NO822067L - Immunokjemisk bestemmelse av den sure prostatafosfatase - Google Patents

Description

i<1>

, I D• e sure fosfataser er en hetrogen q" ruope av mang' e isoenzi<y>mer,

i hvorunder hvert er spesifikt for en vevstype. Som følge av i denne vevssuesifiteten er bestemmelsen av et vevsspesifikt i isoenzym i serumet en verdifull hjelp.i identifiseringen

■ av abnormiteter i dette vev. I flere vitenskapelige pu^-

: likasjoner er påvist at nivået av isoenzymets sure prostata-

j fosfatase (Prostatic Acid Phosphat-ase; PAP) i serum stiger

I

1 som følge- av nærværet til et prostatakarcinom (R.M. Towsend,

■ Ann. Clin. and Lab. Sei,"bind 7, nr. 3, s 254-261, mai-I

, juni 1977)... i i 'i Målingen eller bestemmelsen av PAP-isoenzymspeil i serumet j

er imidlertid komplisert p.g.a. at andre isoenzymer av sur j

' fosEatase fra vev som ikke stammer fra prostata er til stede.

Faktisk foreligger normalt betydelige nivåer av isoenzymer j

' 1 i i syrefosfataser som ikke stammer fra prostata til stede i serum. [Li, C. et al., J. Lab. Clin. Med. 82, 446-460 j I

(1973)]. Med henblikk på de mange kilder for dannelsen<!>av I

økede nivåer av isoenzymer av sur fosfatase er det nødvendig å bestemme.isoenzymets PAP som er spesifikk for dette isoenzymet.

Tidligere forsøk på å bestemme mengden av PAP i serum ble<!->basert på substratspesifitet og kjemisk inhibering. Disse ! ■forsøk ga ikke særlig gode resultater, da til og med det spesifike substrat eller den spesifike inhibitor reagerer med andre isoenzymer enn PAP. Disse forsøk ifølge teknikkens stand forårsaket gale positive.eller negative for-<!>søksresultater med medfølgende stor mulighet for en feil-aktig terapi..

Det ble også beskrevet forskjellige immunokjemiske be-stemmelsesmetoder for PAP. Choe,B.K., et al har i ProC

Soc. Exper. Biol. and Med. 162, 396-400 (1979) beskrevet

en metode for bestemmelse av den enzymatiske aktiviteten

12 5

og radioaktiviteten til.et J-markert PAP antigen/antistoff kompleks utfylt med ammoniumsulfat. Etter denne metoden bestemmes PAP ved måling av antigen/antistoffkomplekset som. er utfylt med ammoniumsulfat. Ifølge denne metoden får man'

1

imidlertid en sterk forstyrrelse gjennom syrefosfataser jsom. skyldes den ikke-spesifike karakteren til ammoniumsulfat- I

felling.. i | -

For å løse problemet med forstyrrelsen som skyldes andre j isoenzymer i bestemmelser for individuelle, organspesifike I isoenzymer av human alkalisk fosfatase ble en dobbelanti- j si tJof. fBeinolzy.-mC-h-.eimmm. u 2n 4o 3, lo1.g6i0 sk (19m6e8t) oodg e abv eCshkore evet et ala.v , CSluinss. mCahn eme. t 26å, i l.,j1'

i 1854-1859 (1980). I begge disse arbeider beskrives at det spesifike j

antistoff for det ønskede isoenzym bringes til reaksjon med. forsøks-prøven hvoretter antistoff/isoenzymkomplekset i et påfølgende- trinn bringes til reaksjon med et andre løselig antistoff (anti-u-blobulrn). Etter sentrifugeringen undersøkes fellingen med hensyn til rest-iso-enzymaktivitet.. | i

For at Sussman- og Choemetoden forløper nøyaktig, er det i nødvendig at det andre løselige antistoffet reagerer pålslik måte med antistoff/enzymkomplekset at isoenzymet som skal bestemmes felles fullstendig. Denne reaksjonen er avhengig' av faktorer som temperatur, pH, ionestyrke, tid, protein-konsentrasjon o.l. Da disse faktorer er vanskelige å kon- ; trollere i en bestemmelsesmetode, har Sussman og Choes metoder en begrenset brukbarhet ved nøyaktig bestemmelse<:>av mengden av et spesifikt isoenzym.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en immunokjemisk fremgangsmåte ved bestemmelse■av mengden PAP-isoenzym i en mengde av en biologisk væske. Økede mengder'av PAP-isoenzym i serum viser en prostatasvulst.

