DK163688B

DK163688B - Immunokemisk enzymbestemmelse af creatinkinase mb

Info

Publication number: DK163688B
Application number: DK067882A
Authority: DK
Inventors: Magdalena Usategui Gomez; Marvin Lee Miller; Richard Walter Wicks
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1981-02-17
Filing date: 1982-02-16
Publication date: 1992-03-23
Also published as: JPS57152900A; DE3205301C2; SE8200897L; CH646997A5; AU7974082A; NL8200587A; IT1157304B; GB2093182A; ES509631A0; DK163688C; CA1176561A; NO159619B; IT8219671A0; JPH0474669B2; NO159619C; SE453614B; FR2500009B1; AU554364B2; BE892152A; DE3205301A1

Description

i

DK 163688 B

Creatinkinase (CK) forekommer i animalske legemsvæsker og væv i form af tre kendte isoenzymer, der betegnes CK-BB, CK-MM og CK-MB. Hvert af disse tre isoenzymer, nemlig CK-BB, CK-MM og CK-MB, adskiller sig fra de andre ved en indbyrdes forskellig kombination af de underen-5 heder, der betegnes M eller B. CK-BB har to B-underenheder, CK-MM har to M-undereriheder, og CK-MB har én M- og én B-underenhed. Bestemmelsen af tilstedeværelsen af CK-MB i biologiske væsker, især i serum fra en patient, har vist sig at være særdeles værdifuld i diagnosen af hjerteinfarkt (Galen, RS., Human Path. 6. nr. 2, 145-147, april 10 1975).

Sædvanlige immunologiske metoder til bestemmelse af nærværelsen af CK-MB samt ulemperne ved disse metoder er for nylig blevet beskrevet i Current Problems in Cardiology, bind III, nr. 12, marts 1979, side 7-28. Disse metoder er ikke særlig tilfredsstillende til at løse 15 vanskelighederne ved forstyrrende CK-MM og CK-BB i adskillelsen og bestemmelsen af CK-MB i forhold til CK-MM og CK-BB.

En immunologisk fremgangsmåde til bestemmelse af CK-MB-aktivitet i en prøve af en biologisk væske er beskrevet i USA patentskrift nr.

4.067.775 og 4.237.044. Ifølge disse fremgangsmåder anvendes et 20 antistof, som fremstilles af et aktiveret CK-MM-antigen. Ved denne fremgangsmåde er det nødvendigt, at den væskeprøve, der skal undersøges, ikke indeholder CK-BB-isoenzym. Især nævnes det i USA patentskrift nr. 4,067.775, tredje spalte, linje 38-40, at CK-BB griber forstyrrende ind i fremgangsmåden ifølge opfindelsen og derfor ikke 25 må findes i den biologiske væske, der skal testes. Da biologiske væsker indeholder CK-BB, kan bestemmelsen ifølge disse patentskrifter gøre en tidskrævende og vanskelig fremgangsmåde nødvendig for først at fjerne alt CK-BB fra væsken. I tilfælde af, at CK-BB findes i den flydende prøve, giver anvendelsen af denne bestemmelsesmetode fejl-30 agtigt positive resultater. Det vil derfor sige, at denne fremgangsmåde til bestemmelse af CK-MB i væsker, der indeholder CK-BB, ikke kan anvendes.

Wreton og Pfleiderer, Clinica Chimica Acta 58, 223-232 (1975) beskriver et system til et immunoassay, hvorved CK-MM og CK-BB bestemmes 35 ved immuninhibering og immuntitrering. Disse bestemmelser kræver en

DK 163688 B

2 kvantificering af værdier, der fås ved sammenligning af den vundne restisoenzymaktivitet med den samlede isoenzymaktivitet i prøven. En immuninhiberingsbestemmelse til CK-isoenzymeme er en bestemmelse, ved hvilken CK-isoenzymemes enzymatiske aktiviteter inhiberes eller 5 inaktiveres forskelligt i testvæsken, nærmere bestemt ved immunologisk irihibering eller ved inaktiverende antistoffer, hvorved prøvens homogenitet bevares. Wreton-Pfleiderer-fremgangsmåden kræver flere bestemmelser (mindst fire) for at nå til de værdier, der kræves til bestemmelse af CK-isoenzymaktiviteteme. Dette betyder fire fejlkil-10 der og det samme antal af tidskrævende fremgangsmåder.

Ved en af Wursburg et al., i J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15, 131-137 (1977), beskreven fremgangsmåde anvendes til differentiering af CK-isoenzymer antistoffer, der udfældes efter et skema, hvilket gør målinger af fire forskellige bestemmelser nødvendige. Denne bestem-15 melse kræver måling af den samlede CK-aktivitet i testprøven og restaktiviteten efter tilsætning af udfældende anti-CK-BB- og udfældende anti-CK-MM-antistoffer, idet disse udfældende antistoffer tilsættes i forskellige reaktionsbeholdere. Ved denne fremgangsmåde garanteres prøvens homogenitet ud fra de udfældende antistoffer ikke.

20 Som ved Wreton-Pfleiderer-fremgangsmåden kræver denne fremgangsmåde arbejds- og tidskrævende gentagne bestemmelser med tilsvarende store fejlkilder.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde og et diagnostisk testkit til kvantitativ bestemmelse af CK-MB-isoenzymet, en form af 25 creatinkinase, der findes i en prøve af en biologisk væske sammen med flere isoenzymer, der indeholder M- eller B-underenhedeme eller begge.

Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse har det vist sig, at man hurtigt, økonomisk og præcist kan bestemme indholdet af CK-MB 30 endog i væsker, der indeholder CK-BB, når den biologiske væske bestemmes ved den nedenstående fremgangsmåde: a) Inkubering i en første reaktionsbeholder af den første af to prøver af en biologisk væske med et første antistof, der selektivt inhiberer de creatinkinase-isoenzymer immunologisk, som indeholder M-

DK 163688 B

3 underenheden, nærmere bestemt ved selektiv immuninhibering af M-underenheden i den første prøve til inhibering af den enzymatiske aktivitet udelukkende hos creatinkinase-isoenzymernes M-underenhed og derefter kvantitativt at måle aktiviteten af B-underenheden i den 5 første prøve, b) inkubering i en separat reaktionsbeholder af den anden portion af den biologiske væskeprøve med 1) et antistof, der selektivt binder de creatinkinase-isoenzymer immunologisk, der indeholder H-underenheden, og 2) et udfældende andet antistof, der selektivt og immunologisk 10 binder med det samme antistof, der binder de creatinkinase- isoen- zymer, der indeholder M-undereriheden og danner et reaktionsprodukt af dette andet antistof med det første antistof og de creatinkinase-isoenzymer, der indeholder M-underenheden, i form af et bundfald i den anden portion, og derefter kvantitativ maling af aktiviteten af 15 B-isoenzymerne i supematanten i den anden portion, og c) bestemmelse af CK-MB-aktiviteten i den biologiske væske ud fra de målinger, der fås fra den første og den anden portion.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kræver ikke et flertal af bestemmelser og beregninger, der fører til tvivlsomme og 20 mindre nøjagtige resultater.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er værdifuld i diagnosen af hjerteinfarkter.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af CK-MB i enhver biologisk væske. Ved fremgangsmåden 25 ifølge opfindelsen kan CK-MB bestemmes under anvendelse af to portioner af en enkelt prøve af en biologisk væske, hvilket giver to værdier for aktiviteten af B-underenheden i hver af disse portioner. Ud fra disse aktiviteter kan aktiviteten af CK-MB bestemmes.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det muligt at anvende bi-30 ologiske væsker såsom blod, plasma, serum, lymfevæske, galdevæske, urin, rygmarvsvæske, spyt, sved og lignende eller også ekskrementer fra mennesker eller dyr. Det er dog også muligt at anvende flydende præparater fra humane eller animalske væv såsom muskelvæv, hjertevæv, 4 .

DK 163688B

nyrevæv, lungevæv, hjernevæv, rygmarvsvæv, hudvæv og lignende. Den foretrukne biologiske væske til fremgangsmåden ifølge opfindelsen er imidlertid humant serum. I de fleste tilfælde behøver serummet til fremgangsmåden ifølge opfindelsen ikke at være fortyndet, men kan dog 5 til opnåelse af bedre resultater fortyndes, når mængden af CK er usædvanlig høj, hvilket er tilfældet med serum fra patienter, der lider af akut hjerteinfarkt.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen angår især bestemmelsen af den enzymatiske aktivitet af CK-MB-isoenzymet i en prøve af en biologisk 10 væske, som kan indeholde CK-MB, CK-MM og CK-BB. Fremgangsmåden kan udføres ved: a) Inkubering i en første reaktionsbeholder af den første af to prøver af en biologisk væske med et første antistof, der selektivt binder de creatinkinase-isoenzymer immunologisk, som indeholder M-15 underenheden, nærmere bestemt ved selektiv immuninhibering af M-underenheden i den første prøve til inhibering af den enzymatiske aktivitet udelukkende hos creatinkinase-isoenzymemes M-underenhed og derefter kvantitativt at måle aktiviteten af B-underehheden i den første prøve af den biologiske væske, 20 b) inkubering i en separat reaktionsbeholder af den anden portion af den biologiske væskeprøve med 1) et antistof, der selektivt binder med creatinkinase-isoenzymeme, hvilke enzymer indeholder M-under-enheden, og 2) med et udfældende andet antistof, der immunologisk binder med det samme antistof, der binder de creatinkinase-isoenzy-25 mer, der indeholder M-underenheden og danner et reaktionsprodukt af dette andet antistof med det første antistof og de creatinkinase-isoenzymer, der indeholder M-underenheden, i form af et bundfald i den anden portion, og derefter kvantitativ måling af aktiviteten af B-isoenzymet i supematanten i den anden portion, og c) bestemmelse 30 af CK-MB-aktiviteten i prøven af den biologiske væske ud fra de målinger, der fås fra den første og den anden portion.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes to immunologiske reaktioner, der udføres i forskellige reaktionsbeholdere. Fra hver af disse to reaktioner fås en måling af den enzymatiske aktivitet af

DK 163688 B

5 vasken i reaktionsbeholderen. Hver reaktion kan udføres samtidig, idet bestemmelserne dog også kan ske på forskellige tidspunkter. Det er imidlertid en fordel at udføre reaktionerne samtidigt. Det er ikke nødvendigt, at reaktionsbeholderne indeholder lige store portioner af 5 prøven, men der foretrækkes dog lige store portioner til en enkelt bestemmelse. Til bestemmelse og adskillelse af den enzymatiske aktivitet af CK-MB i den flydende prøve skal værdierne af den enzymatiske aktivitet fra begge separate reaktioner kun kvantificeres ved en inden for fagområdet kendt og accepteret metode. I tilfælde af at 10 reaktionsbeholdeme indeholder lige store portioner prøve, skal man kun trække den enzymatiske aktivitet, der fås i den anden reaktionsbeholder, fra den enzymatiske aktivitet, der fås i den første reaktionsbeholder. Dersom der ikke anvendes lige store portioner, skal man først på kendt måde korrigere forskellen i enzymkoncentra-15 tionen, før man trækker værdierne fra de to reaktionsbeholdere fra hinanden.

