CH646997A5 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von creatinkinase-mb-isoenzym. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein diagnostisches Testkit für die quantitative Bestimmung des CK-MB-Isoenzyms, einer Form der Creatin-kinase, welche in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit in einer Vielzahl von Isoenzymen enthaltend die M- oder B-Untereinheiten oder beide vorkommt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass man schnell, ökonomisch und präzis den Gehalt an CK-MB sogar in Flüssigkeiten enthaltend CK-BB bestimmen kann, wenn die biologische Flüssigkeit nach dem nachfolgenden Verfahren bestimmt wird:

a) Inkubieren in einem ersten Reaktionsgefäss eine erste von zwei Proben einer biologischen Flüssigkeit mit einem ersten Antikörper, welcher selektiv die Creatinkinase-Isoenzyme immunologisch inhibiert, die M-Untereinheit enthalten und zwar durch selektive Immunoinhibition der M-Untereinheit in der ersten Probe zur Inhibition der enzymatischen Aktivität von nur der M-Untereinheit von Creatinkinase-Isoenzymen und hierauf quantitativ die Aktivität der B-Untereinheit in der ersten Probe misst:

b) Inkubieren in einem separaten Reaktionsgefäss die zweite Portion der biologischen Flüssigkeitsprobe mit (1) einem Antikörper, welcher selektiv immunologisch die Creatinkinase-Isoenzyme bindet, die die M-Untereinheit enthalten und (2) einem fällenden zweiten Antikörper, welcher selektiv immunologisch mit demjenigen Antikörper bindet, der die Creatinkinase-Isoenzyme bindet, die M-Un-tereinheit enthalten und ein Reaktionsprodukt dieses zweiten Antikörpers mit dem andern Antikörper und den Creatinkinase-Isoenzymen enthaltend die M-Untereinheit in Form eines Präzipitates in der zweiten Portion bildet und danach quantitativ die Aktivität der B-Isoenzyme im Überstand der zweiten Portion misst und c) Bestimmen der CK-MB-Aktivität in der biologischen Flüssigkeit aus den Messungen erhalten von der ersten und der zweiten Portion.

Das Verfahren gemäss vorliegender Erfindung erfordert keine Vielzahl von Bestimmungen und Berechnungen, welche zu zweifelhaften und weniger genauen Ergebnisse führen würde.

Das Verfahren gemäss vorliegender Erfindung ist wertvoll bei der Diagnose von Herzinfarkten.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von CK-MB in jeder biologischen Flüssigkeit. Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann CK-MB unter Verwendung von zwei Portionen einer einzigen Probe einer biologischen Flüssigkeit bestimmt werden, welche zwei Werte für die Aktivität der B-Untereinheit in jeder dieser Portionen liefert. Von diesen Aktivitäten kann die Aktivität der CK-MB bestimmt werden.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren ist es möglich biologische Flüssigkeiten, wie Blut, Plasma, Serum, Lymphflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Urin, Rückenmarkflüssigkeit, Speichel, Schweiss und dergleichen oder aber auch Stuhlausscheidungen von Menschen oder Tieren zu verwenden. Es ist aber auch möglich, Flüssigpräparate von menschlichem oder tierischem Gewebe, wie Muskelgewebe, Herzgewebe, Nierengewebe, Lungengewebe, Hirngewebe, Rückenmarksgewebe, Hautgewebe und dergleichen zu verwenden. Die bevorzugte biologische Flüssigkeit für das erfindungsgemässe Verfahren ist jedoch menschliches Serum. In den meisten Fällen muss das Serum für das erfindungsgemässe Verfahren nicht verdünnt werden, kann jedoch zur Erzielung besserer Resultate verdünnt werden, wenn der Anteil an CK unüblicherweise hoch ist, wie dies in Seren von Patienten der Fall ist, die an einem akuten Herkinfarkt leiden.

Im speziellen betrifft das Verfahren gemäss vorliegender Erfindung die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des CK-MB-Isoenzyms in einer Probe in einer biologischen Flüssigkeit, welche CK-MB, CK-MM und CK-BB enthalten kann. Das Verfahren wird durchgeführt durch a) Inkubation einer ersten von zwei Portionen der Probe der biologischen Flüssigkeit in einem ersten Reaktionsgefäss mit einem ersten Antikörper, welcher selektiv immunologisch mit den Creatinkinase-Isoenzymen bindet, welche die M-Untereinheit enthalten, und zwar durch selektive Immunoinhibition der M-Untereinheit in der ersten Portion zur Inhibition der enzymatischen Aktivität von nur der M-Untereinheit der Creatinkinase-Isoenzyme und hernach durch quantitative Messung der Aktivität der B-Untereinheit in dieser ersten Portion der Probe der biologischen Flüssigkeit, (b) Inkubation der zweiten Portion der Probe dieser biologischen Flüssigkeit in einem separaten zweiten Reaktionsgefäss mit a) einem Antikörper, welcher selektiv mit dem Creatinkinase-Isoenzym, enthaltend die M-Untereinheit bindet und 2) einem fällenden zweiten Antikörper, welcher immunologisch mit dem Antikörper bindet, der die Creatinkinase-Isoenzyme enthaltend die M-Untereinheiten enthält und ein Reaktionsprodukt bildet zwischen dem zweiten Antikörper und dem Antikörper und den Creatinkinase-Isoenzymen enthaltend die M-Untereinheit als Niederschlag in dieser zweiten Portion und hernach quantitativ die Aktivität des B-Isoenzyms im Überstand dieser zweiten Portion misst und c) die CK-MB-Aktivität in der Probe der biologischen Flüssigkeit aus den Messungen der ersten und zweiten Portion bestimmt.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet zwei immunologische Reaktionen, welche in verschiedenen Reaktionsgefässen durchgeführt werden. Man erhält von jeder dieser zwei Reaktionen eine Messung der enzymatischen Aktivität der Flüssigkeit im Reaktionsgefäss. Jede Reaktion kann gleichzeitig durchgeführt werden, doch können die Bestimmungen auch zu verschiedenen Zeiten erfolgen. Es ist jedoch von Vorteil, wenn die Reaktionen gleichzeitig durchgeführt werden. Es ist nicht notwendig, dass die Reaktions-gefässe gleiche Portionen der Probe enthalten, doch sind gleiche Portionen füi eine einfache Bestimmung bevorzugt. Zur Bestimmung und Unterscheidung der enzymatischen Aktivität von CK-MB in der flüssigen Probe muss man nur durch eine in der Fachwelt bekannte und von der Fachwelt akzeptierte Methode die Werte der enzymatischen Aktivität von den beiden separaten Reaktionen quantifizieren. Für den Fall, dass die Reaktionsgefässe gleiche Portionen an Probe enthalten, muss man nur die enzymatische Aktivität die man im zweiten Reaktionsgefäss erhalten hat, von der enzymatischen Aktivität die man im ersten Reaktionsgefäss erhalten hat, subtrahieren. Sofern ungleiche Portionen verwendet werden, muss man zuerst durch eine herkömmliche Methode die Differenz in der Enzymkonzentration korrigieren, bevor man