Den immunologiske fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er en dobbelantistoffimmunenzym-metode ved hvilken ett av antistoffene er et uløseliggjort antistoff, som dannes ved reaksjon av dette antistoff med ainylose. Fremgangsmåten omfatter inkubasjon av forsøksprøven med et første antistoff som bindes selektivt immunologisk til isoenzymet i prøven

, og et uløseliggjort andre antistoff som bindes selektivt immunologisk til det første antistoffet.. De . resu lterende

i immunokjemiske reaksjoner gir uløselige immunkomplekser 'som

i er enkle å isolere. Etter isoleringen av immunkompleksene '

måles i disse de f orelig.gende isoenzymaktiviteter. j 1'"■.■■'!.■!

Det ble funnet at<p>roteiner så som immunglobuliner (IgG)i, i

il enzymer og lingende kan kobles til amylose, en fast bærer.' og gir uløseliggjorte proteiner så som IgG-amylose, som>kanj anvendes som immunabsorbantier. Det ble funnet at et protein så som f .eks. IgG som ble gjort uløselig ved reaksjon med amylose viser fordeler overfor<p>roteiner som ble uløseliggjort med andre faste bærere. Spesielt ligger for-'delen i at IgG-amylose kan fremstilles ved en meget enkel \ reaksjon. Amylose har et stort overflateområde. for bindingen av IgG; og det erholdte.reaksjonsprodukt, d.v.s. IgG-amylosen kan ganske enkelt sentrifugerés ved høye hastigheter, men ! blir likevel ved utførelsen av en immunokjemisk bestemmelse: i tilstrekkelig lenge i suspensjonen.

Fremgangsmåten ifølge foreliggene oppfinnelse har vesentlige fordeler overfor fremgangsmåten' ifølge teknikkens stand, idet fremgangsmåten ifølge op<p>finnelsen er meget spesifikk,, rask, ytterst nøyaktig og reproduserbar og muliggjør en i spesifikk isolering av PAP-isoenzymet fra sera, hvilke inneholder ikke-prostatiske isoenzymer, og sålede muliggjør spesifikk måling av mengden av det isolerte PAP-isoenzym.