Den reaktionsbeholder, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan være en hvilken som helst kendt reaktionsbeholder, der egner sig til udførelse af immunologiske bestemmelser. Til de an-20 vendelige reaktionsbeholdere til udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen hører testrør af glas, plast eller metal. Den egnede reaktionsbeholder er et testrør af glas.

Opfindelsen angår også et diagnosekit til kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af CK-MB-isoenzymet af creatinkinase, hvilket isoen-25 zym findes i en biologisk væske sammen med flere isoenzymformer, der indeholder underenhederne Μ, B eller dem begge. Testkittet består af: a) en første beholder, der indeholder et antistof, der er i stand til selektivt at binde immunologisk med de creatinkinase-isoenzymer, der indeholder M-underenheden, nærmere bestemt ved selektiv immuninhi-30 bering af M-underenheden, b) en anden beholder, der indeholder et udfældende andet antistof, der er i stand til selektivt at reagere immunologisk med antistoffet i den første beholder, og c) et reagens af enzym-coenzym og substrat, der er i stand til at bestemme den enzymatiske aktivitet hos B-underenheden.

DK 163688 B

6 Når alle diagnosetestkittets komponenter anvendes i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er fagfolk i stand til at bestemme den enzymatiske aktivitet hos CK-MB i en prøve af en biologisk væske, der indeholder CK-MB, CK-MM og CK-BB. Testkittet egner 5 sig til klinikker, hospitaler, laboratorier og visse læger, som har behov for at bestemme og skelne CK-MB i væsker.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der som det første antistof anvendes et hvilket som helst antistof, der selektivt immuninhiberer M-underenheden af CK uden signifikant at immuninhibere B - under en-10 heden. Disse antistoffer kan fremstilles på kendt måde, idet man injicerer renset CK-MM-antigen i et dyr og udvinder det serum, der indeholder antistoffet, ved at udtage blod. Der kan anvendes enhver kendt metode til rensning af CK-MM-antigenet, og der kan anvendes en hvilken som helst kendt måde til injektion af dette antigen i dyr for 15 at få det tilsvarende antistof. Til de antistoffer, der kan anvendes ifølge opfindelsen, hører de i USA patentskrift nr. 4.237.044 anførte, der fremstilles i et dyr ud fra CK-MM-antigen, som før injektionen aktiveres med en aktivator såsom mercaptoethanol, men også sådanne, som fremstilles af et CK-MM-antigen, som ikke aktiveres før 20 injektionen såsom de antistoffer, der anvendes i Wreton og Pflei-derers ovennævnte immunirihiberingsbestemmelse. Selv om der ved tilsætningen af det første antistof ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan opstå udfældning, sedimenterer denne udfældning ikke, men forbliver homogen under hele fremgangsmåden.

25 Det første antistof kan fremstilles i en hvilken som helst dyreart. Dyrearterne omfatter især hvirveldyr såsom svin, kvæg, hunde, æsler, heste, geder, kaniner, rotter og lignende. Blandt disse dyr foretrækkes pattedyr såsom æsler, får og geder. Det mest foretrukne dyr er geden. 1 2 3 4 5 6

Ifølge et foretrukket aspekt af opfindelsen fremstilles det første 2 antistof ved immunisering af geder, en første dyreart, med et renset 3 CK-MM-antigen, hvorved fås gede-anti-CK-MM-antistoffer ved kendte 4 immunologiske teknikker. Til anvendelse i fremgangsmåden ifølge 5 opfindelsen må det første antistof være i stand til selektivt at 6 inhibere M-underenheden af CK, nærmere bestemt ved iTnrniininMBA-ring;,

DK 163688 B

7

Ved immuninhibering forstås, at det første antistof immunologisk inhiberer M-underenheden uden signifikant at inhibere B-underenheden, og at denne inhibering af M-underenheden i prøveportionen følger, medens prøvens homogenitet bevares.

5 Det første antistof inkuberes med den første og den anden portion, fortrinsvis lige store portioner af testprøven, i reaktionsbeholderen og blandes fortrinsvis.

Som resultat binder det første antistof immunologisk til hvert CK-MB og CK-MM i hver portion af prøven og giver immuninhibering af CK-MB 10 og CK-MM, uden at skade B-underenheden signifikant. Det må bemærkes, at det væsentlige punkt ved det første antistof til den anden portion udelukkende består i at binde CK-MB og CK-MM immunologisk uden signifikant at binde CK-BB. Det er ikke væsentligt eller nødvendigt, at det første antistof bevirker immuninhibering i den anden portion af 15 prøven. Heraf følger, at det første antistof i den anden portion af prøven kan erstattes med et forskelligt antistof, der produceres i et andet dyr end det, der anvendes til fremstilling af det første antistof, under anvendelse af renset CK-MM-antigen. Således kan der som første antistof i den anden portion af prøven anvendes et hvilket som 20 helst antistof, der selektivt binder creatirikinasen, der indeholder M-underenheden, uden væsentligt at inhibere B-vinderenheden.

Inkubations temperaturen og -tiden for hver portion af testprøven efter tilsætningen af antistoffet er ikke kritisk og kan udføres ved en hvilken som helst temperatur og i løbet af et hvilket som helst 25 tidsrum, der er sædvanligt for og egnet til enzymimmunfremgangsmåder. Inkubationerne udføres fortrinsvis ved stuetemperatur og i løbet af 5-60 minutter.

Ifølge den foreliggende opfindelse udføres målingen for enzymatisk aktivitet i den første portion efter inkubationen af denne første 30 prøve med det første antistof, medens prøvens homogenitet bevares.

Ved denne målemetode kan B-underenheden af CK-MB og CK-BB bestemmes.

