NO159619B - Immunokjemisk enzymbestemmelse. - Google Patents

Description

Kreatinkinase (CK) forekommer i animalske kroppsvæsker og

vev i form av tre kjente isoenzymer som kalles CK-BB,

CK-MM og CK-MB. Hvert av disse tre isoenzymer, nemlig

CK-BB, CK-MM og CK-MB adskiller seg fra hverandre ved en forskjellig kombinasjon av underenheter som kalles M eller B. CK-BB har to B-enheter, CK-MM har to M-enheter og CK-MB

har en M- og en B-underenhet. Bestemmelsen av tilstedeværel-sen av CK-MB i biologiske væsker, spesielt i serum hos en pasient, har vist seg som meget verdifull ved diagnose av hjerteinfarkt (Galen, RS., Human Path. 6. No. 2, 145-147, April 1975).

Vanlige immunologiske metoder for bestemmelse av forekomst

av CK-MB samt ulempene ved disse metoder ble beskrevet for kort tid siden (Current Problems in Cardiology, bind III,

nr. 12, mars 1979, s. 7-28). Disse metoder var ikke særlig tilfredsstillende med hensyn til å løse vanskeligheten med forstyrrende CK-MM og CK-BB i adskillelsen og bestemmelsen av CK-MB overfor CK-MM og CK-BB.

En immunologisk fremgangsmåte for bestemmelse av CK-MB-aktiviteten i en prøve av en biologisk væske er beskrevet i US patenter nr. 4,067,775 og 4,237,044.Ifølge fremgangsmåten

i disse patenter anvendes et antistoff som ble fremstilt gjennom et aktivert CK-MM-antigen. Ved denne fremgangsmåten er det nødvendig at væskeprøven som skal undersøkes ikke inneholder noe CK-BB-isoenzym. Spesielt nevnes i US patent nr. 4,067,775 i kolonne 3, linjene 38-40 at CK-BB forstyrrer fremgangsmåten ved den deri beskrevne oppfinnelse og derfor ikke bør forekomme i den biologiske væske som skal undersøkes.

Da biologiske væsker inneholder CK-BB, kunne bestemmelsen ifølge dette patent nødvendiggjøre tidkrevende og vanskelige metoder for først å fjerne alt CK-BB fra væsken. For det tilfelle at CK-BB er tilstede i den flytende prøve, ville anvendelse av denne bestemmelsesmetoden resultere i feilaktige positive resultater. Dette betyr altså at denne fremgangsmåten ikke kan anvendes for bestemmelse av CK-MB i væsker som inneholder CK-BB.

Wreton og Pfleiderer, Clinica Chimica Acta 58, 223-232

(1975) beskriver et system for en immunologisk måling, ved hvilken CK-MM og CK-BB bestemmes gjennom immunoinhibering og immunotitrering. Disse bestemmelser krever kvantifiser-inger av verdier som erholdtes gjennom sammenligning av den oppnådde restisoenzymaktivitet med totalisoenzymaktiviteten til prøven. En immuninhiberingsbestemmelse for CK-isoenzymene er en sådan ved hvilken de enzymatiske aktivitet-ene til CK-isoenzymene i forsøksvæsken inhiberes eller inak-tiveres forskjellig, og dette skyldes immunologisk inhibering eller inaktiverende antistoffer ved hvilke prøvens homogenitet opprettholdes. Wreton og Pfleiderer-metoden krever flere bestemmelser (minst fire) for å komme til de verdier som er nødvendige for bestemmelse av CK-isoenzym-aktiviteten. Dette betyr fire feilkilder og et likt antall tidkrevende metoder.

Ved en metode som er beskrevet av Wursburg et al. i J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15, 131-137 (1977) anvendes fellende antistoffer for differensiering av CK-enzymer ifølge et skjema som nødvendiggjør målinger av fire forskjellige bestemmelser. Denne bestemmelsen krever måling av den totale CK-aktivitet i forsøksprøven og restaktiviteten etter tilsetning av fellende anti-CK-BB og fellende anti-CK-MM-antistoffer, hvorunder disse fellende antistoffer tilsettes i forskjellige reaksjonsbeholdere. Ifølge denne fremgangsmåte sikres ikke prøvens homogenitet gjennom de fellende antistoffer. Som ved Wreton-Pfleiderer-metoden krever denne fremgangsmåten arbeids- og tidkrevende multiplebestemmelser med tilsvarende høye feilkilder.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte og

et diagnostisk forsøkssett for kvantitativ bestemmelse av CK-MB-isoenzymer, en form av kreatinkinase, som forekommer

i en prøve av en biologisk væske i et flertall isoenzymer som inneholder M- eller B-underenheten eller begge.

Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse ble det funnet at man raskt, økonomisk og nøyaktig kan bestemme innholdet av CK-MB selv i væsker som .inneholder CK-BB, når den biologiske væske ble bestemt ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i krav l's karakteriserende del.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse krever ikke mange bestemmelser og beregninger, som ville føre til tvil-somme og mindre nøyaktige resultater.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er verdifull ved diagnose av hjerteinfarkt.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved kvantitativ bestemmelse av CK-MB i enhver biologisk væske. Ifølge fremgangsmåten ved foreliggende oppfinnelse kan CK-MB bestemmes under anvendelse av to deler av en eneste prøve av en biologisk væske, som gir to verdier for aktiviteten av B-underenheten i hver av disse deler. Fra disse aktivi-teter kan aktiviteten av CK-MB bestemmes.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det mulig å anvende biologiske væsker så som blod, plasma, serum, lymfevæske, gallevæske, urin, ryggmargsvæske, spytt, svette og lignende, samt også ekskrementer fra mennesker eller dyr. Det er imidlertid også mulig å anvende væske-preparater fra humant eller dyrisk vev, så som muskelvev, hjertevev, nyrevev, lungevev, hjernevev, ryggmargsvev, hud-vev og lignende. Den foretrukne biologiske væske for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er imidlertid serum fra mennesker. I de fleste tilfeller må serumet ikke fortynnes for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, men kan likevel fortynnes for å oppnå bedre resultater når andelen CK er uvan-lig høy, så som tilfellet er i serum fra pasienter som lider av et akutt hjerteinfarkt.

Spesielt vedrører fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse bestemmelsen av den enzymatiske aktiviteten til CK-MB-isoenzymer i en prøve i en biologisk væske som kan inneholde CK-MB, CK-MM og CK-BB. Fremgangsmåten utføres gjennom de trinn som er beskrevet i krav 1.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende o<p>pfinnelse anvender to immunologiske reaksjoner som utføres i forskjellige reaksjonsbeholdere. Man får fra hver av disse to reaksjoner en måling av den enzymatiske aktiviteten til væsken i reaksjonsbeholderen. Hver reaksjon kan utføres samtidig, men bestemmelsene kan også skje på forskjellige tidspunkter. Det er imidlertid en fordel om reaksjonene utføres samtidig. Det er ikke nødvendig at reaksjonsbeholderene inneholder samme porsjoner av prøven, men like porsjoner er likevel foretrukket for en enkel bestemmelse. For å bestemme og adskille den enzymatiske aktiviteten til CK^MB i den flytende prøven, må man bare gjennom en for fagmannen kjent og akseptert metode kvantifi-sere verdiene av den enzymatiske aktiviteten fra de to ad-skilte reaksjoner. For det tilfelle at reaksjonsbeholderne inneholder samme porsjoner av prøven, må man bare subtrahere den enzymatiske aktivitet man har fått i den andre reaksjonsbeholderen fra den enzymatiske aktivitet man har funnet i den første reaksjonsbeholderen. Såfremt forskjellige porsjoner anvendes, må man først gjennom en vanlig metode korrigere forskjellen i enzymkonsentrasjonen før man subtraherer verdiene man har fått fra de to reaksjonsbeholdere fira hver-, andre.

Den yed fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendte reaksjonsbeholder kan være enhver reaksjonsbeholder som er kjent på området, hvilken er egnet for utførelse av immunologiske bestemmelser. Til de anvendelige reaksjonsbeholdere for gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hører prøverør av glass, plast eller metall. Den mest egnede reaksjonsbeholder er et prøverør av glass.

Oppfinnelsen vedrører også et diagnosesett for kvantitativ bestemmelse av nærværet av CK-MB-isoenzymer fra kreatinkinase, som forekommer i biologiske væsker i flere isoenzymformer som inneholder underenheten M, B eller begge. Forsøkssettet omfatter de bestanddeler som er angitt i den karakteriserende del av krav 8.

Når alle komponentene i diagnosesettet anvendes i overens-stemmelse med fremgangsmåten, er en fagmann istand til å bestemme den enzymatiske aktiviteten til CK-MB i en prøve av en biologisk væske som inneholder CK-MB, CK-MM og CK-BB. Forsøkssettet er regnet for klinikker, hospitaler, labora-torier eller enkeltstående leger som har behov for å bestemme og adskille CK-MB i væsker.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan det som første antistoff anvendes ethvert antistoff hvilket selektivt immunologisk inhiberer M-underenheten av CK uten å signifikant immunologisk inhibere B-underenheten. Dette antistoff kan fremstilles på vanlig måte idet man injiserer et renset CK-MM antigen i et dyr og får serumet som inneholder antistoffet gjennom bloduttak. Enhver metode som er kjent på området kan anvendes for rensing av CK-MM antigener, og enhver kjent art kan anvendes for injeksjon av dette antigenet i dyrene for å oppnå tilsvarende antistoffer.