Spesielt er■fremgangsmåten ifølge foreliggende op<p>finnelse fordelaktig fordi de resulterende immunkomplekser raskt kan felles ut fra reaksjonsblandingen og bli tilgjengelig for måling av isoenzymaktiviteten. Videre er reaksjonsblandingen som danner immunkomplekset uavhengig av faktorer så som temperatur, pH, ionestyrke, tid, proteinkonsentras.jon - o.l. Da disse faktorer mangler, utelukkes de ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse som mulige feilkilder, hvilket betyr at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør en mer nøyaktig bestemmelse av mengden til det s<p>esifike isoenzym. ' i ' Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er det mulig å som forsøksprøve anvende en prøve av en biologisk ,væske så som.f.eks. fullstendig blod, plasma, serum, lymfe-I væske, gallevæske, urin, spinalvæske, spytt, svette o.l.<!>, samt også avføringsprøver fra mennesker eller dyr. Det er : også mulig å anvende flytende preparater fra menneskelige. eller animalsk vev så som skjelettmuskel, hjerte, nyre,, lunge, hjerne,.beinmarg, hud o.l., men biologiske væskerj. er foretrukne. Den foretrukne biologiske væske som for-J isøksprøve ifølge foreliggende oppfinnelse er humant serum. ■ - • * . i Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt en fremgangsmåte ; ved bestemmelse av mengden PAP-isoenz<y>mer i en prøve av en biologisk væske, hvilke kan inneholde andre, ikke-prostatiske isoenzymer eller andre proteinaktige substanser. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse utføres ved isolering j<:>av det spesifike PAP-isoenzymet som er av interesse, og Ved i måling av den enzymatiske aktiviteten til det isolerte PAP- : isoenzymet. ■ Isoleringen av PAP-isoenzymet utføres ved anvendelse av to forskjellige antistoffer, et første og et andre antistoff, som reagerer i en reaksjonsblanding med prøven av den.biologiske væske, og påfølgende adskillelse av PAP-isoenzymet ;som inneholder immunkompleksene fra denne reaksjonsblandingen. Ifølge foreliggende o<p>pfinnelse kan det første antistoff';være ethvert antistoff som er løselig i reaksjonsblandingen og som. selektivt binder til PAP-isoenzymet.uten i betydelig qrad å inhibere den enzymatiske aktiviteten til PAP-isoenzymet. Det første antistoffet kan fremstilles på vanlig måte ved injeksjon av et renset PAP-isoenzym som antigen i. et.dyr og etterfølgende bloduttak for å utvinne sera som inneholder antistoffet. For å fremstille og rense PAP-isoenzymet samt injisere det rensede PAP-isoenzym som antigen i dyr for utvinning av anti-PAP.serum som inneholder, det første .antistoff kan enhver vanlig teknikk anvendes. Anti-PAP serumet behøver ikke renses og kan anvendes direkte i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Anti-PAP serumet, som ' man får ved anvendesle av renset PAP-isoenzym, reagerer !ikke ;med sure fosfataser fra andre vev enn prostata og inhiberer ikke signifikant den enzymatiske aktiviteten til PAP-iso<L>i ;.enzymet hvortil det bindes immunologisk. Det betyr altså at det første antistoff, som foreligger i dette anti-PApj serum bindes spesifikt og bare til PAP-isoenzymet fra for-søksprøven og samtidig ikke påvirker den enzymatiske aktivitete i ;! t! il PAP-enzymet...' ;PAP-isoenzymet ■ som anvendes som antigen for å frembringe! deti'første antistoff, kan utvinnes fra enhver egnet biologisk i væske så som prostatavæske, blod, serum eller fra ethvert I biologisk egnet friskt prostatavev. Den foretrukne kilde til dette isoenzym er animalske prostatavæsker eller vev./. sp' e■ si' elt foretrukket er human pros■ tatavæske eller vev. | i ;For å redusere nærværet av ikke-spesifike antistoffer an-befales det å rense PAP-isoenzymet inntil en høy renhetsgrad før det anvendes for fremstilling av det første antistoff.. PAP-isoenzymet kan renses ved enhver vanlig teknikk som er kjent for slik formål. Den foretrukne rensing omfatter klassiske, kjente metoder så som affinitetskromatografi , eller elektroforese i ;Renhetsgraden av PAP-isoenzymet som anvendes for å danne det første antistoff, samt spesifiteten til det erholdte antistoff kan bestemmes ved vanlige metoder så som immundiffusjon eller elétroforeseteknikker. Den foretrukne metode for be-, stemmelsen av renheten av PAP-isoenzymet er acrylamingel-elektrof<p>rese. ;Det første antistoff kan utvinnes fra enhver dyreart som er. kjent for dette formål. Dyreartene er spesielt