NL8200587A

NL8200587A - Werkwijze voor een immunochemische enzymbepaling.

Info

Publication number: NL8200587A
Application number: NL8200587A
Authority: NL
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1981-02-17
Filing date: 1982-02-16
Publication date: 1982-09-16
Also published as: ES509631A0; JPS57152900A; DE3205301C2; US4387160A; SE453614B; AU554364B2; FR2500009B1; DK163688B; CA1176561A; IT1157304B; GB2093182A; NO159619B; AU7974082A; FR2500009A1; GB2093182B; SE8200897L; DK67882A; DE3205301A1; NO820477L; BE892152A

Description

♦ * t 4.

- 1 - H.0. 30 805

Werkwijze voor een imaiunochemische enzymbepaling.

Creatinekinase (CK) komt in dierlijke lichaamsvloeistoffen en weefsels voor in de vorm van drie "bekende isoenzymen, die met CK-BB, CK-MM en CK-MB aangeduid worden. Elk van deze drie isoenzymen, te weten CK-BB, CK-MM en CK-MB onderscheidt zich van de andere door een 5 verschillende combinatie van de sub-eenheden, die als M of B worden aangeduid. CK-BB heeft twee B-subeenheden, CK-MM heeft twee M-sub-eenheden en CK-MB heeft een M- en een B-subeenheid. De bepaling van de aanwezigheid van CK-MB in biologische vloeistoffen, in het bijzonder in het serum van een .patiënt, is bij de diagnose van hart-1Q infarct zeer waardevol gebleken (Galen, BS., Human Path. 6, Ho. 2, I April 1975, 145-147).

V

Gangbare immunologische methoden voor de bepaling van de tegen- • waarde van CK-MB, alsmede de nadelen van deze methoden werden on- * langs beschreven (Current Problems in Cardiology, Vol. Ill, Ho. 12, 15 maart 1979, biz. 7-28). Deze methoden waren niet erg bevredigend bij het oplossen van de moeilijkheid van storend CK-MM en CK-BB in het onderscheid en de bepaling van CK-MB ten opzichte van CK-MM en CK-BB.

Een immunologische methode voor de bepaling van de CK-MB-acti-20 viteit in een monster van een biologische vloeistof werd in de Amerikaanse octrooischriften 4.067*775 ®n 4*237*044 beschreven.

Volgens de werkwijze van de octrooischriften wordt een antilichaam toegepast, dat door een geactiveerd CK-MM-antigeen bereid werd. Bij deze werkwijze is het noodzakelijk, dat het te onderzoeken vloei-25 stofmonster geen CK-BB-isoenzym bevat. In het bijzonder wordt in het Amerikaanse octrooischrift 4*067»775 in kolom 3, regels 38-40 vermeld, dat CK-BB de werkwijze van de onderhavige uitvinding zou storen en derhalve in de te onderzoeken bilologische vloeistof niet aanwezig zou mogen zijn. Omdat biologische vloeistoffen CK-BB bevatten, 30 zou bepaling volgens deze octrooischriften langdurige en moeilijke werkwijzen noodzakelijk kunnen maken, om eerst alle CK-BB uit de vloeistof te verwijderen.. In het geval dat CK-BB in het vloeibare monster aanwezig is, zullen bij toepassing van deze bepalingsmethode verkeerd positieve resultaten verkregen worden. Dat wil dus zeggen, 35 dat deze werkwijze voor de bepaling van CK-MB in vloeistoffen, die CK-BB bevatten, niet kan worden toegepast.

8200587 φ * - 2 - \

Wreton und Pfleiderer, Clin'ica Chimica Acta 58, (1975) 225-252 beschrijven een systeem voor een immunóbepaling, waarbij CE-MM en · CE-BB door immunoremming en immunotitratie bepaald worden. Deze bepalingen vereisen de kwantificeringen van waarden, die door ver-5 gelijking van de verkregen restisoenzymactiviteit met de totale isoenzymactiviteit van het monster verkregen werden. Een immuno-remmingsbepaling voor de. CE-isoenzymen is een bepaling, waarbij de enzymatische activiteiten van de CE-isoenzymen in de te onderzoeken vloeistof verschillend geremd of geinaotiveerd worden en wel door 10 immunologische remming of door inactiverende antilichamen, waarbij de homogeniteit van het monster behouden blijft. De Wreton en Pfleidererwerkwijze vereist een veelvoud bepalingen (ten minste vier) om tot de waarden te komen, die voor de bepaling van de CE-isoenzym-activiteiten vereist zijn. Dit betekent vier bronnen van fouten en 15 een even groot aantal langdurige werkwijzen.