Til de antistoffer som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse hører de ifølge US patent nr. 4.237.044, som fremstilles i et dyr gjennom CK-MM-antigen, hvilke ble aktivert før injeksjon gjennom en aktivator så som merkaptoetanol, men også slike som fremstilles gjennom et CK-MM-antigen, hvilket ikke ble aktivert før injeksjon så som de hvilke ble anvendt ved den forut nevnte immunologiske inhibe-ringsbestemmelse av Wreton og Pfleiderer. Selv om man kan få felling gjennom tilsetning av det første antistoffet ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, sedimenterer denne felling ikke, men forblir,homogen under hele prosessen.

Det første antistoffet kan fremstilles i enhver dyreart. Dyrearten omfatter spesielt virveldyr så som griser, storfe, hund, esel, hest, geit, kaniner, rotter o.l. Blant disse dyr foretrekkes pattedyr så som esel, sau og geit. Det mest foretrukne dyr er geita.

Ifølge et foretrukket aspekt av oppfinnelsen frembringes det første antistoffet gjennom immunisering av geiter, en første dyreart med et renset CK-MM-antigen, hvorunder man gjennom vanlige immunologiske teknikker får geite-anti-CK-MM-antistoff. For anvendelse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen må det første antistoffet være istand til selektivt å inhibere M-enheten til CK gjennom immunologisk inhibering. Som immunologisk inhibering menes at det første antistoffet immunologisk inhiberer M-underenheten uten signifikant å inhibere B-underenheten, og at denne inhiberigen av M-underenheten skjer i prøveporsjonen under bibehold av prøvens homogenitet.

Det første antistoffet inkuberes og blandes fortrinnsvis med den første og andre porsjonen, fortrinnsvis like porsjoner av forsøksprøven i reaksjonsbeholderen.

Som følge binder det første antistoffet immunologisk til hvert CK-MB og CK-MM av hver porsjon av prøven og gir immunologisk inhibering av CK-MB og CK-MM uten å påvirke B-underenhetens signifikans. Det må påpekes at det vesentlige punktet til det første antistoffet for den andre porsjonen bare består i å binde CK-MB og CK-MM immunologisk uten signifikant å binde CK-BB. Det er ikke vesentlig eller nødvendig at det første antistoffet bevirker immunologisk inhibering i den andre porsjonen av prøven. Derav følger at det første antistoffet i den andre porsjon av prøven kan erstattes med et forskjellig antistoff, hvilket ble produsert i et annet dyr enn det hvori det første antistoffet ble fremstilt under anvendelse av renset CK-MM-antigen. Faktisk kan ethvert antistoff anvendes som første antistoff i den andre porsjonen av prøven, hvilket selektivt binder kreatinkinasen som inneholder M-underenheten uten vesentlig å inhibere B-underenheten.

Temperaturen og tiden for inkubasjon av hver porsjon av prøven etter tilsetningen av antistoffet er ikke kritisk og kan utføres ved enhver temperatur og gjennom enhver tid som er vanlig og egnet ved enzymatiske immunologiske metoder. Fortrinnsvis utføres inkubasjonen ved romtemperatur og over 5-60 min.

Ifølge foreliggende oppfinnelse utføres målingen av første porsjon med hensyn til enzymatisk aktivitet etter inkubasjonen av første prøven med det første antistoffet mens homogeniteten til prøven opprettholdes. Ifølge denne type måling kan B-underenheten av CK-MB og CK-BB bestemmes.

Mengden av første antistoff i den andre porsjon av prøven må være tilstrekkelig til å binde praktisk talt alle CK-MB og CK-MM-isoenzymer i denne porsjonen. For å oppnå de beste resultater settes det første antistoff til enhver porsjon av prøven i en mengde som er i overskudd i forhold til den mengde som normalt trenges for å binde alle CK-MB og CK-MM. Bestemmelsen av mengden av første antistoff som er nødvendig for hver prøve kan skje ved vanlige metoder.

Den andre porsjonen av prøven i den andre reaksjonsbeholderen blandes etter tilsetning av et annet antistoff, nemlig enten det første eller et erstatningsantistoff med et fellende andre antistoff. Tiden for tilsetningen av dette andre antistoffet etter tilsetningen av det første antistoffet er ikke kritisk, men ca. 5 min. er likevel foretrukket. Om ønsket kan lengre tidsintervaller anvendes. Ifølge foreliggende oppfinnelse kan ethvert antistoff anvendes som andre fellende antistoff, hvilket binder selektivt til det første antistoffet og feller dette og som er praktisk talt uten immunologisk aktivitet mot B-underenheten av kreatinkinase.