virveldyr så som svin, storfe, hund, esel, hest, geit, kanin, rotte o.l. Blandt disse dyrene foretrekkes pattedyr så som esel, ■ sau og geit spesielt. Særlig foretrukket er geiter. ;I et foretrukket aspekt av foreliggende oppfinnelse frem-■ stilles det første antistoff ved immunisering av geiter, ;en første dyreart, med renset PAP-isoenzym ved vanlige ;immunologiske teknikker og utvinning av geiteanti-PAP. Det rensede PAP-isoenzvm erholdes fra humant nrostatavev. i ;• . - il;: j Det første antistoff anvendes i en mengde som er tilstrekkelig ; til å binde<p>røvens PAP-isoenzym. For å oppnå gode resultater reduseres antistoffet i prøven til en mengde som ligger 'overj;:den grense som normalt er tilstrekkelig for å binde PAP- •ij isoenzymet. Bestemmelsen av mengden til det nødvendige første antistoff for hver- prøve kan skje ved vanlige metoder,. ;Etter tilsetning av det første antistoff behandles forsøks- : orøven med et uløseliggjort andre antistoff. Tiden for' ; ' ' tilsetningen av det uløseliggjorte andre antistoff etter-tilsetningen av det første antistoff, er ikke kritisk, men J det foretrekkes å vente med tilsetningen av det uløselig-, ajorte andre antistoff i minst 15 minutter etter tilsetning ; av dét første antistoffet. J ;Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et uløselig- ; gjort, andre antistoff ved kobling av det andre antistoff gjennom en aminbro til amylose. Det andre antistoff av dette uløseliggjorte andre antistoff kan være ethvert antistoff som selektivt bindes til det første antistoff uten å inhibere den enzymatiske aktiviteten til det isoenzym som er bundet på dette første antistoff. Det andre antistoff av dette uløseliggjorte andre antistoff kan fremstilles ved enhver vanlig teknikk i en dyreart som er forskjellig fra den i hvilken det første antistoff ble fremstilt. Det andre antistoff fremstilles ved immunisering av et dyr som er forskjellig fra det hvori det første antistoff ble fremstilt med gamma-globulin fra blodet av vertsarten som ble anvéndt for frem-stillina av det første antistoff. På denne måten blir det andre antistoff immunoreaktivt for det første antistoffet og danner et kompleks med dette. ;Amylosen som anvendes for dannelse av det uløseliggjorte andre antistoff kan være en homo<p>olymer av D-glukose. D-gluko-<p>vranose-enhetene i amylosen har hovedsakelig (1-4) a-glyko-<.....>t ! sidisk binding. Amylosens molekylvekt varierer avhengig av;amylosekilden og går over et område fra en gjennomsnittlig molekvlvekt'på ca. 100 000 til ca. 1 100 000. ;i• følge fi- -emgangslffA•■ ten for foreliggende oppfinnelse kan de! t i' for dannelse av reaksjonsproduktet av antistoffet og amylosen anvendes en amylose fra enhver kilde og med enhver molekylvekt. Om ønsket kan amvlosen renses nå Vanliq måte før 1 ! ;: " ' " i , reaksjonen med antistoffet. Renhetsgraden er derimot ikke i kritisk, men det foretrekkes at amylosen har en renhet mellom ' 50 og 100 %...•!:• ;Fremgangsmåten for binding av det andre antistoff eller et andre protein gjennom en aminbro til amylosen for å danne .det. uløseliggjorte andre antistoff kan være enhver vanlig teknikk for kobling .av po ly sakkar ider til proteinet. ;Etter et foretrukket aspekt av foreliggende op<p>finnelse;kobles det andre antistoff eller et andre protein under an- : vendélse av en konvensjonellschlffbasereaksjon kovalent til aktivert amylose (Guthrie, R.D. Adv. Carbohydrate Chem. 16:101, 196.1) . ;Ifølge den foretrukne metode aktiveres amylose som inneholder flere D-glukopyranose-enheter ved hjelp av et oksydasjons-middel så som natriumperiodat (HaCTO^) som oksyderer a-1,4-bundene glukoseenheter og gir amylosedialdehyd. Det erholdte amylosedialdehyd reagerer så med den primære aminogruppe av det.tilsatte andre antistoff eller protein og danner en schiffbase eller et aldimin. Den schiffske base behandles med et reduk jonsmiddel og gir en primær aminobro mellom proteinet og amylosen. Blandt de vanlige reduksjonsmidler som er egnet for dette formål anvendes normalt et reduksjons-middel så som natriumborhydr id (NaBH ).. Fremgangsmåten for fremstilling av det andre antistoff/amyloseprodukt illustreres i det følgende reaksjonsskjeraa. I dette skjema betyr n flere D-glukopyranose-enheter. ;i ; ; For å danne det uløseliggjorte ■ antistoff bringes antistoffet på forannevnte måte til omsetning med amylose for å. koble antistoffet gjennom en