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die durch die zwei Reaktionsgefässe erhaltenen Werte voneinander subtrahiert.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren verwendete Reaktionsgefäss kann jedes in der Art bekannte Reaktionsgefäss sein, das für die Durchführung immunologischer Bestimmungen geeignet ist. Zu den verwendbaren Reaktionsgefässen für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens gehören Teströhrchen aus Glas, Plastik oder Metall. Das geeignete Reaktionsgefäss ist ein Teströhrchen aus Glas.

Die Erfindung betrifft auch ein Diagnosekit zur quantitativen Bestimmung der Gegenwart des CK-MB-Isoenzyms von Creatinkinase, welches in einer biologischen Flüssigkeit in einer Vielzahl von Isoenzymformen enthaltend die Untereinheit M, B oder beide vorkommt. Die Bestandteile des Testkits sind: a) ein erster Behälter enthaltend einen Antikörper, welcher fähig ist, selektiv immunologisch mit den Creatinkinase-Isoenzymen zu binden, die die M-Untereinheit enthalten und zwar durch selektive Immuninhibition der M-Unter-einheit, b) einen zweiten Behälter enthaltend einen fällenden zweiten Antikörper, welcher fähig ist, selektiv immunologisch mit dem Antikörper gemäss erstem Behälter zu reagieren und c) ein Reagens von Enzym-Coenzym und Substrat, welches fähig ist, die enzymatische Aktivität der B-Untereinheit zu bestimmen.

Wenn alle Komponenten des Diagnosetestkits in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist der Fachmann in der Lage, die enzymatische Aktivität von CK-MB in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit enthaltend CK-MB, CK-MM und CK-BB zu bestimmen. Das Testkit ist geeignet für Kliniken, Spitäler, Laboratorien und einzelne Aerzte, welche eine Notwendigkeit zur Bestimmung und Unterscheidung von CK-MB in Flüssigkeiten haben.

Nach der vorliegenden Erfindung kann als erster Antikörper jeder Antikörper verwendet werden, welcher selektiv die M-Untereinheit von CK immuninhibiert, ohne die B-Untereinheit signifikant zu immuninhibieren. Diese Antikörper können in herkömmlicher Weise hergestellt werden, indem man einem Tier gereinigtes CK-MM-Antigen injiziert und durch Blutentnahme das Serum enthaltend den Antikörper gewinnt. Jede in der Art bekannte Methode kann zur Reinigung des CK-MM-Antigens verwendet werden, und es kann jede bekannte Art zur Injektion dieses Antigens in Tiere verwendet werden, um entsprechende Antikörper zu erhalten. Zu den Antikörpern die gemäss vorliegender Erfindung verwendet werden können, zählen die gemäss US-Patent Nr. 4 237 044, welche in einem Tier durch CK-MM-Antigen erzeugt werden, welches vor der Injektion durch einen Aktivator, wie Mercaptoäthanol, aktiviert wurde, aber auch solche, welche durch ein CK-MM-Antigen erzeugt werden, welches vor der Injektion nicht aktiviert wurde, wie diejenigen, die bei der vorerwähnten Immunoinhibitionsbestimmung von Wreton und Pf leiderer verwendet werden. Obwohl durch die Zugabe des ersten Antikörpers beim Verfahren der vorliegenden Erfindung Fällung entstehen kann, sedimentiert diese Fällung nicht, sondern bleibt während des ganzen Verfahrens homogen.

Die erste Antikörper kann in jeder Tierspezies erzeugt werden. Die Tierspezies umfasst insbesondere Wirbeltiere, wie Schwein, Rindvieh, Hund, Esel, Pferd, Ziege, Kaninchen, Ratte und dergleichen. Unter diesen Tieren sind Säugetiere wie Esel, Schaf und Ziege bevorzugt. Das bevorzugteste Tier ist die Ziege.

Nach einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird der erste Antikörper durch Immunisieren von Ziegen, einer ersten Tierspezies, mit einem gereinigten CK-MM-Antigen erzeugt, wobei man durch herkömmliche immunologische Techniken Ziegen-Anti-CK-MM-Antikörper enthält. Zur Verwendung im erfindungsgemässen Verfahren muss der erste Antikörper in der Lage sein, die M-Untereinheit von CK selektiv zu inhibieren und zwar durch Immuninhibition. Unter Immuninhibition wird verstanden, dass der erste Antikörper die M-Untereinheit immunologisch inhibiert ohne die B-Un-tereinheit signifikant zu inhibieren, und dass diese Inhibition der M-Untereinheit in der Probenportion unter Erhaltung der Homogenität der Probe erfolgt.

Der erste Antikörper wird mit der ersten und zweiten Portion, vorzugsweise gleichen Portionen der Testprobe, im Reaktionsgefäss inkubiert und vorzugsweise gemischt.

Als Ergebnis bindet der erste Antikörper immunologisch an jedes CK-MB und CK-MM jeder Portion der Probe und liefert Im'muninhibition von CK-MB und CK-MM ohne die B-Untereinheit signifikant zu beeinträchtigen. Es ist zu beachten, dass der wesentliche Punkt des ersten Antikörpers für die zweite Portion lediglich darin besteht, die CK-MB und CK-MM immunologisch zu binden ohne signifikant CK-BB zu binden. Es ist nicht wesentlich oder notwendig,

dass der erste Antikörper Immuninhibition in der zweiten Portion der Probe bewirkt. Daraus resultiert, dass der erste Antikörper in der zweiten Portion der Probe durch einen unterschiedlichen Antikörper ersetzt werden kann, der in einem andern Tier als demjenigen zur Erzeugimg des ersten Antikörpers unter Verwendung von gereinigtem CK-MM-Anti-gen produziert wurde. Tatsächlich kann als erster Antikörper in der zweiten Portion der Probe jeder Antikörper verwendet werden, welcher selektiv die Creatinkinase enthaltend die M-Untereinheit bindet ohne wesentlich die B-Untereinheit zu inhibieren.

