vasket med flere søylevolumer fosfatbuffret saltløsning ved pH 7,4 for å fjerne mertiolatet. Sitronsyrebehandlet plasma (9,0 ml) ble deretter resirkulert gjennom kolonnen i 1 time. Prøver av plasma før og etter resirkulering ble analysert for å bestemme mengden av LDL eller andre bestanddeler som var fjernet fra plasmaet. Fjerningen av LDL fra plasma er illu-strert i figur 1. Kvantitativ bestemmelse av lipoprotein-nivåene (HDL og LDL) i plasma oppnås ved å måle kolesterol-innholdet i det respektive lipoprotein. LDL-kolesterolverdiene (fylte søyler) og HDL-kolesterolverdiene (skraverte søyler; totalt kolesterol er summen av HDL og LDL) før og etter behandling av plasmaet med anti-LDL vannuoppløselig reagens er vist. I forsøkene som er avbildet i figur ble to plasmaprøver dynket over reagenset. Det skal bemerkes at reagenset fjernerLDL effektivt både når det anvendes et plasma med høyt kolesterolnivå (> 300 mg/dl) eller et plasma med lavt kolesterolnivå (155 mg/dl). Tabell VI viser effekten av plasma-resirkuleringen over det vannløselige reagens, på de andre bestanddeler før og etter resirkulering. Det ble ikke observert noen signifikante endringer i nivåene av de andre plasmabestanddeler.

Den ovenfor angitte detaljerte beskrivelse og de spesifikke eksempler angir foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse, og er ment å være illustrerende. Fra foreliggende beskrivelses kan en fagmann forvisse seg

om de vesentlige karakteristika for foreliggende oppfinnelse, og utføre forskjellige endringer og modifikasjoner av oppfinnelsen for å tilpasse den til forskjellige anvendelses-områder og betingelser, uten å avvike fra oppfinnelsens ramme.

Claims

1. Vannuoppløselig reagens til fjerning av et stoff fra fysiologiske væsker, karakterisert ved at det omfatter (a) et bærersubstrat, og immobilisert på overflaten av bærersubstratet, (b) en bindingsligand spesifikk overfor stoffet, og (c) et biologisk forenelighetsmiddel omfattende et organisk molekyl med en nukleofil del og en negativt ladet del adskilt av en avstandsarm, hvor det biologiske forenelighetsmiddel er immobilisert på overflaten gjennom reaksjon med den nukleofile del.

2.V annuoppløselig reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at bærersubstratet er en nøytral polymer.

3. Vannuoppløselig reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at den nøytrale polymer er utvalgt fra gruppen bestående av Affigel 10, Affigel 15, tresyl-sepharose, CNBr-sepharose, Reacti-gel (CDI aktivert agarose/dextran), Eupergitt C, epoksyaktivert sepharose, epoksyaktivert silisiumoksyd, karboksy-sepharose, tiol-(aktivert) sepharose, tritylagarose, oksiran akrylsyre-perler, p-nitrofenolagarose, tosylagarose, periodatbehandlet agarose, aktivert CM-cellulose, aktivert cellulose, poly-glycidyl-metakrylat. PEI-glutaraldehyd-aktivert nylon, PEI-glutaraldehyd-aktivert silisiumoksyd, glutaraldehyd-aktivert agarose, isocyanat-aktivert agarose, maleimid-aktivert agarose, og klormetylpolystyren.

4. Vannuoppløselig reagens ifølge krav 3, karakterisert ved at den nøytrale polymer er tresyl-sepharose.

5. Vannuoppløselig reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at bindingsliganden er utvalgt fra gruppen bestående av et monoklonalt antistoff, et polyklonalt antistoff, hormonreseptor, lectin, antigen og vitaminbindende protein.

6. Vannuoppløselig reagens ifølge krav 5, karakterisert ved at bindingsliganden er et monoklonalt antistoff spesifikt overfor stoffet som skal fjernes fra en fysiologisk væske.