aminbro til amylosen. Ved fremstilling-. av det uløseligg jorte antistoff' er mengden av amylose i antistoffet ikke kritisk. Det anvendes imidlertid normalt ;i ca. 1 - 200 vektdeler amylose pr. vektdel antistoff. Man ! foretrekker å anvende ca. 8-20 vektdeler amylose pr. vektdel antistoff. i ' ;i i ;i ! ;i Ifølge foreliggende oppfinnelse adskilles immunkompleksene som dannes ved tilsetning av det andre antistoff ved vanlige teknikker fra prøveløsningen eller blandingen, og i den j erholdte felling måles den enzymatiske virkning av PAP. , Ifølge foreliggende o<p>pfinnelse måles den enzymatiske aktivitet altså i fellingen. ;Til vanlige metoder for adskillelse av fellingen fra prøve-løsningen hører filtrering og kromatografiske metoder. Den mest foretrukne metode for adskillelse av fellingen fra<p>røveløsningen er sentrifugering med etterfølgende dekantering av su<p>ernantant med måling av fellingene. Dette muliggjør måling av mengden PAP i prøven. ;Målingen eller bestemmelsen av aktiviteten av PAP-isoenzymet som ble isolert fra forsøksprøven, kan skje ved enhver vanlig metode. Disse metoder omfatter kolorimetriske metoder, så ;som f . eks. beskrevet i "Methoden der enzymatischen Analyse" utgitt av H.U. Bergmeyer, 3. utgave 1974, bind. 1, s 145 ;og også fluorimetriske metoder.;Oppfinnelsen vedrører også et diagnostisk forsøkssettsystem for kvantitativ bestemmelse av nærvær av PAP-isoenzymet i en biologisk væske. Forsøkssettsystemets bestanddeler er: ;(a) en første beholder som inneholder et antistoff som er;i stand til å selektivt bindes til PAP-isoenzymet,;(b) en andre beholder som inneholder et andre antistoff hvilket gjennom kobling til amylosen gjennom en amin-binding uløseliggjøres og som er i stand til selektivt immunologisk å reagere med det første antistoff i den ;første beholder og (c) et substatreagens med hvilket den enzymatiske aktiviteten ;i til PAP-isoenzymet kan måles. i i i Når alle komponentene til det diagnostiske forsøkssettsystem ifølge foreliggene oppfinnelse anvendes, er fagmannen i.stand til å bestemme den enzymatiske aktiviteten til PAP-enzymet i i en fri prøve av en biologisk væske som inneholder ikke-1 nrostatiske isoenzymer."Forsøkssettet er egnet for klinikker, : hospitaler, laboratorier og den enkelte lege, som må bestemme mengden av PAP-isoenzym i en prøve av en biologisk væske. ;i De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen videre, men skal ikke begrense oppfinnelsens omfang og idé. ;<!>;EKSEMPEL 1<1>;Rensing av. PAP ;Del_A ;i ;~ ' i ,100 g frossent humant prostatavev bringes ved 4 C i en 1 i'homogeniseringsløsning som inneholder 0,05 M etylendiamin- i tetraeddiksyre (ÉDTA) og 0,01 % (vekt) tween 80. Man lar ] det frosne vevet tine i homogeniseringsløsningen i omtrent 1 en halv time. Etter tiningen homogeniseres vevet i en mikser inntil det ikke foreligger flere klumper i den resulterende1 løsning. Under homogeniseringen som ikke utføres lengre' enn 20 sekunder befinner blandingen seg i et isbad. Det ;resulterende homogeniserte materiale røres deretter"natten over ved 4°C. Materiale sentrifugeres så i en time ved 1 ' 4°C og 16.300 Xg. Den erholdte supernantant på omtrent 240 ml dialyseres tre ganger mot 4 liter 0,005 M natriumfosfatpuffer med pH 6,3 som inneholder 0,9 % natriumklorid. Ved dialyse økes det opprinnelige volum fra omtrent 240 ml til omtrent 260 ml. ;Det erholdte dialyserte material bringes så i en 1000 ml lyofiliseringsflaske som er egnet for lyofilisering ved hurtigfrysing over tørris og aceton og lyofiliseres så natten over. Det erholdte lyofiliserte materiale rekonstitueres deretter med 20,0 ml 0,005 M natriumfosfatpuffer med pH 6,3 som inneholder 0,9 % natriumklorid, hvorunder man får det rekonstituerte materiale som anvendes for den etterfølgende del B. ;Del_B;En LKB-kolonne pakkes med 100 ml av en forut svellet con-A sefarose 4B-gel i den forannevnte puffer, hvoretter gelen får sette seg uten gjennomløp i kolonnen. Den erholdte pakkede kolonne, vaskes så med 400 ml av den ovenfor nevnte , ;i puffer. ■•'■■'.!;Det rekonstituerte materialet fra overnevnte del A/bringes^;så på den således preparerte LKB-kolonne. Derpå lar mari materialet sette seg på kolonnen i tre timer.. Så sender. man 800 ml av den forannevnte puffer gjennom kolonnen med j en gjennomløpshastighet pa 4 0 ml pr., time. Deretter løper 500 ml av en 0,0 - 0,3 M mannose-gradient, som ble