Mængden af det første antistof i den anden portion af prøven må være tilstrækkelig til at binde praktisk taget alle CK-MB og CK-MM-isoen-

DK 163688 B

8 zymer i denne portion. For at få de bedste resultater sættes det første antistof til hver portion af prøven i en mængde, der er overskydende i forhold til den mængde, der normalt er nødvendig for at binde alle CK-MB og CK-MM. Bestemmelsen af mængden af det første 5 antistof, som er nødvendigt til hver prøve, kan udføres på kendt måde.

Den anden portion af testprøven i den anden reaktionsbeholder tilsættes efter tilsætningen af et første antistof, nemlig enten det første eller et erstatningsantistof, et udfældende andet antistof.

10 Tilsætningstiden for dette andet antistof efter tilsætningen af det første antistof er ikke kritisk, idet der dog foretrækkes ca. 5 minutter. Længere tidsintervaller kan om ønsket anvendes. Ifølge den foreliggende opfindelse kan der som det andet udfældende antistof anvendes et hvilket som helst antistof, der selektivt binder til det 15 første antistof og udfælder dette, og som praktisk taget er fri for immunologisk aktivitet mod B-undereriheden af creatinkinase.

Det andet antistof kan på kendt måde fremstilles i en dyreart, der er forskellig fra den dyreart, i hvilken det første antistof dannes.

Typisk fremstilles det andet antistof ved kendte immunologiske tek-20 nikker ved immunisering af æsler med gede-7-globulin (IgG) og udvinding af æsel-anti-ged-IgG. Det andet antistof, der fås på denne måde, er i stand til at binde til hvert gede-IgG, altså også gede-anti-CK-MM, det foretrukne første antistof. Det andet antistof bindes fortrinsvis til en fast bærer. Den faste bærer, der indeholder det 25 andet antistof, inkuberes. med den anden portion af testprøven i den anden reaktionsbeholder, fortrinsvis efter blanding i ca. 5 minutter ved stuetemperatur. Som resultat binder det andet antistof nu immunologisk til det første antistof i den anden portion af prøven. Dette giver et immunbundfald, der indeholder det CK-MB- første/andet anti-30 stof, det CK-MM- første/andet antistof og det første/andet antistof.

Mængden af det andet antistof svarer til den mængde, der er tilstrækkelig til at binde alle de første antistoffer. Ifølge et særlig foretrukket aspekt af den foreliggende opfindelse tilføres det andet antistof sædvanligvis i en mængde, der ligger over den mængde, der er 35 nødvendig til at binde alle de første antistoffer.

DK 163688 B

9

Ifølge den foreliggende opfindelse adskilles bundfaldet, der er opstået som følge af tilsætning af det andet antistof, fra den anden portion af prøven på kendt måde. Den vundne supernatant måles for enzymatisk aktivitet. Ifølge den foreliggende opfindelse er det 5 supematanten, der måles for enzymatisk aktivitet.

Til de sædvanlige metoder til adskillelse af bundfaldet fra denne anden portion hører sædvanlige filtrerings- og chromatografimetoder.

Den mest foretrukne metode til adskillelse af bundfaldet fra denne anden portion er centrifugering efterfulgt af dekantering af super-10 natanten og måling af den dekanterede væske.

Supematanten af denne anden portion måles derefter på kendt måde for at bestemme aktiviteten af CK-BB-isoenzymet i denne supernatant.

Målingen eller bestemmelsen af aktiviteten af CK-MB og/eller CK-BB i hver reaktionsportion af testprøven kan udføres på i og for sig kendt 15 måde. Disse metoder omfatter kolorimetriske metoder, fx sådanne metoder til enzymatisk analyse, der er beskrevet i H.U. Bergmeyer, 3. udgave, 1974, bind 1, side 145 ff. Den fluorimetriske bestemmelse af CK-BB er ligeledes omfattet. Creatin frigøres fra creatinphosphat ved CK, og dette creatin kan måles fluorimetrisk ved omsætning med nin-20 hydrin i en stærk alkalisk opløsning (R.B. Conn, Clin. Chem., bind 6, side 537 ff., 1960).

Til dette formål foretrækkes kinetiske metoder, ved hvilke den enzymatiske aktivitet bestemmes ved ultraviolet måling, fx ved bølgelængder på 334, 340 eller 366 nm. Der foretrækkes en standardmetode, 25 hvorved CK bestemmes under anvendelse af creatinphosphat og adeno-sinphosphat (Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., bind 8, side 658 ff.

(1970), og bind 10, side 182 (1972)). Testredskaber til bestemmelse af CK-aktiviteten ved denne metode findes i handelen.

Ved den foretrukne metode måles den enzymatiske aktivitet af CK-MB 30 og/eller CK-BB efter tilsætning af egnede enzymer, coenzymer og substrater, hvorved CK-BB katalyserer den reversible overgang af en phosphatgruppe fra creatinphosphat til adenosindiphosphat, og hvorved mængden af det resulterende adenosintriphosphat måles under anvendel-

DK 163688 B

10 se af koblede og med hexokinase og glucose-6-phosphatdehydrogenater katalyserede reaktioner. Det sidstnævnte enzyms aktivitet i reduktionen af nico tinamid- adenin-dinucleo tid følges spektrof o tometrisk ved måling af absorptionsforøgelse ved 340 nm, idet hastigheden af æn-5 dringen i absorptionsforøgelsen er direkte proportional med aktiviteten af CK-MB og/eller CK-BB i hver given portion af testprøven.

Isoenzymet CK-MM, der anvendes som antigen til fremstilling af det første antistof, kan fås fra en hvilken som helst egnet biologisk væske såsom blod og serum eller fra biologiske organer eller væv 10 såsom hjertemuskulatur, skeletmuskulatur, knoglemarv eller et hvilket som helst egnet organvæv, hvorom det er kendt, at det indeholder dette isoenzym. Den foretrukne kilde til dette isoenzym er animalsk skeletmuskulatur.