Det andre antistoffet kan fremstilles ifølge en vanlig teknikk i en dyreart som er forskjellig fra den hvori det første antistoffet ble dannet. Det andre antistoffet produ-seres gjerne ifølge konvensjonelle immunologiske teknikker gjennom immunisering av esler med geitegammaglobulin (IgG)

og utvinning av eselantigeit-IgG. Det andre antistoffet som ble fremstilt på denne måten er istand til å binde ethvert geite-CK-MM, altså også geite-anti-CK-MM, det foretrukne første antistoff. Det andre antistoffet bindes fortrinnsvis til en fast bærer. Den faste bærer som inneholder det andre antistoffet inkuberes med den andre porsjonen av prøven i den andre reaksjonsbeholderen, fortrinnsvis etter blanding i ca. 5 min. ved romtemperatur. Som følge derav binder nå

det andre antistoffet immunologisk til det annet antistoff i den andre porsjonen av prøven. Dette gir en immun utfelling som inneholder CK-MB-første antistoff/annet antistoff, CK-MM-første antistoff/annet antistoff og første antistoff/annet antistoff. Mengden av andre antistoff tilsvarer den mengde som er tilstrekkelig til å binde alle første antistoff. Ifølge, et særlig foretrukket aspekt av foreliggende oppfinnelse til-føres det andre antistoff normalt i en mengde som ligger over den som er nødvendig for å binde alle første antistoffer. Ifølge foreliggende oppfinnelse adskilles utfellingen som dannes etter tilsetningen av det andre antistoff fra den andre porsjonen av prøven ved en vanlig teknikk. Den erholdte supernantant måles med hensyn til enzymatisk aktivitet.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det i supernantanten at den enzymatiske aktivitet måles.

Til de vanlige metoder for adskillelse av utfellingen fra

den andre porsjonen hører vanlige filetreringer og kromato-grafimetoder. Den mest foretrukne metode for adskillelse av utfelling av denne andre porsjonen er sentrifugering etter-fulgt av dekantering av supernantanten og måling av den dekan-terte væske. Superatanten av den andre porsjonen måles så på vanlig måte for å bestemme aktiviteten til CK-BB-isoenzymet i denne supernantanten.

Målingen eller bestemmelsen av aktivitet av CK-MB og/eller CK-BB i hver reaksjonsporsjon av prøven kan utføres i og for seg kjente metoder. Disse metoder omfatter kolorimetriske metoder, f.eks. de ifølge metoder for enzymatisk analyse utgitt av H.U. Bergmeyer, 3. utg. 1974, bind 1, side 145 flg. Likeledes omfattet er den fluorimetriske bestemmelse av CK-BB. Kreatin befris for kreatinfosfat gjennom CK og dette kreatinet kan måles fluorimetrisk gjennom reaksjon med ninhydrin i sterk alkalisk løsning (R.B. Conn, Clin. Chem. bind 6, side 537 flg).

For dette formål foretrekkes kinetiske metoder ifølge hvilke den enzymatiske aktiviteten bestemmes gjennom måling i UV, f.eks. ved 334, 340 eller 366 nm. En standardmetode foretrekkes ved hvilken CK bestemmes under anvendelse av kreatinfosfat og adenosinfosfat: Z.Klin.Chem. Klin. Biochem., bind 8, side 658 flg (1970) og bind lo, side 182 (1972). Prøvesett for bestemmelse av CK-aktiviteten ifølge denne metoden er å

få i handelen.

Ifølge den foretrukne metode måles den enzymatiske aktivitet til CK-MB og/eller CK-BB etter tilsetning av egnede enzymer, koenzymer og substrater, idet CK-BB katalyserer den reversible overgang av en fosfatgruppe fra kreatinfosfat til adenosinfosfat og hvorunder mengden av det resulterende adenosintri-fosfat måles under anvendelse av koblede, og av heksokinase og glukose-6-fosfat-dehydrogenat katalyserte reaksjoner. Aktiviteten til det siste enzymet i reduksjonen av nikotin-amid-adenin-dinucleotid følges spektrofotometrisk gjennom måling av absorpsjonsøkningen ved 340 nm, hvorunder graden i endring av absorpsjonsøkningen er direkte proposjonal med aktiviteten til CK-MB og/eller CK-BB i hver gitte porsjon av prøven.

Isoenzymet CK-MM som anvendes som antigen for å frembringe

det første antistoffet, kan fremstilles fra enhver egnet biologisk væske så som blod, serum eller fra biologiske organer eller vev, så som hjertemuskulatur, skjelettmuskulatur, benmarg eller hvilket som helst egnet organvev, hvilket er kjent å inneholde dette isoenzymet. Den foretrukne kilde til dette isoenzymet er animalsk skjelettmuskulatur.

Rensingen av den forannevnte isoenzym til en meget høy renhets-grad før det anvendes for å fremstille antistoffet, er sterkt å anbefale for å forhindre nærvær av ikke spesifikke antistoffer. Isoenzymet kan renses ved enhver vanlig rensemetode. De foretrukne rensemetoder er likeledes av vanlig art,

nemlig alkoholfraksjonering og ionebytterkromatografi.

Renhetsgraden til isoenzymet samt særtrekkene til det fremstilte antistoff kan bestemmes ved vanlige metoder, så som gjennom immundiffusjon eller gjennom elektroforetiske teknikker. Den foretrukne metode for bestemmelsen av enheten til isoenzymet er acrylamidgelelektroforese.