erholdt > separat i 0,005 M natriumfosfatpuffer med pH 6,3 med 0,9 % natriumklorid og filtrering gjennom aktivkull, med en gjennom-løpshastighet på 40 ml pr. time gjennom kolonnen, idet ! fraksjoner på 10 ml samles (totalt 50 fraksjoner). Derpå j ledes 500 ml 1,0 M mannose gjennom kolonnen og det samles på samme måte totalt 50 fraksjoner. ' Alle fraksjoner prøves med protein og PAP-aktivitét. Fraksjoner som inneholder en PAP-aktivitet med en spesifikk aktivitet 2000 Sigma enheter/ml protein slås sammen, dialyseres mot 0,05 M natriumfosfatpuffer med pH 6,3 med 0,9 % natriumklorid og konsen- 1 treres under anvendelse av et amiconfiltersystem til et !4,0 ;ml konsentrert dialysat for den etterfølgende del C.;Del_C;Man fremstiller en 7,5 %-ig acrylamidgel under anvendelse;av et Buchlersystem. Den etterfølgende puffer ble likeledes fremstilt for Blichlersystemet: 0 ,03 5 M 3-alanin i 0,014 M eddiksyre for den øvre puffer av systemet og 0,14 M 3-alanin i 0,056 M eddiksyre for det nedre og elusjonspuffer av systemet. ;For fremstilling av en blanding ble 1 ml 40 %-ig sukrose;og 3 dråper metylgrønnfarge satt til de 4 ml av det kon-sentrerte dialysat fra del B. Blandingen settes så på den 7,5 %-ige acrylamidgel av Blichlersystemet og elektroforesen startes (1000 volt, 200 milliamper i ca. 16 timer). Blandinger elueres under anvendelse av den nedre/elueringspuffer, idet 10 ml fraksjoner samles. De erholdte fraksjoner undersøkes med hensyn til PAP og proteinaktivitet. Fraksjoner som inneholder PAP-aktivitet slås sammen og dialyseres natten over to ganger mot 0,01 M sitratpuffer med pH 6,0, hvorunder man oppnår meget rent PAP for immuniseringsmetoden ifølge ;j etterfølgende eksempel 2. Det meget rene PAP kan lagres ved -2 0°C. ;! i EKSEMPEL 2 } ! j i- ;Immunisering av geiter med renset PAP for fremstilling av det første antistoff I ;i ■ ' ■ ;; For fremstilling av immunogenet for immunisering av geitene j ;. blandes det ifølge eksempel 1 fremstilte meget rene PAP ,;, i 0,01 M sitratpuffer med pH 6,0 med et likt volum fra Freund's komplette adjuvans (en mineraloljesuspensjon som. inneholder drepte M-tuberkulosebasiller) hvorunder man får en blanding som inneholder 0,5 mg PAP pr. ml. For dannelse i av vann/oljeemulsjonen som utgjør immunogenet, homogeniseres den erholdte blanding. Geiter immuniseres i tre på hverandre følgende uker med en subkutan injeksjon av 2 ml immunogen på to steder i skulderområdet idet hvert sted får en ml av immunogenet. De andre injeksjoner med ufullstendig Freund's adjuvans gis i to ukers intervaller etter den første injek-sjonen hvorpå man utfører ytterligere annen injeksjoner med ufullstendig Freund's adjuvans i flere måneder. Geitene tappes for blod en til to uker etter immuniseringen for å oppnå antiserum. ;EKSEMPEL 3;Fremstilling av globulinfraksjonen fra esel- anti- geit IgG- serum ;Globulinfraksjonen fra esel-anti-geit IgG-serum som trenges for kobling på amylosen fremstilles under anvendelse av følgende bestanddeler og fremgangsmåter: ; 500 ml esel-anti-geit IgG-serum bringes i en egnet beholder med magnesiumrører. For å mette beholderinnholdet til 37,5 % tilsettes under svak røring 300 ml mettet ammoniumsulfat-løsning (punkt b). Etter en times røring ved 4°C samles de utfelte antistoffer ved sentrifugering ved 1200 Xg i 3 0 minutter ved. 4°C som en klump. Klumpen oppløses i ca'. 350 ml f o.sf atpuf f er (punkt c ) , hvorpå man med samme puffer igjen fremstiller originalvolumet på 500 ml. For å bringe .. blandingen til en 33 %-ig raettning, tilsettes under lett røring ved 4°C 250- ml metted ammoniumsulfatløsning. (punkt b) . Blandingen røres i en time ved 4°C. Det utfelte antistoff anholdes etter 90 minutter eentrifugej?in%ved 1208 Hg eg 4°C som klump- Klumpen oppløses i ca. 200 ml-av fosfat^pufferen, bringes så i en dialysesiange og dialyseres mot fos fatpufferen ved 4°C. Pufferen skiftes etter et minimum ;i på 4 timers dialyse tre ganger (4 liter pr. skifte). Det erholdte dialysat dialyseres på nytt og da mot 4 liter ;1 karbonatbikarbonatpuffer (punkt d). Protelnkonsentrasjonen i dette dialysatet bestemmes etter Lowry-metoden, og man j ; fortynner til 12 mg/ml i. et sluttvolum på 800 ml, h \orunder j man får globulinfraksjonen fra esel-anti-geit IgG-serum,| som er egnet .for kobling til den aktiverte amylose ifølge ;■ . i eksempel 4. ;<!>;EKSEMPEL 4;i i Aktivering av amvlose ' ' : * i