7. Vannuoppløselig reagens ifølge krav 6, karakterisert ved at det monoklonale antistoff er spesifikt overfor lavtetthets-lipoprotein.

8. Vannuoppløselig reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at det biologiske forenelighetsmiddel omfatter et organisk molekyl med den negativt ladete del utvalgt fra gruppen bestående av OSO^ , RSO^ , RSO~, og C00~.

9. Vannuoppløselig reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at det biologiske forenelighetsmiddel omfatter et organisk molekyl hvor den nukleofile del. er utvalgt fra gruppen bestående av NH^ , SH og OH.

10. Vannuoppløselig reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at det biologiske forenelighetsmiddel er utvalgt fra gruppen bestående av sulfamidsyre, taurin, sulfanilsyre, glycin, aspartat, cystein, isetionsyre, hydroksybenzensulfonsyre, glukosesulfat, melke-syre, glukuronsyre, glukonsyre, 2-merkaptoetansulfonsyre, merkaptoeddiksyre, tiosalisylsyre, tiomelkesyre.

11. Vannuoppløselig reagens ifølge krav 10, karakterisert ved at det biologiske forenelighetsmiddel er sulfamidsyre.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av et vannuoppløse-lig reagens til fjerning av et stoff fra fysiologiske væsker, karakterisert ved at et bærersubstrat bringes i kontakt med, og reageres med, en vandig løsning av en bindingsligand spesifikk overfor stoffet, og et biologisk forenelighetsmiddel omfattende et organisk molekyl med en nukleofil del og en negativt ladet del adskilt ved hjelp av en avstandsarm.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at konsentrasjonen av bindingsliganden er fra tilnærmet 10 mg/ml til 100 mg/ml, og at konsentrasjonen av det biologiske forenelighetsmiddel er fra tilnærmet 0,01 M til 5,0 M.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved atpH kontrolleres ved hjelp av en ikke-nukleofil buffer med pH i området fra tilnærmet 4 til 10.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av et vannuoppløse-lig reagens til fjerning av et stoff fra fysiologiske væsker, karakterisert ved trinnene; (a) et bærersubstrat bringes i kontakt med og reageres med en vandig løsning av en bindingsligand spesifikk overfor stoffet, og (b) produktet fra trinn (a) bringes i kontakt med og reageres med en vandig løsning av et biologisk forenelighetsmiddel omfattende et organisk molekyl med en nukleofil del og en negativt ladet del adskilt ved hjelp av en avstandsarm, for å danne det vannuoppløselige reagens.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at konsentrasjonen av bindingsliganden er fra tilnærmet 10 mg/ml til 100 mg/ml, og at konsentrasjonen av det biologiske forenelighetsmiddel er fra tilnærmet 0,01 M til 5,0 M.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at pH kontrolleres ved hjelp av en ikke-nukleofil buffer med pH i området fra tilnærmet 4 til 10.

18. Fremgangsmåte til behandling av en fysiologisk væske for å fjerne et stoff, karakterisert ved at væsken bringes i kontakt med et vannuoppløselig reagens ifølge krav 1.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at den fysiologiske væske er pattedyrplasma.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at stoffet er lavtett-hetslipoproteiner.

21. Apparatur til fjerning av et spesifikt stoff fra fysiologiske væsker, karakterisert ved at den omfatter et middel til å fjerne friskt blod fra et pattedyr, et middel til å adskille plasma fra friskt blod, et middel til å be-handle plasmaet, innbefattende et kammer inneholdende et vannuoppløselig reagens ifølge krav 1, som vil reagere med og fjerne stoffet fra plasmaet, og et middel til å rekombi-nere plasmaet med resten av det friske blod og til å til-bakeføre det rekombinerte blod til pattedyret.

22. Apparatur ifølge krav 21, karakterisert ved at det vannuoppløselige reagens omfatter tresyl-sepharose inneholdende et monoklonalt antistoff mot lavtetthets-lipoprotein og sulfamidsyre, immobilisert på overflaten av tresyl-sepharosen.