Det andre antistoffet kan insolubiliseres ved å bringe det

på et uløselig bæremateriale. Egnede faste bærematerialer er vannuløslige organiske polymere så som cellulose eller andre polysaccarider, en vinyladdisjons- eller kondesasjons-polymer eller en vannuløselig uorganisk substans med poly-merkarakter så som glass eller silikongummi. På den annen side kan det andre antistoffet absorberes på overflaten til en fast bærer så som polystyren, polypropylen, polyfluorety-len eller polyvinylidenfluorid. Metoden for å feste det andre antistoffet på den faste bærer er ikke kritisk og kan omfat-te (1) kovalent kopling av det løselige andre antistoffet på

en uløselig polymer så som f.eks. gjennom reaksjon med et

insolubiliseringsmiddel,(2) fysikalsk innpakning av partiklen til det andre antistoffet i porene av en gelpolymer så som et kryssbundet polyakrylamid, eller (3) fysikalsk adsorpsjon på en uløselig polymersubstans. Såfremt et fast bæremiddel anvendes, er den foretrukne metode å feste det andre antistoffet gjennom adsorpsjon på aktivert polyvinylidenfluorid (Kynar), hvorunder fagmannen anvender kjente metoder så som f.eks. de som er beskrevet i US patent nr. 3,843,443.

De etterfølgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse ytterligere, men er ikke ment for å begrense oppfinnelsens omfang eller idé.

EKSEMPLER

Eksempel 1

CK- MM- rensing

I. Homogeriisat

Ca. 1000 g skjelettmuskulatur eller hjertevev fra mennesker opptines ved 4°C. Overskudd av fett fjernes fra vevet som deretter skjæres i små stykker (1 cm). Vevsstykkene homogeniseres så i en mixer med 1000-1500 ml kalt (4°C) 0,05M (hydroksymetyl)aminometan [tris-puffer] som inneholder 1 mN mercaptoetanol med pH 7,4. Det erholdte homogenisat sentrifugeres så ved 50'000 xg i 20 min. ved 4°C og gir en liten klump som felling. Den erholdte overliggende væske filtreres gjennom en sintret glasstrakt og oppbevares. Klumpen plasseres igjen i mixeren og homogeniseres på nytt med 500-700 ml tris-puffer, sentrifugeres ved 50'000 xg, hvoretter de^i overliggende væske blandes sammen med den første oven-stående væske etter filtrering. De sammenblandede superna-tanter anvends i del II.

II. Etanolfelling

Kald (4°C) absolutt etanol settes til de samlede superna-tanter ifølge del I,til en sluttkonsentrasjon på 50%

(V/V) oppnås, hvorpå man rører 3 0 min. ved 4°C. Den erholdte blanding sentrifugeres så i 15 min. ved 4°C og 70'000 xg. Den erholdte supernatant beholdes og den utfelte klump kastes. Kald (4°C) absolutt etanol settes langsomt til supernantanten inntil etanolkonsentrasjonen er 70%. Den erholdte blanding røres i 30 min. ved 4°C og sentrifugeres så på ny i 15 min. ved 7'000 xg og 4°C. Den erholdte klump resuspenderes i 500-700 ml 0,05 M trispuffer med pH 7,4 som inneholder ImM mercaptometanol og 0,05 M natriumklorid.

III. Ionebytterkromatografi (" Safs"- metode)

Dietylaminetyldekstran-anionbytterharpisk (DEAE Sefadex A-50) ekvilibrert med 0,05 M tris med pH 7,4 som inneholder 0,05 M NaCl og 1 mM merkaptoetanol settes til resuspenderte klumper ifølge del II, hvoretter man rører 30 min. i 4°C. Suspensjonen filtreres gjennom Whatman nr. 1 filterpapir og vaskes med porsjoner av 0,05 M trispuffer med pH 7,4 som inneholder ImM merkaptoetanol inntil filtratet bare har ubetydelig CK-aktivitet. Filtratet konsentreres så ved 4°C under trykk til 300-500 ml under anvendelse av en PM-10 filtermembran.

IV. Andre etanolfelling

Kald absolutt etanol settes langsomt til det filtrerte konsentrat ifølge del III til en 50% konsentrasjon er nådd. Den erholdte blanding røres i 30 min. ved 4°C og sentrifugeres så ved 7'000 xg, hvorunder en klump dannes. Supernantanten beholdes og klumpen kastes. Kald absolutt etanol settes langsomt til supernantanten inntil en 70% konsentrasjon nåes.

Den erholdte blanding sentrifugeres 15 min. igjen ved 7'000 xg, hvorpå den erholdte klump oppløses i et minimalt volum av 0,05 M tris med pH 7,4 (f.eks. 50-75 ml). Den erholdte blanding dialyseres mot 2000 ml 0,05 M tris med pH 7,4 ved 4°C, hvorunder pufferen skiftes to ganger. En lett felling som er oppstått ved dialysen i blandingen fjernes etter sentrifugering og kastes. Supernantanten anvendes i del V neden-for.