Rensningen af det ovennævnte isoenzym til en meget høj grad af ren-15 hed, før det anvendes til fremstilling af antistof, anbefales kraftigt for at mindske tilstedeværelsen af ikke-specifikke antistoffer. Isoenzymet kan renses ved enhver sædvanlig rensningsmetode. De foretrukne rensningsmetoder er ligeledes kendte, nemlig alkoholfraktionering og anioribytterchromatografi.

20 Isoenzymets renhedsgrad samt 'det fremstillede antistofs specificitet kan bestemmes på sædvanlig måde såsom ved immundiffusion eller ved elektroforetiske teknikker. Den foretrukne metode til bestemmelse af isoenzymets renhed er acrylamidgelelektroforese.

Det andet antistof kan gøres uopløseligt ved anbringelse i et uop-25 løseligt bærestof. Egnede faste bærestoffer omfatter vanduopløselige organiske polymerer såsom cellulose eller andre polysaccharider, en vinyladditions-eller kondensationspolymer eller et vanduopløseligt uorganisk stof med polymerkarakter såsom glas eller siliconegummi. På den anden side kan det andet antistof adsorberes til overfladen af 30 en fast bærer såsom polystyren, polypropylen, polyfluorethylen eller polyvinylidenfluorid. Metoden, hvorved det andet antistof hæftes til den faste bærer, er ikke kritisk og kan omfatte 1) covalent kobling af det opløselige andet antistof til en uopløselig polymer, fx ved omsætning med et middel, der forårsager uopløselighed, 2) fysisk

DK 163688 B

11 indpakning af det andet antistofs partikler i porerne på en gelpolymer, fx en tværbundet polyacrylamid, eller 3) fysisk adsorption til et uopløseligt polymert stof. Hvis der anvendes en fast bærer, er den foretrukne måde at fæstne det andet antistof ved adsorption til 5 aktiveret polyvinylidenfluorid (Kynar), idet der anvendes metoder, som er kendt af fagfolk, fx den i USA patentskrift nr. 3.843.443 beskrevne metode.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.

EKSEMPEL 1 10 CK-MM-Rensning I. Homogenat

Ca. 1000 g human skeletmuskulatur eller hjertevæv tøs op ved 4°C.

Overskydende fedt skilles fra vævet, som derefter skæres i små stykker (1 cm). Vævsstykkerne homogeniseres derefter i en blandemaskine 15 med 1000-1500 ml koldt (4eC) 0,05M (hydroxymethyl) aminomethan (trispuffer), der indeholder 1 mM mercaptoethanol, med pH-værdi 7,4. Det vundne homogenat centrifugeres derefter ved 50.000 x g i 20 minutter ved 4eC og giver bundfald i form af en lille kugle. Den vundne overstående væske filtreres gennem en sintret glastragt og holdes tilba-20 ge. Den lille kugle hældes igen i blandemaskinen og homogeniseres på ny med 500-700 ml tris-puffer, centrifugeres ved 50.000 x g, hvorved supematanten efter filtrering forenes med den første supernatant. De samlede supematanter anvendes i trin II.

II. Ethanoludfældning 25 Koldt (4°C) absolut ethanol sættes til de i trin I vundne samlede supematanter til en slutkoncentration på 50% (v/v), hvorefter der omrøres i 30 minutter ved 4eC. Den vundne blanding centrifugeres derefter i 15 minutter ved 4eC og 7000 x g. Den vundne supernatant holdes tilbage, og den udfældede kugle kastes bort. Koldt (4eC) 30 absolut ethanol sættes langsomt til supematanten, indtil ethanolkon-

DK 163688 B

12 centrationen er 70%. Den vundne blanding omrøres i 30 minutter ved 4°C, og centrifugeres på ny i 15 minutter ved 7000 x g og 4°G. Den vundne kugle gensuspenderes i 500-700 ml 0,05 M tris-puffer med pH-værdi på 7,4, der indeholder 1 mM mercaptoethanol og 0,05 M natrium-5 chlorid.

III. Ionbytterchromatografi ("batch"-metode)

Diethylaminoethyldextran-anioribytterharpiks (DEAE Sephadex® A-50) ækvilibreret med 0,05 M tris-puffer med en pH-værdi på 7,4, der indeholder 0,05 M NaCl og ImM mercaptoethanol, sættes til den i trin 10 II vundne gensuspenderede kugle, hvorefter der omrøres i 30 minutter ved 4eC. Suspensionen filtreres gennem Whatman nr. 1 filtrerpapir og vaskes med portioner på 0,05 M tris-puffer, pH-værdi 7,4, der indeholder 1 mM mercaptoethanol, indtil filtratet kun udviser ubetydelig CK-aktivitet. Filtratet koncentreres derefter ved 4°C under tryk til 15 300-500 ml under anvendelse af en PM-10-filtermembran.

IV. Anden ethanoludfældning

Koldt absolut ethanol sættes langsomt til det i trin III vundne koncentrerede filtrat til en koncentration på 50%. Den vundne blanding omrøres i 30 minutter ved 4°C og centrifugeres derefter ved 7000 20 x g, hvorved der dannes en lille kugle. Supematanten holdes tilbage, og kuglen kastes bort. Koldt absolut ethanol sættes langsomt til supematanten til en koncentration på 70%. Den vundne blanding centrifugeres igen i 15 minutter ved 7000 x g, hvorefter den vundne kugle opløses i et minimalvolumen på 0,05 M tris-puffer med en pH-25 værdi på 7,4 (fx 50-75 ml). Den vundne blanding dialyseres mod 2000 ml 0,05 M tris- puffer, pH-værdi 7,4, ved 4eC, idet pufferen skiftes to gange. Et let bundfald, der har dannet sig i blandingen ved dialysen, fjernes efter centrifugering og kastes bort. Supematanten anvendes i trin V nedenfor.