Die Temperatur und Zeit der Inkubation jeder Portion der Testprobe nach der Zugabe des Antikörpers ist nicht kritisch und kann bei jeder Temperatur und während jeder Zeit durchgeführt werden, die bei Enzymimmunverfahren üblich und geeignet sind. Vorzugsweise werden die Inkubationen bei Raumtemperatur und während 5 bis 60 Minuten durchgeführt.

Nach der vorliegenden Erfindung wird die Messung der ersten Portion auf enzymatische Aktivität nach der Inkubation dieser ersten Probe mit dem ersten Antikörper durchgeführt während die Homogenität der Probe erhalten bleibt. Nach dieser Art der Messung kann die B-Untereinheit von CK-MB und CK-BB bestimmt werden.

Die Menge an erstem Antikörper in der zweiten Portion der Probe muss genügend sein, um praktisch alle CK-MB und CK-MM-Isoenzyme dieser Portion zu binden. Um beste Ergebnisse zu erzielen wird der erste Antikörper zu jeder Portion der Probe in einer Menge zugegeben, die im Überschuss zu derjenigen Menge ist, die normalerweise benötigt wird, um alle CK-MB und CK-MM zu binden. Die Bestimmung der Menge an erstem Antikörper, welche für jede Probe notwendig ist, kann nach herkömmlichen Methoden erfolgen.

Die zweite Portion der Testprobe im zweiten Reaktionsgefäss wird nach Zugabe eines anderen Antikörpers, nämlich entweder des ersten oder eines Ersatzantikörpers mit einem fällenden zweiten Antikörper versetzt. Die Zeit für die Zugabe dieses zweiten Antikörpers nach der Zugabe des ersten Antikörpers ist nicht kritisch, wobei jedoch etwa 5 Minuten bevorzugt sind. Falls erwünscht, können längere Zeitintervalle verwendet werden. Gemäss der vorliegenden Erfindung kann als zweiter fällender Antikörper jeder Antikörper verwendet werden, welcher selektiv an den ersten Antikörper bindet und diesen fällt und welcher praktisch frei von immunologischer Aktivität gegen die B-Untereinheit von Creatinkinase ist.

Der zweite Antikörper kann nach einer herkömmlichen Technik in einer Tierspezies erzeugt werden, welche unterschiedlich ist zu derjenigen in der der erste Antikörper gebiï-

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det wurde. Typischerweise wird der zweite Antikörper nach konventionellen immunologischen Techniken durch Immunisieren von Eseln mit Ziegengammaglobulin (IgG) und Gewinnung des Eselantiziegen-IgG produziert. Der zweite Antikörper, der in dieser Weise erhalten wurde, ist fähig, jedes Ziegen-IgG zu binden, also auch Ziegenanti-CK-MM, den bevorzugten ersten Antikörper. Der zweite Antikörper wird vorzugsweise an einem festen Träger gebunden. Der feste Träger enthaltend den zweiten Antikörper wird mit der zweiten Portion der Testprobe im zweiten Reaktionsgefäss, vorzugsweise nach Mischen während ungefähr 5 Minuten bei Raumtemperatur, inkubiert. Als Ergebnis bindet nun der zweite Antikörper immunologisch zum andern Antikörper in der zweiten Portion der Probe. Dies gibt ein Immunpräzipi-tat enthaltend CK-MB-ersten Antikörper/zweiten Antikörper, CK-MM-ersten Antikörper/zweiten Antikörper und ersten Antikörper/zweiten Antikörper. Die Menge an zweitem Antikörper entspricht der Menge, die genügend ist, um alle ersten Antikörper zu binden. Gemäss einem besonders bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der zweite Antikörper gewöhnlich in einer Menge zugeführt, welche über derjenigen liegt, die notwendig ist, um alle ersten Antikörper zu binden.

Gemäss der vorliegenden Erfindung wird das Präzipitat, welches nach Zugabe des zweiten Antikörpers entsteht, von der zweiten Portion der Probe nach einer herkömmlichen Technik getrennt. Der erhaltene Überstand wird auf enzymatische Aktivität gemessen. Gemäss der vorliegenden Erfindung ist es der Überstand, welcher auf enzymatische Aktivität gemessen wird.

Zu den herkömmlichen Methoden zur Abtrennung des Präzipitates von dieser zweiten Portion gehören herkömmliche Filtrationen und Chromatographiemethoden. Die am meisten bevorzugte Methode zur Abtrennung des Präzipitates aus dieser zweiten Portion ist die Zentrifugation gefolgt durch Dekantierung des Überstandes und Messen der dekantierten Flüssigkeit.

Der Überstand dieser zweiten Portion wird dann in herkömmlicher Weise gemessen um die Aktivität des CK-BB-Isoenzyms in diesem Überstand zu bestimmen.

Die Messung oder Bestimmung der Aktivität von CK-MB und/oder CK-BB in jeder Reaktionsportion der Testprobe kann nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden. Diese Methoden umfassen kolorimetrische Methoden, z.B. diejenige gemäss Methoden der enzymatischen Analyse herausgegeben durch H.U. Bergmeyer, 3. Edition 1974, Vol. 1, Seiten 145 und folgende. Ebenfalls umfasst ist die fluori-metrische Bestimmung von CK-BB. Creatin wird aus Creatin-phosphat durch CK befreit und dieses Creatin kann durch Reaktion mit Ninhydrin in streng alkalischer Lösung fluori-metrisch gemessen werden (R.B. Conn, Clin. Chem., Vol. 6, Seite 537 und folgende 1960).

Für diesen Zweck bevorzugt sind kinetische Methoden, nach denen die enzymatische Aktivität durch Messen im UV, z.B. bei 334, 340 oder 366 nm bestimmt wird. Bevorzugt ist eine Standardmethode, bei der CK unter Verwendung von Creatinphosphat und Adenosinphosphat bestimmt wird: Z. Klin. Chem. Klin, Biochem., Vol. 8, Seiten 658 und folgende (1970) und Vol. 10, Seite 182 (1972). Testgarnituren zur Bestimmung der CK-Aktivität nach dieser Methode sind käuflich erhältlich.