V. Ionebytterkromatograf i ( kolonne)

DEAE Sefadex A-50 ekvilibreres med 0,05 M tris med pH 7,4

og en 2,6 x 60 cm kolonne forberedes og vaskes uttømmende med denne puffer. Den siste supernantant ifølge.del IV settes på denne kolonnen og elueres ved 4°C og strømningshastighet på 30 ml/t. 10 ml fraksjoner oppsamles. Fraksjonene analyseres med hensyn til CK-aktivitet og proteininnhold. De samlede fraksjoner som inneholder hoveddelen av CK-MM-isoenzymet dialyseres mot 0,05 M tris på pH 7,4 som inneholder 10 mM

etylendiamin-tetraeddikksyre (EDTA).. De dialyserte fraksjoner konsentreres ved 4°C under trykk og under anvendelse av en PM-10-filtermembran til et egnet konsentrat (f,eks. 8-40 mg protein/ml) og lagres ved 4°C i 0,05 M trispuffer med pH

7,5 som inneholder 10 mM EDTA. En lett felling som danner seg ved henstand fjernes gjennom sentrifugering. Renheten av CK-MM i det lagrede materiale er gjerne 90-100%, hvilket

ble bestemt ved polyacrylamidgelelektroforese. Elektroforese på agarosegel anvendes for å vise at MB og BB-isoenzymet ikke er tilstede i det lagrede materiale. Produktet som oppnås på denne måten er den ferdig rensede prøve av CK-MM.

Eksempel 2

Geite-anti-CK-MM-serum:

For å fremstille immunogenet for immunisering av geiter for-tynnas det rensede CK-MM som ble fremstilt ifølge eksempel 1 nad 0,02 M trispuffer på pH 7,5 til mg/ml og med et likt volum' på Freund's komplette Adjuvans (en mineraloljedisper-sjon som inneholder drepte M-tuberkulose basiller). Den erholdte blanding emulgeres til en vann/olje-emulsjon. Geiter injiseres hver uke med 1 ml av dette immunogen subkutant i skulderområdet på to steder, hvorunder 0,5 ml immunogen anvendes på hver side. Geitene tappes for blod hver 2. uke for å gi geite-anti-CK-MM-serum.

Eksempel 3

Aktivering av polyvinylidenfluorid

For å koble globulinfraksjonen til esel-anti-geite-IgG-serum til polyvinylidenfluorid (PVF), aktiveres PVF forut etter den følgende fremgangsmåte: 1. 15 1 tris-azid-puffer oppløses gjennom løsning av 36,3 g tris (hydroksymetyl)-aminometan (Trizma-base) og 15 g natriumazid i ca. 14,000 ml ionefritt vann ved romtemperatur, hvorunder pR stilles på 7,5 t 0,1 med 5 N saltsyre. 5 N saltsyre får man gjennom fortynning av 50 ml 38%ig saltsyre med 70 ml ionefritt vann. Volumet av den erholdte løsning innstilles med ionefritt vann på 15,000 ml og lagres ved romtemperatur.

2, 10 0 g polyvinylidenfluoridpulver blandes i en egnet beholder med 600 ml 2-propanol. Den erholdte suspensjon homogeniseres gjennom homogenisator i 30 sek. ved en tilstrekkelig hastighet til å gi en fin dispersjon, og ga en blanding som overføres i en kalibrert 4 1 sylinder. Blandingen får stå 10 min. ved romtemperatur. 3400 ml salt-vann som er fremstilt ved oppløsning av 28,9 g natriumklorid i 3400 ml ionefritt vann tilsettes blandingen. Etter tilsetningen av saltvannet blandes den erholdte blanding godt, hvoretter man lar den sette seg 1 time eller så lenge at polyvinylidenfluoridet har satt seg til ca. 1/5 av totalvolum-et. Supernantanten fjernes gjennom avsugning og volumet økes igjen med ionefritt vann til ca. 4 1. Etter avsetning av polyvinylidenfluoridet suges supernantanten av på nytt. Heretter bringes volumet på nytt til 4000 ml og polyvinylidenfluoridet vaskes 3 ganger til på denne måten med ionefritt vann. Deretter vaskes polyvinylidenfluoridet igjen to ganger på denne måten med tris-azid-puffer fra trinn 1. Etter den siste vasking bringes volumet av polyvinylidenfluoridet på 2000 ml, hvoretter suspensjonen lagres ved romtemperatur, inntil den anvendes for kobling av esel-anti-geite-IgG-serumet.