30 V. Ionbytterchromatografi (søjle) DEAE Sephadex® A-50 ækvilibreres med 0,05 M tris-puffer, pH-værdi 4,7, og en 2,6 x 60 cm's søjle forberedes og vaskes på overfladen med

DK 163688 B

13 denne puffer. Den i trin IV vundne supernatant hældes på denne søjle og elueres ved 4°C og med en strømningshastighed på 30 ml i timen.

Der samles fraktioner på 10 ml. Fraktionerne analyseres for CK-aktivitet og proteinindhold. De samlede fraktioner, der indeholder stør-5 steparten af CK-MM-isoenzymet, dialyseres mod 0,05 M tris-puffer, pH-værdi 7,4, der indeholder 10 mM ethylendiamin-tetraeddikesyre (EDTA).

De dialyserede fraktioner koncentreres ved 4eC under tryk og under anvendelse af en PH-10-filtermembran til et egnet koncentrat (fx 8-40 mg protein/ml) og lagres ved 4eC i 0,05 M tris- puffer, pH-værdi 7,5, 10 der indeholder 10 mH EDTA. Et let bundfald, der danner sig ved henstanden, fjernes ved centrifugering. Renheden af CK-MH i det lagrede materiale er typisk 90-100%, bestemt ved polyacrylamidgelelektrofore-se. Der anvendes elektroforese på agarosegel for at vise, at der ikke findes MB- og BB-isoenzym i det lagrede materiale. Det på denne måde 15 vundne produkt er den endegyldigt rensede prøve af CK-MM.

EKSEMPEL 2

Gede-anti-CK-MM-serum

Til fremstilling af immunogenet til immunisering af gederne fortyndes det i eksempel 1 vundne rensede CK-MM med 0,02 M tris-puffer, pH-20 værdi 7,5, til 4 mg/ml og med et lige volumen af Freund's komplette adjuvans (en mineraloliesuspension, der indeholder dræbte M-tuberku-losebaciller). Den vundne blanding emulgeres til en vand/olie-emulsion. Geder injiceres én gang om ugen med en injektion af 1 ml af dette immunogen subcutant i skulderregionen på to steder, idet der 25 hvert sted anvendes 0,5 ml immunogen. Der udtages blod fra geden hveranden uge for at få gede-anti-CK-MM-serumet.

EKSEMPEL 3

Aktivering af polyvinylidenfluorid

For at koble globulinfraktionen fra æsel-anti-ged-IgG-serum til poly-

DK 163688 B

14 vinylidenfluorid (PVF) aktiveres PVF forinden ved nedenstående fremgangsmåde .

1. 15 liter tris-azid-puffer opløses ved opløsning af 36,3 g tris (hydroxymethyl)aminomethan (Trizma-base) og 15 g natriumazid i ca.

5 14.000 ml af ioniseret vand ved stuetemperatur, idet pH-værdien ind stilles til 7,5 ± 0,1 med 5N saltsyre. 5N saltsyren fås ved fortynding af 50 ml 38% 's saltsyre med 70 ml af ioniseret vand. Den vundne opløsnings rumfang indstilles til 15.000 ml med af ioniseret vand og lagres ved stuetemperatur.

10 2. 100 g polyvinylidenfluoridpulver blandes i en egnet beholder med 600 ml 2-propanol. Den vundne suspension homogeniseres i 30 sekunder i en homogenisator ved en hastighed, der er tilstrækkelig til at fremstille en fin dispersion, hvorved fås en blanding, der overføres til en egnet 4 liters cylinder. Blandingen lades henstå i 10 minutter 15 ved stuetemperatur. Der sættes 3400 ml saltvand, som fås ved opløsning af 28,9 g natriumchlorid i 3400 ml afioniseret vand, til blandingen. Efter tilsætning af saltvandet blandes den vundne blanding godt, hvorefter den lades danne bundfald i 1 time eller så længe, at polyvinylidenfluoridet har af lej ret sig til ca. 1/5 af det samlede 20 rumfang. Supematanten fjernes ved opsugning, og rumfanget forøges igen til 4000 ml med afioniseret vand. Efter bundfældelse af polyvinylidenfluoridet opsuges supernatanten på ny. Derefter bringes rumfanget på ny op til 4000 ml, og polyvinylidenfluoridet vaskes yderligere tre gange på denne måde med afioniseret vand. Dernæst vaskes 25 polyvinylidenfluoridet endnu to gange på denne måde med den i trin 1 vundne tris-azid-puffer. Efter den sidste vask bringes rumfanget af polyvinylidenfluoridet op til 2000 ml, hvorefter stispensionen lagres ved stuetemperatur, indtil den anvendes til kobling af æsel-anti-ged-IgG-serumet.

DK 163688 B

15 EKSEMPEL 4

Fremstilling af globulinfraktionen fra æsel-anti-ged-IgG-serum

Globulinfraktionen af æsel-anti-ged-IgG-serum til kobling til det aktiverede PVF ifølge eksempel 3 fremstilles tinder anvendelse af de 5 følgende materialer og fremgangsmåder.