Nach der bevorzugten Methode wird die enzymatische Aktivität der CK-MB und/oder CK-BB nach Zugabe geeigneter Enzyme, Coenzyme und Substrate gemessen, wobei CK-BB den reversiblen Übergang einer Phosphatgruppe von Creatinphosphat zu Adenosindiphosphat katalysiert und wobei die Rate des resultierenden Adenosintriphosphates unter Verwendung gekuppelter und von Hexokinase und Glucose-

-6-phosphat-dehydrogenase katalysierten Reaktionen gemessen wird. Die Aktivität dieses letzten Enzyms in der Reduktion von Nikotinamid-adenin-dinucleotid wird spektrophoto-metrisch verfolgt durch die Messung der Absorptionszunahme bei 340 nm, wobei die Rate in der Änderung der Absorptionszunahme direkt proportional zur Aktivität des CK-MB und/oder CK-BB in jeder gegebenen Portion der Testprobe ist.

Das Isoenzym CK-MM, das als Antigen zur Erzeugung des ersten Antikörpers verwendet wird, kann aus jeder geeigneten biologischen Flüssigkeit wie Blut, Serum oder aus biologischen Organen oder Geweben, wie Herzmuskulatur, Skelettmuskulatur, Knochenmark oder irgendeinem geeigneten Organgewebe erhalten werden, von welchem bekannt ist, dass es dieses Isoenzym enthält. Die bevorzugte Quelle für dieses Isoenzym ist tierische Skelettmuskulatur.

Die Reinigung des vorerwähnten Isoenzyms zu einem sehr hohen Grad von Reinheit bevor es zur Erzeugung von Antikörpern verwendet wird, ist sehr zu empfehlen um die Gegenwart nicht-spezifischer Antikörper zu vermindern. Das Isoenzym kann nach jeder herkömmlichen Reinigungsmethode gereinigt werden. Die bevorzugten Reinigungsmethoden sind ebenfalls herkömmlicher Art, nämlich Alkoholfraktionie-rung und Anionenaustauschchromatographie.

Der Reinheitsgrad des Isoenzyms sowie die Spezifität der erzeugten Antikörper können nach herkömmlichen Methoden bestimmt werden, wie durch Immundiffusion oder durch elektrophoretische Techniken. Die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Reinheit des Isoenzyms ist die Acrylamid-gelelektrophorese.

Der zweite Antikörper kann durch Anbringen an ein unlösliches Trägermaterial insolubilisiert werden. Geeignete feste Trägermaterialien umfassen wasserunlösliche organische Polymere, wie Cellulose oder andere Polysaccharide, ein Vinyladditions- oder Kondensationspolymer oder eine wasserunlösliche anorganische Substanz mit Polymercharakter, wie Glas oder Silikongummi. Auf der andern Seite kann der zweite Antikörper auf der Oberfläche eines festen Trägers, wie Polystyrol, Polypropylen, Polyfluoräthylen oder Polyvi-nylidenfluorid absorbiert werden. Die Methode des Anheftens des zweiten Antikörpers an den festen Träger ist nicht kritisch und kann umfassen (1) kovalentes Kuppeln des löslichen zweiten Antikörpers an ein unlösliches Polymer, wie z.B. durch Reaktion mit einem Insolubilisierungsmittel, (2) physikalisches Einwickeln der Partikel des zweiten Antikörpers in die Poren eines Gelpolymers, wie eines quervernetzten Polyacrylamides, oder (3) physikalische Adsorption an eine unlösliche polymere Substanz. Sofern ein fester Träger verwendet wird, ist die bevorzugte Weise die, dass der zweite Antikörper durch Adsorption an aktiviertes Polyvinyliden-fluorid (Kynar) angeheftet wird, wobei dem Fachmann bekannte Methoden verwendet werden, wie z.B. diejenige, die im US-Patent Nr. 3 843 443 beschrieben ist.

Beispiel 1

CK-MM-Reinigung I. Homogenat

Ungefähr 1000 g menschliche Skelettmuskulatur oder Herzgewebe wird bei 4°C aufgetaut. Überschüssiges Fett wird vom Gewebe abgetrennt, welches nachher in kleine Stücke (1 cm) geschnitten wird. Die Gewebestücke werden dann in einem Mischer mit 1000-1500 ml kaltem (4°C) 0,05M (Hydroxymethyl) Aminomethan [Tris-Puffer] enthaltend 1 mM Mercaptoäthanol vom pH 7,4 homogenisiert. Das erhaltene Homogenat wird dann bei 50'000 xg während 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert und liefert als Niederschlag

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ein Kügelchen. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird durch einen gesinterten Glastrichter filtriert und zurückbehalten. Das Kügelchen wird wieder in den Mischer gegeben und mit 500-700 ml Tris-Puffer erneut homogenisiert, bei 50,000 xg zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit mit der ersten überstehenden Flüssigkeit nach Filtrieren zusammengegeben wird. Die zusammengegebenen Überstände werden in Teil II verwendet.

II. Äthanolfällung

Kaltes (4°C) absolutes Äthanol wird zu den vereinigten Überständen gemäss Teil I gegeben bis eine Endkonzentration von 50% (V/V) erreicht wird, worauf man während 30 Minuten bei 4°C rührt. Das erhaltene Gemisch wird dann während 15 Minuten bei 4°C und 70000 xg zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird zurückbehalten und das ausgefallene Kügelchen wird verworfen. Kaltes (4°C) absolutes Äthanol wird langsam zum Überstand gegeben bis die Äthanolkonzentration 70% ist. Die erhaltene Mischung wird während 30 Minuten bei 4°C gerührt und dann erneut während 15 Minuten bei 7000 xg und 4°C zentrifugiert. Das erhaltene Kügelchen wird resuspendiert in 500-700 ml von 0,05 M Trispuffer vom pH 7,4 enthaltend 1 mM Mercaptoäthanol und 0,05 M Natriumchlorid.