Eksempel 4

Fremstilling av globulinfraksjonen av esel- anti- geite- TgG-serum

Globulinfraksjonen fra Esel-anti-geite-IgG-serum for kob-lingen til den aktiverte PVF ifølge eksempel 3 erholdes under anvendelse av de følgende materialer og metoder:

Fremgangsmåte;

1. 10Q ml esel^anti-geite-IgG^serum (punkt a), bringes yed 4°C i en egnet beholder med magnetrører. Deretter tilsettes under forsiktig røring 6 0 ml mettet ammoniumsulfat (punkt Bl for å bringe innholdet i beholderen til 37,5% metning. Man rører 1 time ved 4°C, hvoretter det utfelte antistoff samles san en klump gjennon sentrifugering i 30 min. ved 4°C og 12<1>0.00 xg. Klumpen løses i ca. 70 ml tris-azid-puff^er (punkt cl, hvoretter volumet bringes til original-volirøet på 100 ml med den samme puffer. Heretter tilsettes under lett føring ved 4°C 50 ml mettet ammoniumsulfatløs-ning" (punkt bl for å bringe den erholdte blanding på en 33% metning. Elandingen røres i 1 time ved 4°C. Det utfelte antistoff erholdes etter 30 min. sentrifugering ved 12'000 xg og 4°C sam en klump. Klumpen løses i ca. 4 0 ml tris-azid-puf f er (punkt cl og overføres i en dialyseslange. Man dialyserer mot tris-azid-puffere ved 4 C. Pufferen veksles tre ganger (2 1 pr. veksel) etter et minimum på 4 timers dialyse hver gang. Nærværet av sulfationer fastslås gjennom tilsetning av 1 ml dialysat til 1 ml mettet bariumkloridløsning, idet et hvit presipitat etter røring viser nærvær av sulfat.

Hvis et eventuelt presipitat opparbeides, veksles dialysatet med frisk puffer og det dialyseres inntil sulfattesten er negativ. Dialysatvolumet bringes til 100 ml med tris-azid-puf f er og sentrifugeres 10 min. ved 2'000 xg og 4°C, hvoretter supernantanten samles. Supernatanten som inneholder det fremstilte esel-anti-geite-IgG , lagres ved 4°C inntil det koples til det aktiverte polyvinylidenfluorid ifølge eksempel 3.

Eksempel 5

Kopling av globulinfraksjon fra esel- anti- geite- IgG på aktivert polyvinylidenfluorid

Koplingen av globulinfraksjonen av esel-anti-geite-IgG-serumet fremstilt ifølge fremgangsmåten fra eksempel 4 til en suspensjon av det aktiverte PV-F fremstilt ifølge fremgangsmåten ifølge eksempel 3 utføres under anvendelse av de etter-følgende reagenser og metoder:

Fremgangsmåte:

1. 10 1 Tris-EDTA-puffer fremstilles som følge: 24,2 g trizma-base (punkt c), 10,0 g natriumazid og 147,4 g ETDA (punkt d) oppløses ved romtemperatur i omtrent 9000 ml ionefritt vann. For å oppnå en fullstendig oppløsning kan det være nødvendig å røre i 30-60 min. Løsningens pH inn-tilles på 7, + 0,1 med 10 N.NaOH, og løsningen bringes med ionefritt vann på et- volum av 10.000 ml. Løsningen lagres ved romtemperatur. 2. 2000 ml suspensjon som inneholder aktivert polyvinylidenfluorid (punkt a) bringes i en egnet beholder og røres lett. 100 ml esel-anti-geite-serum (punkt b) tilsettes suspensjonen, hvoretter man rører 6 timer ved romtemperatur og natten over (12-18 timer) ved 4°C. Man får esel-anti-geite-IgG-antistoffer bundet til polyvinylidenfluorid. 3. Antistoffene som er koblet på polyvinylidenfluorid ifølge trinn 2 samles gjennom sentrifugering ved 1500 xg i 10 min. sam en klump. Supernantanten helles av og klumpen resuspenderes i et totalvolum på 2000 ml tris-EDTA-puffer (fremstilt som i trinn 1).

4. Trinn 3 gjentas tilsammen 3 ganger.

5. Klumpen, hhv. klumpene som fåes etter trinn

4 resuspenderes til et volum på 500 ml i tris-EDTA-puffer (trinn 1), hvoretter 2,5 g storfeserumalbumin oppløses gjennom litt røring i 30 min. Denne suspensjon homogeniseres deretter gjennom en hamogenisator i 3 0 sek. i en hastighet som gir en fin dispersjon og således gir uløselig anti-geite-IgG

som produkt.