Punkt Materiale Mængde a) kommercielt æsel-anti-ged-IgG-serum 100 ml b) mættet ammoniumsulfatopløsning, der 10 fås ved tilsætning af 500 g fast am moniumsulfat (granulat) til 500 ml afioniseret vand og kraftig omrøring i 1 time ved stuetemperatur, lagring ved 4°C og aflejring af krystallerne 110 ml 15 c) 0,02 M tris-azid-puffer, pH-værdi 7,5 ca. 6 liter d) mættet bariumchloridopløsning frem stillet ved tilsætning af 50 g bari-umchlorid-2H20 (granulat) til 100 ml afioniseret vand og omrøring i 1 time 20 ved stuetemperatur, idet de dannede krystaller lades bundfælde sig. Lagring ved stuetemperatur ca. 1 ml

Fremgangsmåde 1. 100 ml æsel-anti-ged-IgG-serum (punkt a) hældes ved 4eC i en egnet 25 beholder med magnetomrører. Derefter tilsættes under svag omrøring 60 ml mættet ammoniumsulfat (punkt b) for at bringe beholderens indhold op til en mætning på 37,5%. Der omrøres i 1 time ved 4eC, hvorefter de udfældede antistoffer samles som en kugle ved centrifugering i 30 minutter ved 4°C og 12.000 x g. Kuglen opløses i ca. 70 ml tris-azid-30 puffer (punkt c), hvorefter rumfanget bringes op på det oprindelige

DK 163688B

16 rumfang af 100 ml med den samme puffer. Derefter tilsættes under let omrøring ved 4eC 50 ml mættet ammoniumsulfatopløsning (punkt b) for at bringe den vundne blanding op på en mætning på 33%. Blandingen omrøres i 1 time ved 4eC. Det udfældede antistof fås efter 30 minut-5 ters centrifugering ved 12.000 x g og 4eC i form af en kugle. Kuglen opløses i ca. 40 ml tris-azid-puffer (punkt c) og overføres til en dialyseslange. Der dialyseres mod tris-azid-puffer ved 4eC. Pufferen skiftes tre gange (2 liter pr. hold) efter hver gang mindst 4 timers dialyse. Tilstedeværelsen af sulfationer fastslås ved tilsætning af 1 10 ml dialysat til 1 ml mættet bariumchloridopløsning, idet et hvidt bundfald efter omrøring viser tilstedeværelsen af sulfat. Hvis der iagttages et bundfald, skiftes dialysatet med frisk puffer, og der dialyseres så længe, at sulfattesten er negativ. Dialysatets rumfang bringes op til 100 ml med 100 ml tris-azid-puffer og centrifugeres i 15 10 minutter ved 2000 x g og 4°C, hvorefter supematanten indsamles.

Supematanten, der indeholder det fremstillede æsel-anti- ged-IgG, lades henstå ved 4°C, indtil den kobles til det i eksempel 3 vundne aktiverede polyvinylidenfluorid.

EKSEMPEL 5 20 Kobling af globulinfraktiinen af æsel-anti-ged-IgG til aktiveret polyvinylidenfluorid

Koblingen af globulinfraktionen af æsel-anti-ged-IgG-serumet, der er fremstillet i henhold til den i eksempel 4 beskrevne fremgangsmåde, til en suspension af akviteret PVF, der er fremstillet i henhold til 25 den i eksempel 3 beskrevne fremgangsmåde, udføres under anvendelse af de nedenstående reagenser og fremgangsmåder.

Punkt Reagens Mængde a) aktiveret polyvinylidenfluorid 30 (eksempel 3) 2000 ml b) globulinfraktion af æsel-anti- ged(IgG)-serum (eksempel 4) 100 ml c) tris (hydroxymethyl) aminomethan

DK 163688 B

17 (Trizma-base) 24,2 g d) dinatriumsalt af ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA) 147,4 g e) ION natriumhydroxid i vand ca. 20 ml 5 Fremgangsmåde 1. 10 liter Tris-EDTA-puffer fremstilles på følgende måde: 24,2 g Trizma-base (punkt c), 10,0 g natriumazid og 147,4 g EDTA (punkt d) opløses ved stuetemperatur i ca. 9000 ml afioniseret vand. For at opnå en fuldstændig opløsning kan det være nødvendigt at omrøre i 10 30-60 minutter. Opløsningens pH-værdi indstilles til 7,5 ± 0,1 med 10N NaOH, og opløsningen bringes op på et rumfang på 10.000 ml med af ioniseret vand. Opløsningen lagres ved stuetemperatur.

2. 2000 ml af en suspension, der indeholder aktiveret polyvinyliden-fluorid (punkt a), hældes i en egnet beholder og omrøres let. 100 ml 15 æsel-anti-ged-serum (punkt b) sættes til suspensionen, hvorefter der omrøres i 6 timer ved stuetemperatur og natten over (12-18 timer) ved 4°C. Der fås æsel-anti-ged-IgG-antistof bundet til polyvinyliden-fluorid.

3. Det til polyvinylidenfluorid koblede antistof ifølge trin 2 samles 20 ved centrifugering ved 1500 x g i 10 minutter som en kugle. Supema- tanten hældes bort, og kuglen gensuspenderes i et samlet rumfang på 2000 ml tris-EDTA-puffer (fremstillet som beskrevet i trin 1).

4. Trin 3 gentages i alt tre gange.

5. Kuglen eller kuglerne, der fås i trin 4, gensuspenderes i tris-25 EDTA-puf fer (trin 1) til et rumfang på 500 ml, hvorefter der i denne suspension opløses 2,5 g bovint serumalbumin under let omrøring i 30 minutter. Denne suspension homogeniseres i 30 sekunder i en homo-genisator ved en hastighed, der giver en fin dispersion, og som produkt giver uopløseligt anti-ged-IgG.