III. lonenaustauschchromatographie («Batch»-Methode)

Diäthylaminoäthyldextran-Anionenaustauschharz (DEAE

Sephadex A-50) äquilibriert mit 0,05 m Tris vom pH 7,4 enthaltend 0,05 M NaCl und 1 mM Mercaptoäthanol wird zum resuspendierten Kügelchen gemäss Teil II gegeben, worauf man während 30 Minuten bei 4°C rührt. Die Suspension wird durch Whatman Nr. 1 Filterpapier filtriert und mit Portionen von 0,05 M Trispuffer vom pH 7,4 enthaltend 1 mM Mercaptoäthanol gewaschen, bis das Filtrat nur noch vernachlässigbare CK-Aktivität aufweist. Das Filtrat wird dann bei 4°C unter Druck auf 300-500 ml unter Verwendung einer PM-10-Filtermembran konzentriert.

IV. Zweite Äthanolfällung

Kaltes absolutes Äthanol wird langsam zum konzentrierten Filtrat gemäss Teil III gegeben, bis eine 50%ige Konzentration erreicht ist. Das erhaltene Gemisch wird während 30 Minuten bei 4°C gerührt und dann bei 7000 xg zentrifugiert, wobei sich ein Kügelchen bildet. Der Überstand wird zurückbehalten und das Kügelchen wird verworfen. Kaltes absolutes Äthanol wird langsam zum Überstand gegeben, bis eine 70% ige Konzentration erreicht ist. Die erhaltene Mischung wird während 15 Minuten wieder bei 7000 xg zentrifugiert, worauf das erhaltene Kügelchen in einem minimalen Volumen von 0,05 M Tris vom pH 7,4 (z.B. 50-75 ml) gelöst wird. Das erhaltene Gemisch wird gegen 2000 ml 0,05 M Tris vom pH 7,4 bei 4°C dialysiert wobei der Puffer zweimal gewechselt wird. Ein leichter Niederschlag der sich bei der Dialyse in der Mischung gebildet hat wird nach Zentri-fugation entfernt und verworfen. Der Überstand wird in Teil V unten verwendet.

V. lonenaustauschchromatographie (Kolonne)

DEAE Sephadex A-50 wird mit 0,05 M Tris vom pH 7,4

äquilibriert und eine 2,6 X 60 cm Kolonne wird vorbereitet und extensiv mit diesem Puffer gewaschen. Der letzte Überstand gemäss Teil IV wird auf diese Kolonne gegeben und bei 4°C und einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/ Stunde eluiert. 10 ml Fraktionen werden gesammelt. Fraktionen werden auf CK-Aktivität und Proteingehalt analysiert. Die vereinigten Fraktionen enthaltend die Mehrheit des CK-MM-Isoenzyms werden gegen 0,05 M Tris vom pH 7,4 enthaltend 10 mM Äthylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) dialysiert. Die dialysierten Fraktionen werden bei 4°C unter Druck und unter Verwendung einer PM-10-Filtermembran zu einem geeigneten Konzentrat (z.B. 8-40 mg Protein/ml) konzentriert und bei 4°C in 0,05 M Trispuffer vom pH 7,5 enthaltend 10 mM EDTA gelagert. Ein leichter Niederschlag, welcher sich beim Stehenlassen bildet, wird durch Zentrifu-gation entfernt. Die Reinheit des CK-MM in dem gelagerten Material ist bezeichnenderweise 90-100%, wie dies durch Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wurde. Elektrophorese an Agarosegel wird verwendet um zu zeigen, dass MB und BB-Isoenzym im gelagerten Material nicht vorhanden sind. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist die endgültig gereinigte Probe von CK-MM.

Beispiel 2 Ziegen-anti-CK-MM-Serum:

Zur Herstellung des Immunogens zur Immunisierung der Ziegen wird das gereinigte CK-MM, welches gemäss Beispiel 1 erhalten wurde, mit 0,02 M Trispuffer vom pH 7,5 auf 4 mg/ml verdünnt und mit einem gleichen Volumen an Freund's kompletten Adjuvans (eine Mineralölsuspension enthaltend getötete M-Tuberculosis Bazillen). Das erhaltene Gemisch wird zu einer Wasser/Öl-Emulsion emulgiert. Ziegen wird wöchentlich eine Injektion von 1 ml dieses Immunogens subkutan in die Achselgegend an zwei Stellen injiziert, wobei bei jeder Seite 0,5 ml Immunogen verwendet wird. Den Ziegen wird alle zwei Wochen Blut entnommen, um das Ziegen-anti-CK-MM-Serum zu erhalten.

Beispiel 3 Aktivierung von Polyvinylidenfluorid

Um die Globulinfraktion von Esel-anti-Ziege-IgG-Serum an Polyvinylidenfluorid (PVF) zu kuppeln, wird das PVF vorgängig nach dem nachfolgenden Verfahren aktiviert:

1. 151 Tris-azid-Puffer wird durch Lösen von 36,3 g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Trizma-Base) und 15 g Natriumazid in ungefähr 14,000 ml deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur gelöst, wobei der pH mit 5 N Salzsäure auf 7,5 ± 0,1 gestellt wird. Die 5 N Salzsäure erhält man durch Verdünnen von 50 ml 38%iger Salzsäure mit 70 ml deionisiertem Wasser. Das Volumen der erhaltenen Lösung wird mit deionisiertem Wasser auf 15,000 ml eingestellt und bei Raumtemperatur gelagert.

2. 100 g Polyvinylidenfluoridpulver wird in einem geeigneten Gefäss mit 600 ml 2-Propanol gemischt. Die erhaltene Suspension wird in einem Homogenisator während 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit homogenisiert, die ausreicht, um eine feine Dispersion herzustellen, und liefert ein Gemisch, welches in einen geeichten 41-Zylinder übergeführt wird. Das Gemisch wird während 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. 3400 ml Salzwasser, welches durch Lösen von 28,9 g Natriumchlorid in 3400 ml deionisiertem Wasser erhalten wurde, werden zum Gemisch gegeben. Nach der Zugabe des Salzwassers wird das erhaltene Gemisch gut gemischt, worauf man es sich während 1 Stunde absetzen lässt oder solange, bis sich das Polyvinylidenfluorid auf ungefähr V5 des Gesamtvolumens abgesetzt hat. Der Überstand wird durch Absaugen entfernt und das Volumen wird mit deionisiertem Wasser wieder auf 4000 ml erhöht. Nach Absetzen des Polyvinylidenfluorids wird der Überstand erneut abgesaugt. Hierauf wird das Volumen erneut auf 4000 ml gebracht und das Polyvinylidenfluorid wird weitere drei Male in dieser Weise mit deionisiertem Wasser gewaschen. Anschliessend wird das Polyvinylidenfluorid noch zweimal in dieser Weise mit Tris-azid-Puffer von Stufe 1 gewaschen. Nach der letzten Waschimg wird das Volumen des Polyvinylidenfluorids auf 2000 ml gebracht, worauf die

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Suspension bei Raumtemperatur gelagert wird, bis sie für die Kupplung des Esel-anti-Ziege-IgG-Serums verwendet wird.