6. Det uløslige anti-geite-IgG-produktet lagres ved 4°C i den følgende endelige konsentrasjon: 20% (M/V) polyvinylidenfluorid 0,02 g M tris pH 7,5

0,1% (W/V) natriumazid

0,5% (W/V) BSA

3 9,6 mM ETDA

Eksempel 6

En bestemmelse av CK-MB-aktiviteten i en biologisk væske utføres gjennom den følgende metode som krever to prøverør: 1. Til prøverør 1 settes: 20 ul pasientserum og 250 pl geite-anti-CK-MM-serum (som i eksempel 2), hvorunder blandingen røres lett og så får stå 2 0 min. ved romtemperatur, hvoretter man får den blanding som skal anvendes i trinn 3. 2. Til prøverørene 2 settes: 200 pl pasientserum og 50 ul geite-anti-CK-MM-serum (fremstilt som i eksempel 2), hvorunder man rører lett og så lar stå 5 min. ved romtemperatur. Deretter tilsetter man 2 00 ul lagret u-løselig anti-geite-IgG (fremstilt som i eksempel 5), hvorunder man blander lett og lar reaksjonsblandingen stå 5 min. ved romtemperatur. Røret sentrifugeres så i 5 min. ved 1000 xg og den erholdte supernantant anvendes i trinn 3. 3. 100 ul av den resulterende blanding fra trinn 1 og 200 ul av supernantanten fra trinn 2, settes til den første og 2 porsjon av 1,0 ml enzymatisk CK-reagens (eksempel 7) for måling av CK-enzymaktiviteten. Deretter blandes hver porsjon grundig og man inkuberer i 5 min. ved 37°C. Absorpsjonen opptegens for hver porsjon ved 340 nm gjennom en totaltid på 5 min. i periodiske intervaller i et spektrofotometer ved 37°C under anvendelse av en kyvette med 1 cm sjikttykkelse. De opptegnede absorpsjoner omvand- les i adsorpsjonsvekselen pr. min og i.e./l CK-aktivitet for hver porsjon erholdes. Deretter subtraheres verdien av CK-aktiviteten til den andre porsjon fra verdien av CK-aktiviteten til den første porsjon.

Eksempel 7

Det enzymatiske CK-reagens fra eksempel 6 inneholder de følgende reagenser:

Reagensene formuleres i piperazin-N,N-bis (2-etansulfonsyre)-puffer med pH 5,8 + 0,15 (30°C).

Claims (5)

1. Fremgangsmåte ved kvantitativ bestemmelse av kreatinkinase-MB-isoenzym-form av kreatinkinase i biologiske væsker, hvilke inneholder underenhetene M eller B eller begge, karakterisert ved at a) det i en første reaksjonsbeholder inkuberes en første av to porsjoner av en prøve av en biologisk væske med et første antistoff, hvilket bindes selektivt immunologisk med kreatinkinase-isoenzymene som inneholder M-underenheten gjennom selektiv immunologisk inhibering av M-underenheten i den første porsjon av prøven av den biologiske væske og aktiviteten til BB og MB isoenzymene deretter måles i den første porsjonen av prøven av den biologiske væsken kvantitativt, b) . det i en separat reaksjonsbeholder inkuberes den andre porsjon av prøven av den biologiske væske med (1) et antistoff som selektivt immunologisk binder kreatinkinase-isoenzymene som inneholder M-underenheten i den andre porsjon av prøven av den biologiske væske, (2) tilsetter et fellende andre antistoff som eventuelt kan være bundet til et fast bæremateriale, hvilket selektivt immunologisk bindes til antistoffet som binder kreatinkinase-isoenzymet som inneholder M-underenheten for å oppnå et reaksjonsprodukt i form av et presipitat i den andre porsjonen bestående av dette annet antistoff med det andre antistoff og disse kreatinkinase^isoenzymer som inneholder M-underenheten og at aktiviteten av B-^isoenzymet deretter måles i supernatanten i denne andre porsjonen kvantitativt og c) man bestemmer CK-MB-aktiviteten i denne prøven fra måleresultatene man får fra den første og den andre porsjon.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det første antistoff fra trinn a) og antistoffet som binder kreatinkinase-isoenzymet, hvilket inneholder M-underenhetene fra trinn b) er geite-anti-kreatinkinase-MM og at det andre antistoff fra trinn b) er esel-anti-geite-IgG.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender det andre fellende antistoff bundet til en fast bærer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at man som fast bærer anvender polyvinyl-idenf luorid.

5. Diagnoseprøvesett for kvantitativ bestemmelse av nærvær av kreatinkinase-MB-isoenzym-formen av kreatinkinase, hvilket forekommer i biologiske væsker i flere isoenzymer hvilke inneholder underenheten for M eller B eller begge, karakterisert ved at prøvesettet inneholder følgende : a) en første beholder som inneholderet antistoff som er istand til selektivt å bindes immunologisk til kreatinkinase-isoenzymene, hvilke inneholder underenheten M gjennom selektiv immunologisk inhibering av M-underenheten, b) en andre beholder som inneholder et, eventuelt til et fast bæremateriale så som polyvinylidenfluorid bundet, fellende andre antistoff, hvilket er istand til selektivt immunologisk å reagere med antistoffet i den første beholder og c) et reagens for enzym-koenzym og subtrat sam er istand til å bestemme den enzymatiske aktiviteten til B-underenheten.