DK 163688 B

18 6. Det uopløselige anti-ged-IgG-produkt lagres ved 4°C i den følgende slutkoncentration: 20% (w/v) polyvinylidenfluorid 0,02 g M tris-puffer, pH-værdi 7,5 5 0,1% (w/v) natriumazid

0,5% (w/v) BSA

39,6 mM EDTA

EKSEMPEL 6

En bestemmelse af CK-MB-aktivitet i en biologisk væske udføres ved 10 nedenstående fremgangsmåder, hvilket nødvendiggør to testrør.

1. Til testrør 1 sættes 200 pi patientserum og 250 pi gede-anti-CK-MM-serum (fremstillet som i eksempel 2), idet blandingen omrøres let, hvorefter den lades henstå i 20 minutter ved stuetemperatur, hvorved fås den blanding, der anvendes i trin 3.

15 2. Til testrør 2 sættes 200 pi patientserum og 50 pi gede-anti-CK- MM-serum (fremstillet som beskrevet i eksempel 2), idet der omrøres let, hvorefter blandingen lades henstå i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter tilsættes 200 pi lagret uopløseligt anti-ged-IgG (fremstillet som beskrevet i eksempel 5), idet der blandes let, og reakti-20 onsblandingen lades henstå i 5 minutter ved stuetemperatur. Røret centrifugeres derefter i 5 minutter ved 1000 x g, og den vundne supernatant anvendes i trin 3.

3. 100 pi af den resulterende blanding fra trin 1 og 200 pi af super-natanten fra trin 2 sættes til den første og anden portion af 1,0 ml 25 enzymatisk CK-reagens (eksempel 7) til måling af CK-enzymaktiviteten. Derefter blandes hver portion grundigt og inkuberes derpå i 5 minutter ved 37°C. Absorptionen optegnes for hver portion ved 340 nm i en samlet tid på 5 minutter i periodiske intervaller i et spektrofotometer ved 37eC under anvendelse af en kuvette med en lagtykkelse på 1 30 cm. De optegnede absorptioner omregnes til absorptionsskift pr.

minut, og der fås de internationale enheder CK-aktivitet pr. liter

Claims

10 D-glucose 20 mM ADP 1,2 mM AMP 8 mM NAD (gær) 2,3 mM MgCl2 15 mM 15 Hexokinase (gær) 2500 IE/liter ved 30®C i Glucose-6-phosphatdehydroge- nase (Leuconostoc) 2500 IE/liter ved 30®C Dithioerythritol 60 mM Reagenserne formuleres· i piperazin-N,N-bis (2-ethansulfonsyre)puffer, 20 pH-værdi 5,8 ± 0,15 (30®C).

1. Fremggangsmåde til kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af creatihkinase-MB-isoenzymformen af creatinkinase, der findes i biologiske væsker som flere isoenzymformer, der indeholder underenhedeme 25 M eller B eller dem begge, kendetegnet ved, at a. en første af to portioner af en prøve af en biologisk væske inkuberes i en første reaktionsbeholder med et første antistof, der selektivt binder immunologisk med creatinkinase-isoenzyme me, der DK 163688B indeholder M-underenheden, nærmere bestemt ved selektiv immuninhibe-ring af M-underenheden i den første portion af prøven af den biologiske væske, og at aktiviteten af B-isoenzymet i den første portion af prøven af den biologiske væske derefter måles kvantitativt, 5 b. den anden portion af prøven af den biologiske væske i en separat reaktionsbeholder 1. inkuberes med et antistof, der selektivt og immunologisk binder creatinkinase-isoenzymeme, der inderholder M-undereriheden, i den anden portion af prøven af den bi- 10 ologiske væske, 2. tilsættes et udfældende andet antistof, der selektivt og immunologisk binder til det antistof, der binder creatinkinase-isoenzymeme, der indeholder M-underenheden, for at få et reaktionsprodukt i form af et bundfald i denne 15 anden portion, hvilket består af det andet antistof og det første antistof og creatinkinase-isoenzymeme, hvilket indeholder M-underenheden, og at aktiviteten af B-isoenzymet i supernatanten i denne anden portion måles kvantitativt, og 20 c. CK-MB-aktiviteten i denne prøve bestemmes ud fra målingsresultaterne fra den første og den anden portion.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøven af den biologiske væske er blodserum. 1

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det første antistof fra trin a og antistoffet fra trin b, der binder creatinkinase-isoenzymeme, som indeholder M-underenhedeme, er gede-anti-creatinkinase-MM, og at det andet antistof fra trin b er æsel-anti-ged-IgG. DK 163688 B

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det andet udfsldende antistof er bundet til en fast bærer.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, 5 kendetegnet ved, at den faste bærer er polyvinylidenfluo-rid.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den enzymatiske aktivitet af B-isoen-zymet fastslås ved en fotometrisk bestemmelse.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den spektrofo tometriske bestemmelse omfatter en enzym-coenzym- og substratblanding.

8. Diagnosetestkit til kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af creatinkinase-MB -isoenzymformen af creatinkinase, der i biologiske 15 væsker findes i flere isoenzymformer, der indeholder underenhedeme M eller B eller dem begge, kendetegnet ved, at testkittet omfatter følgende: i a) en første beholder, der indeholder et antistof, som er i stand til selektivt og immunologisk at binde med creatinkinase-isoenzymeme, 20 der indeholder underenheden M, nærmere betegnet ved selektiv immunin-hibering af M-underenheden, b) en anden beholder, der indeholder et udfældende andet antistof, som er i stand til selektivt og immunologisk at reagere med det antistof, der findes i den første beholder, og 25 c) et reagens af enzym-coenzym og substrat, der er i stand til at bestemme den enzymatiske aktivitet af B-underenheden.

9. Testkit ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det udfældende andet antistof er bundet til en fast bærer. DK 163688 B

10. Testkit ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den faste bærer er polyvinylidenflu-orid.