Beispiel- 4

Herstellung der Globulinfraktion von Esel-anti-Ziege-IgG--Serum

Die Globulinfraktion von Esel-anti-Ziege-IgG-Serum für die Kupplung an den aktivierten PVF gemäss Beispiel 3 wird unter Verwendung der folgenden Materialien und Verfahren erhalten:

Punkt Material Menge a) käuflich erhältliches Esel-anti-Ziegen-IgG-Serum 100 ml b) gesättigte Ammoniumsulfatlösung erhalten durch Zugabe von 500 g festem Ammoniumsulfat (Granulat) zu 500 ml deionisiertem Wasser und 1-stündiges heftiges Rühren bei Raumtemperatur, Lagern bei 4°C und Absetzen der Kristalle c) 0,02 M Tris-azid-Puffer pH 7,5

d) gesättigte Bariumchloridlösung hergestellt durch Zugabe von 50 g Bariumchlorid-2H20 (Granulat) zu 100 ml deionisiertem Wasser und 1-stündiges Rühren bei Raumtemperatur,

wobei man sich bildende Kristalle absetzen lässt. Man lagert bei Raumtemperatur

Verfahren:

1. 100 ml Esel-anti-Ziegen-IgG-Serum (Punkt a) werden bei 4°C in ein geeignetes Gefäss mit Magnetrührer gegeben. Darauf werden unter schwachem Rühren 60 ml gesättigtes Ammoniumsulfat (Punkt b) zugegeben um den Gefässinhalt zu einer 37,5%igen Sättigung zu bringen. Man rührt während 1 Stunde bei 4°C, worauf der ausgefallene Antikörper als Kügelchen durch Zentrifugation während 30 Minuten bei 4°C und 12,000 xg gesammelt wird. Das Kügelchen wird in ungefähr 70 ml Tris-azid-Puffer (Punkt c) gelöst, worauf das Volumen auf das Originalvolumen von 100 ml mit demselben Puffer gebracht wird. Hierauf werden unter leichtem Rühren bei 4°C 50 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung (Punkt b) gegeben um das erhaltene Gemisch auf eine 33%-ige Sättigung zu bringen. Das Gemisch wird während 1 Stunde bei 4°C gerührt. Der ausgefallene Antikörper wird nach 30minütiger Zentrifugation bei 12,000 xg und 4°C als Kügelchen erhalten. Das Kügelchen wird in ungefähr 40 ml Tris-azid-Puffer (Punkt c) gelöst und in einen Dialyseschlauch übergeführt. Man dialysiert gegen Tris-azid-Puffer bei 4°C. Der Puffer wird dreimal gewechselt (21 pro Wechsel) nach einem Minimum von 4 Stunden Dialyse jedes Mal. Die Gegenwart von Sulfationen wird durch Zugabe von 1 ml Dia-lysat zu 1 ml gesättigter Bariumchloridlösung festgestellt, wobei nach Rühren ein weisser Niederschlag die Gegenwart von Sulfat anzeigt. Falls irgendwelches Präzipitat beobachtet wird, wird das Dialysat mit frischem Puffer gewechselt und es wird solange dialysiert, bis der Sulfattest negativ ist. Das Volumen des Dialysates wird mit 100 ml Tris-azid-Puffer auf 100 ml gebracht und während 10 Minuten bei 2000 xg und 4°C zentrifugiert, worauf der Überstand gesammelt wird. Der Überstand enthaltend das hergestellte Esel-anti-Ziegen-IgG, wird bei 4°C gelagert, bis er zur Kupplung an den aktivierten Polyvinylidenfluorid gemäss Beispiel 3 gekuppelt 5 wird.

Beispiel 5

Kupplung der Globulinfraktion von Esel-anti-Ziegen-IgG an aktiviertes Polyvinylidenfluorid io Die Kupplung der Globulinfraktion des Esel-anti-Ziegen-IgG-Serums, hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 4, zu einer Suspension des aktivierten PVF hergestellt nach dem Verfahren gemäss Beispiel 3 wird unter Verwendung der nachfolgenden Reagenzien und Verfahren bewerkstelligt:

Punkt Reagenz Quantität

110 ml ungefähr 6 1

a) Aktiviertes Polyvinylidenfluorid

20 (Beispiel 3) 2000 ml b) Globulinfraktion von Esel-antiZiegen (IgG)-Serum (Beispiel 4) 100 ml c) Tris (hydroxymethyl)-amino-

25 methan (Trizma-Base) 24,2 g d) Dinatriumsalz der Äthylen-diamin-tetraessigsäure (EDTA) 147,2 g e) 10 N Natriumhydroxyd in

30 Wasser ungefähr 20 ml ungefähr 1 ml

Verfahren:

1. 101 Tris-EDTA-Puffer werden wie folgt hergestellt: 35 24,2 g Trizma-Base (Punkt c), 10,0 g Natriumazid und

147,4 EDTA (Punkt d) werden bei Raumtemperatur in ungefähr 9000 ml deionisiertem Wasser gelöst. Um eine komplette Lösung zu erreichen, kann es notwendig sein, während 30-60 Minuten zu rühren. Das pH der Lösung wird mit 40 10 N . NaDH auf 7,5 =h 0,1 gestellt, und die Lösung wird mit deionisiertem Wasser auf ein Volumen von 10,000 ml gebracht. Die Lösung wird bei Raumtemperatur gelagert.