For å koble globulinfraksjonen fra esel-anti-geit IgG-serum ifølge eksempel 3 til amylose, aktiveres amylosen ifølge de følgende trinn 1-16 først:

' i

1. Man tilsetter langsomt 20 g amylose til 4 1-liters ' i sentrifugebeholdere som inneholder 500 ml ionefritt vann. Under og etter tilsetningen røres med' en magnetrører. Beholderen fylles til fult volum med ionefritt vann. 2. I løpet av en times røring ved romtemperatur lar man amylosen svelle i hver beholder. 3. Den svellede amylose sentrifugeres i hver enkelt beholder i 5 minutter ved 2500 Xg. 4. Supernantanten i hver beholder helles av og klumpen oppbevares for trinn 5. 5. I hver beholder resuspenderes klumpene i en liter ionefritt vann.

6; Trinnene 3, 4 6q -5 gjentas to ganger, hvilket totalt

gir 4 vaskeoperasjoner.

7 ■. Klumpen resuspenderes i vann og får stå natten over i vann ved romtemperatur. Neste dag sentrifugeres beholderene, hvoretter klumpene kan oppbevares for det senere trinn 9 etter avdekantering. 8. Flan o<p>pløser 2 5, 68 g natriummetaperiodat i 700 ml ione-i

■ " j I fritt vann og fyller til et volum på 800 ml.

i

9. Klumpen ifølge trinn 7 resuspenderes i hver av fire ; i beholdere med 200 ml 0.,15 M natriummetaperiodat ifølge trinn 8. i : • ; r il 10. Den resuspenderte klumpen ifølge trinn 9 røres i to -timer ved romtemperatur forsiktig. 11..49,66 g etylenglykol (flytende) blandes med 300 ml ionefritt vann. Med ionefritt vann fyller man opp til et volum på 400 ml, og før tilsetningen av etylenglykol skjer ingen sentrifugering.

i

i 12. På slutten av 2-timers røringen ifølge trinn 10 bringes i hver av de fire beholdere 100 ml 2 M etylenglykol-løsning ifølge trinn 11, hvoretter man rører forsiktig i 30 minutter ved romtemperatur. 13. Beholderene sentrifugeres i 5 minutter ved'2500 Xg.

Etter dekaiiteringen holdes klumpene separat tilbake fra hverandre. 14. Klum<p>ene ifølge trinn 13 resuspenderes separat i opp til 1 liter (måleinnhold) karbonatbikarbonatpuffer (punkt d fra eksempel 3), hvoretter man rører i 15 - 30 minutter.

15. Trinnene 13 og 14 gjentas to ganger.

16. Ved dekantering får man klumper som inneholder aktivert amylose; hvilke er klare for kobllnqen til globulinfraksjonen fra esel-anti-geit igO-serum fremstilt ifølge

EKSEMPEL 5

i Kobling av globuiinfraksjon fra esel- anti- geit IgG- serum i -

■ ' i til aktivert amylose Koblingen av globulinfraksjonen fra esel-anti-geit'IgG-serumet (fremstilt ifølge fremgangsmåten i eksempel 3) til aktivert• o i • amylose (fremstilt ifølge fremgangsmåten ifølge eksempel 4)! utføres under anvendelse- av de følgende bestanddeler og j j fremgangsmåter. |

Fremgangsmåte

1. Til hver av 4 beholder som inneholder en klump av aktivert amylose (20 g tørrvekt, svellet som angitt i eksempel 4 til 100 ml) settes 200 ml esel-anti-geit IgG (fremstilt ifølge eksempel 3; 12 mg/ml) for.kobling til amylosen på IgG. 2. Koblingen skjer ved romtemperatur i 36 - 48 timer under røring. 3. Beholderen sentrifugeres så i 5 minutter ved 2500 Xg. 4. Proteinet i supernantanten av hver beholder prøves- på O.D. ved 280 . 5. Til 800 ml f osf atpuf f eret kokesaltløsning settes 0,8 g..• natriumborhydrid. i ii

' I

i 6. Til hver av de fire sentrifugerte beholdere fra trinn 31

<1>som inneholder amyloseprotein settes 200 ml natrium-

i borhydridløsniitg. De resulterende suspensjoner røres forsiktiq en time ved romtemperatur..

i i 7. • Etter røringen av suspensjonen ifølge trinn 6 sentrifugeres den resulterende reduserte amylose-proteingel

i hver beholder som i trinn 3, hvoretter supernantanten;

kastes.

'i 8. Gelen i hver beholder resuspenderes med fosfatpufret kokesaltløsning pg fylles'så opp til 1 liter med fosfat-puf f er. Den resuspenderte gel røres i 10 - .20 minutter;

ved romtemperatur.

9.. Etter røringen sentrifugeres gelen som i trinn 3 . Supernantanten kastes, og trinnene'3 og 9 gjentas to ganger. 10. De fire resulterende amyl<p>se-<p>roteinklumper resuspenderes i 200 ml PBS og bringes så ved vasking i en 2-liters beholder, hvorunder man får en amylose-proteinsuspensjon. 11. 4,8 g storfeserumalbumin og 1,6 g natriumacid bringes under røring til 100 ml PBS. Denne løsningen tilsettes amylose-proteinsuspensjonen. 12. Amylose-proteinsuspensjonen bringes så i en 5 %-ig vandig suspensjon hvilket oppnås ved tilsetning av PBS til et sluttvolum på 1600 ml.

Bestemmelsen av PAP-aktiviteten i en prøve av en biologisk væske utføres som følger: i

• 1 1

Del_A

! i 200 ul forsøksserumprøve eller kontroll plasseres i et prøve-rør, og for reagenstomvekten settes 200 ul destillert vann i til et annet prøverør. 20 ul av det ifølge eksempel 2 erholdte geite-anti-PAP serum settes til hvert rør.. ■ Etter at det siste røret er blandet med anti-PAP serum, blandes og inkuberes de erholdte blandinger i 15 minutter ved romtemperatur. Deretter tilsettes hvert rør 200 ul av en godt rørt amylose-protein-\ suspensjon ifølge eksempel 5-, Etter, at det siste røret sorri| skal undersøkes er blandet med amyiose-proteinsuspensjonen blandes, rørene og inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur. Deretter tilsettes hvert rør 3,0 ml av en 0,9 %-ig salt-løsning (9,0 g natriumklorid pr. 1000 ml destillert vann), \ hvoretter man blander. Hvert'rør sentrifugeres så i 10 minutter ved 1500 Xg, hvorpå supernantanten fjernes ved i