2. 2000 ml einer Suspension enthaltend aktiviertes Polyvinylidenfluorid (Punkt a) wird in ein geeignetes Gefäss ge-

45 geben und leicht gerührt. 100 ml Esel-anti-Ziegen-Serum (Punkt b) wird zur Suspension gegeben, worauf man während 6 Stunden bei Raumtemperatur und über Nacht (12-18 Stunden) bei 4°C rührt. Man erhält Esel-anti-Ziegen-IgG-Antikörper gebunden an Polyvinylidenfluorid.

so 3. Der an das Polyvinylidenfluorid gekuppelte Antikörper gemäss Stufe 2 wird durch Zentrifugation bei 1500 xg während 10 Minuten als Kügelchen gesammelt. Der Überstand wird weggegossen, und das Kügelchen wird in einem Totalvolumen von 2000 ml Tris-EDTA-Puffer (wie in Stufe 55 1 hergestellt) resuspendiert.

4. Stufe 3 wird insgesamt dreimal wiederholt.

5. Das Kügelchen bzw. die Kügelchen, die nach Stufe 4 erhalten werden, werden bis zu einem Volumen von 500 ml im Tris-EDTA-Puffer (Stufe 1) resuspendiert, worauf in

60 dieser Suspension 2,5 g Rinderserumalbumin durch leichtes Rühren während 30 Minuten gelöst werden. Diese Suspension wird dann in einem Homogenisator während 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit homogenisiert, die eine feine Dispersion liefert und so als Produkt unlösliches Anti-Ziegen-65 IgG liefert.

6. Das unlösliche Anti-Ziegen-IgG-Produkt wird bei 4°C in der folgenden endgültigen Konzentration gelagert.

20% (W/V) Polyvinylidenfluorid

646997

8

0,02 g M Tris pH 7,5

0,1% (W/V) Natriumazid

0.5. (W/V) BSA

39,6 mM EDTA

Beispiel 6

Eine Bestimmung von CK-MB-Aktivität in einer biologischen Flüssigkeit wird durch die folgenden Verfahren bewerkstelligt, welche zwei Teströhrchen benötigen:

1. Zu Teströhrchen 1 wird gegeben: 200 jil Patientenserum und 250 p,l Ziegen-anti-CK-MM-Serum (wie in Beispiel 2 hergestellt), wobei das Gemisch leicht gerührt und dann während 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen wird, wobei man die in Stufe 3 zu verwendende Mischung erhält.

2. Zu Teströhrchen 2 wird gegeben: 200 [Al Patientenserum und 50 ^,1 Ziegen-anti-CK-MM-Serum (wie in Beispiel 2 hergestellt), wobei man leicht rührt und dann während

5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lässt. Hierauf gibt man 200 (il gelagertes unlösliches anti-Ziegen-IgG (hergestellt wie in Beispiel 5), wobei man leicht mischt und das Reaktionsgemisch während 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lässt. Das Röhrchen wird dann während 5 Minuten bei 1000 xg zentrifugiert und der erhaltene Überstand wird in Stufe 3 verwendet.

3. 100 [xl der resultierenden Mischung von Stufe 1 und 200 (il des Überstandes von Stufe 2 werden zu der ersten und zweiten Portion von 1,0 ml enzymatischem CK-Reagens (Beispiel 7) zur Messung der CK-Enzymaktivität gegeben. Nachher wird jede Portion gründlich gemischt und dann während 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Absorption wird für jede Portion bei 340 nm während einer Gesamtzeit von 5 Minuten in periodischen Intervallen in einem Spektro-photometer bei 37°C unter Verwendung von einer Küvette mit 1 cm Schichtdicke aufgezeichnet. Die aufgezeichneten Absorptionen werden in Absorptionswechsel pro Minute umgewandelt und die I.E./Liter an CK-Aktivität für jede Portion wird erhalten. Hierauf wird der Wert der CK-Aktivität s der zweiten Portion vom Wert der CK-Alctivität der ersten Portion subtrahiert.

Beispiel 7

Das enzymatische CK-Reagens von Beispiel 7 enthält die io folgenden Reagenzien:

Reagenzien

15

Creatinphosphat D-Glucose ADP AMP

NAD (Hefe)

MgCl2

Hexokinase (Hefe)

Glucose-6-phosphat-dehydro-genase (Leuconostoc)

3o Dithioerythritol

20

25

Konzentration in der Formulierung

17 mM 20 mM

1.2 mM 8 mM

2.3 mM 15 mM

2500 IE/Liter bei 30°C

2500 IE/Liter bei 30°C 60 mM

Die Reagenzien werden in Piperazin-N,N-bis (2-äthan-sulfonsäure)-puffer vom pH 5,8 ± 0,15 (30°C) formuliert.

v

Claims (3)

646997
1. (1) einem Antikörper inkubiert, der selektiv immunologisch die Creatinkinase-Isoenzyme enthaltend die M-Untereinheit in der zweiten Portion der Probe der biologischen Flüssigkeit bindet,

   1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Gegenwart der Creatinkinase-MB-Isoenzym-Form von Creatin-kinase, welche in biologischen Flüssigkeiten in einer Vielzahl von Isoenzymformen vorkommt, welche die Untereinheiten M oder B oder beide enthalten, dadurch gekennzeichnet,

   a) dass man in einem ersten Reaktionsgefäss eine erste von zwei Portionen einer Probe einer biologischen Flüssigkeit mit einem ersten Antikörper inkubiert, welcher selektiv immunologisch mit den Creatinkinase-Isoenzymen enthaltend die M-Untereinheit bindet und zwar durch selektive Immuninhibition der M-Untereinheit in der ersten Portion der Probe der biologischen Flüssigkeit und dass man darauf die Aktivität des B-Isoenzyms in der ersten Portion der Probe der biologischen Flüssigkeit quantitativ misst,

   b) dass man in einem separaten Reaktionsgefäss die zweite Portion der Probe der biologischen Flüssigkeit mit
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe der biologischen Flüssigkeit Blutserum ist.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Antikörper von Stufe a und der Antikörper der die Creatinkinase-Isoenzyme enthaltend die M-Unterein-heiten, von Stufe b bindet, Ziegen-anti-Creatinkinase-MM ist und dass der zweite Antikörper von Stufe b Esel-anti-Ziegen--IgG ist.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite fällende Antikörper an einen festen Träger gebunden ist.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger Polyvinylidenfluorid ist.

   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Aktivität des B-Isoenzyms durch eine photometrische Bestimmung ermittelt wird.

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die spektrophotometrische Bestimmung eine Enzym-Co-enzym- und Substratmischung umfasst.

   8. Diagnosetestkit zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Testkit folgendes enthält:.

   a) einen ersten Behälter enthaltend einen Antikörper, welcher fähig ist, selektiv immunologisch mit den Creatinkinase-Isoenzymen zu binden, die die Untereinheit M enthalten, und zwar durch selektive Immunoinhibition der M-Untereinheit,

   b) einen zweiten Behälter enthaltend einen fällenden zweiten Antikörper, welcher in der Lage ist, selektiv immunologisch mit dem Antikörper enthalten im ersten Behälter zu reagieren und c) ein Reagens von Enzym-Coenzym und Substrat, welches fähig ist, die enzymatische Aktivität der B-Untereinheit zu bestimmen.

   9. Testkit gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der fällende zweite Antikörper an einen festen Träger gebunden ist.

   10. Testkit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger Pollyvinylidenfluorid ist.

   Creatinkinase (CK) kommt in tierischen Körperflüssigkeiten und Gewebe in der Form von drei bekannten Isoenzymen vor, welche CK-BB, CK-MM und CK-MB bezeichnet werden. Jedes dieser drei Isoenzyme, nämlich CK-BB, CK-MM und CK-MB unterscheidet sich von den andern durch eine unterschiedliche Kombination der Untereinheiten, welche als M oder B bezeichnet werden. CK-BB hat zwei B-Untereinheiten, CK-MM hat zwei M-Untereinheiten und CK-MB hat eine M- und eine B-Untereinheit. Die Bestimmung der Anwesenheit von CK-MB in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere im Serum eines Patienten, hat sich bei der Diagnose von Herzinfarkt als sehr wertvoll erwiesen (Galen, RS., Human Path. 6, No. 2, 145-147, April 1975).

   Gängige immunologische Methoden zur Bestimmimg der Gegenwart von CK-MB sowie die Nachteile dieser Methoden wurden kürzlich beschrieben (Current Problems in Cardio-logy, Vol. III, No. 12, März 1979, p. 7-28). Diese Methoden waren nicht sehr befriedigend im Lösen der Schwierigkeit von störender CK-MM und CK-BB in der Unterscheidung und Bestimmung von CK-MB gegenüber CK-MM und CK-BB.

   Ein immunologisches Verfahren zur Bestimmung der CK-MB-Aktivität in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit wurde in den US-Patenten Nos. 4 067 775 und 4 237 044 beschrieben. Nach dem Verfahren dieser Patente wird ein Antikörper verwendet, welcher durch ein aktiviertes CK-MM-Antigen hergestellt wurde. Bei diesem Verfahren ist es notwendig, dass die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe kein CK-BB-Isoenzym enthält. Im speziellen wird im US-Patent No. 4 067 775 in Kolonne 3, Zeilen 38-40 erwähnt, dass CK-BB das Verfahren der vorliegenden Erfindung störe und deshalb in der zu testenden biologischen Flüssigkeit nicht enthalten sein dürfte. Da biologische Flüssigkeiten CK-BB enthalten, könnte die Bestimmung gemäss diesen Patenten zeitaufwendige und schwierige Verfahren notwendig machen, um erst alles CK-BB aus der Flüssigkeit zu entfernen. Für den Fall, dass CK-BB in der flüssigen Probe vorhanden ist, würden bei Verwendung dieser Bestimmungsmethode falsch positive Ergebnisse resultieren. Das heisst also, dass dieses Verfahren zur Bestimmung von CK-MB in Flüssigkeiten, die CK-BB enthalten, nicht verwendet werden kann.

   Wreton und Pfleiderer, Clinica Chimica Acta 58, 223-232 (1975) beschreiben ein System für einen Immunoassay, bei dem CK-MM und CK-BB durch Imunoinhibition und Immuntitration bestimmt werden. Diese Bestimmungen erfordern die Quantifizierungen von Werten, die durch Vergleich der erhaltenen Restisoenzymaktivität mit der Gesamtisoenzymaktivität der Probe erhalten wurden. Eine Immun-inhibitionsbestimmung für die CK-Isoenzyme ist eine solche, bei der die enzymatischen. Aktivitäten der CK-Isoenzyme in der Testflüssigkeit unterschiedlich-inhibiert oder inaktiviert werden und zwar durch immunologische Inhibierung oder durch inaktivierende Antikörper, bei denen die Homogenität der Probe erhalten bleibt. Das Wreton und Pfleiderer-Verfahren erfordert eine Vielzahl von Bestimmungen (mindestens vier) um zu den Werten zu gelangen, die zur Bestimmung der CK-Isoenzymaktivitäten erforderlich sind.

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   (2) einen fällenden zweiten Antikörper zugibt, welcher selektiv immunologisch mit dem Antikörper bindet, der die Creatinkinase-Isoenzyme enthaltend die M-Untereinheit bindet, um ein Reaktionsprodukt in Form eines Niederschlages in dieser zweiten Portion zu erhalten bestehend aus diesem zweiten Antikörper mit diesem andern Antikörper und diesen Creatinkinase-Isoenzymen enthaltend die M-Untereinheit und dass man darauf die Aktivität des B-Isoenzyms im Überstand in dieser zweiten Portion quantitativ misst und c) dass man die CK-MB-Aktivität in dieser Probe aus den Messergebnissen erhalten von der ersten und der zweiten Portion bestimmt.

   2

   PATENTANSPRÜCHE
3. 3

   646997

   Dies bedeutet vier Fehlerquellen und eine gleiche Anzahl von zeitaufwendigen Verfahren.

   Bei einem von Wursburg et al. in J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15, 131-137 (1977) beschriebenen Verfahren werden zur Differenzierung der CK-Isoenzyme nach einem Schema fällende Antikörper verwendet, welche Messungen von vier verschiedenen Bestimmungen notwendig machen. Diese Bestimmung erfordert die Messung der Gesamt-CK-Aktivität in der Testprobe und der Restaktivität nach Zugabe von fällenden Anti-CK-BB und fällenden Anti-CK-MM-Antikörpern, wobei diese fällenden Antikörper in verschiedenen Reaktionsgefässen zugegeben werden. Nach diesen Verfahren ist die Homogenität der Probe durch die fällenden Antikörper nicht gewährleistet. Wie beim Wreton-Pfleiderer-Verfahren erfordert dieses Verfahren arbeits- und zeitaufwendig Mehrfachbestimmungen mit entsprechend hohen Fehlerquellen.