■dekantering.- Man får således rør som inneholder en fastfase-klump for anvendelse i del B. i Del_B

Den kolometriske PAP-substratløsning fremstilles ved re-■ konstituering av et rør Worthington natriumtymolftalinmono-fosfat med 41,0 ml destillert vann. Flasken rystes forsiktig for å løse substratet fullstendig. Denne substrat-■ o løsningen.kan lagres opp til 60 dager ved 2 - 8 C eller 2 dager ved 18 - 26°C. Substratløsningen ekviliberes så

ved romtemperatur..Rørene som inneholder fastfaseklumpen fra del A stilles i et 37°C vannbad og ekvilibreres 5 minutter, Heretter tilsettes 0,5 ml koiorimetrisk PAP-substratløsning til hvert rør som inneholder denne klumpen. Hvert rør blandes så og inkuberes 30 minutte ved "37 °c (etter tilsetning av substratløsningen til første prøverør). Ved slutten av 30-minutters perioden tilsettes hvert rør 1,5 ml-alkali Worthington-løsning, hvoretter man blander og så sentrifugerer i 10 minutter ved 1500 Xg.. Absorbsjonen av den resulterende supernantant i hvert rør avleses ved 590 nm i et spektrofotometer..

Del_C

Den kolorlmetriske PAP-substratløsninq. som anvendes I del Bj..f, F\ £ 7 man aom følger: I

For å bestemme konsentrasjonen av PAP i prøvene oppstilles under anvendelse av konvensjonelle Worthington tyomolftalin-fortynninger en standardkurve. Etter substraksjonen av absorbsjonen til reagensverdien fra absorbsjonen av serum-prøvene og kontrollene anvender man de korrigerte"absorb-sjoner for å avlese konsentrasjonene av PAP fra standard-kurven.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte ved bestemmelse av Isoenzymets sure prostatafosfatase i en prøve fra en biologisk væske,; karakterisert ved at man i ' i i •; a) inkuberer prøven med • j (i) et løselig-første ant• istoff, som selektivt I i; bindes immunologisk til isoenzymet i prøven uten å inhibere den enzymatiske aktiviteten til dette isoenzymet, og (ii) et uløseliggjort antistoff dannet ved kobling av dette andre antistoff til amylose, idet det andre antistoff selektivt bindes immuno logisk til det første antistoff uten å inhibere den enzymatiske aktiviteten til isoenzymet, for dannelse av en felling av en blanding av immunkomplekset, hvilke inneholder isoenzym-første antistoff-andre antistoff og første antistoff-andre antistoff, og at man b.) isolerer fellingene som inneholder immunkompleksene og c) måler isoenzymaktiviteten i fellingen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert .ved at prøven av biologisk væske er blodserum.

3. Fremgangsmåte ifølge,krav 1 eller 2, karakterisert ved at.det første antistoff er geité-anti-syre prostatafosfatase og det andre antistoff esel- anti-qeite IgG;

'4. ' Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-3, .karak terisert ved at isoenzymaktiviteten bestemmes ved spektrofotometrisk .måling. <!>

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at den spektrofotometriske måling anvender <1> ! kolorlmetriske rea <g> enser. ! ' <!> i

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man som koiorimetriske reagenser anvendert ymolftalinminofosfat eller et basisk addisjonssalt : derav. '

7. Diagnostisk forsøksséttstvstem for bestemmelse av mengden ' i ■ av isoenzymets sure prostatafosfotase i en prøve av ^ en biologisk væske, karakterisert ved ; ■ at forsøkssettsystemet inneholder de følgende bestanddeler: i a) en første beholder som inneholder et antistoff; hvilket er i stand til selektivt å bindes immunologisk til isoenzymet, b) en andre beholder som inneholder et uløseliggjort antistoff dannet ved kobling av dette andre antistoff til amylose idet det andre antistoff er i stand til selektivt immunologisk å reagere med antistoffet i den første beholder og c.) et reagens hvormed den enzymatiske aktiviteten til isoenzymet.kan bestemmes.

8. En sammensetning bestående av et protein som gjennom en amiobro er koblet til amylose.

9.. Sammensetning ifølge krav 8, karakterisert ved at proteinet er immunglobulin..

10-. Fremgangsmåte ved fremstilling av en sammensetning ifølge ki?av & eller 9, k a i? a i? i; a i? i s e r t v e d at man kobler proteinet gjennom en aminotarb,ti1 amylosen.