Bij een door Wursburg o.s. in J.Clin. Chem. Clin. Biochem.

15, (1977·) 131-157 beschreven werkwijze worden voor het onderscheid van de CE-enzymen volgens een schema verkregen antilichamen toegepast, die metingen van vier verschillende bepalingen noodzakelijk 20 maakt. Deze bepaling vereist de meting van de totale CE-activiteit in het proefmonster en de restactiviteit na toevoeging van precipiterende anti-CE-BB en precipiterende anti-CE-MM-antilichamen, waarbij deze precipiterende antilichamen aan verschillende reactie reservoirs worden toegevoegd. Volgens deze werkwijzen is de homo-25 geniteit van het monster door de precipiterende antilichamen niet gewaarborgd. Zoals bij de Wreton-Pfleidererwerkwijze vereist deze werkwijze arbeidsintensieve en langdurige meervoudige bepalingen met dienovereenkomstig grote . bronnen van fouten.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze 50 en een diagnostische proefuitrusting voor de kwantitatieve bepaling van het CE-MB-isoenzym, een vorm van het creatinekinase, dat in een monster van een biologische vloeistof in een veelvoud van isoenzymen, die de M- of B-subeenheden of beide bevatten, voorkomt.

In het kader van de onderhavige uitvinding werd gevonden, dat 55 men snel, rendabel en nauwkeurig het gehalte aan CE-MB zelfs in vloeistoffen, die CE-BB bevatten, kan bepalen,· wanneer de biologische vloeistof volgens de volgende werkwijze bepaald wordt: (a) incuberen in een eerste reactiereservoir van een eerste van twee monsters van een biologische vloeistof met een eerste anti-40 lichaam, dat selectief de creatinekinase-isoenzymen immunologisch 8200587

V

- 3 - remt, die M-subeenheid bevatten en wel door selectieve immunoremming van de M-stibeenheid in het eerste monster voor de remming van de enzymatische activiteit van alleen de M-subeenheid van creatinekinase-isoenzymen en hierna kwantitatief de activiteit van de 5 B-subeenheid in het eerste monster meet: (b) Incuberen in een gescheiden reaciiereservoir van het tweede deel van het biologische vloeistofmonster met (l) een antilichaam, dat selectief immunologisch de creatinekinase-i so enzymen bindt, die de M-subeenheid bevatten en (2) een precipiterend tweede antilichaam, 10 dat selectief immunologisch met dat antilichaam bindt, dat de creatinekinase-isoenzymen bindt,die M-subeenheid bevatten en een reactieprodukt van dit tweede antilichaam met het andere antilichaam en de creatinekinase-isoenzymen, die de M-subeenheid bevatten, in de vorm van een precipitaat in het tweede deel vormt en daarna 15 kwantitatief de activiteit van de B-isoenzymen in het bovenstaande gedeelte van het tweede deel meet. en (c) bepaling van de CK-MB-activiteit in de biologische vloeistof uit de metingen verkregen van het eerste en het tweede deel.

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding vereist geen 20 veelvoud van bepalingen en berekeningen, die tot twijfelachtige en minder nauwkeurige resultaten zou leiden.

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is waardevol bij de diagnose van hartinfarcten.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijs 25 voor de kwantitatieve bepaling van CE-MB in elke biologische vloeistof. Yolgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding kan CE-MB onder toepassing van. twee gedeelten van een enkel monster van een biologische vloeistof bepaald worden, die twee waarden voor de activiteit van de B-subeenheid in elk van deze delen levert. Uit 50 deze activiteiten kan de activiteit van het CE-MB bepaald worden.

Yolgens de werkwijze van de uitvinding is het mogelijk biologische vloeistoffen zoals bloed, plasma, serum, lymfvloeistof, gal, urine, rugge>*mergvloeistof, speeksel, transpiratievocht en dergelijke of ook wel faeces·· van mensen of dieren toe te passen.

55 Het is echter ook mogelijk vloeibare preparaten van menselijke of dierlijke weefsels, zoals spierweefsel, hartweefsel, nierweefsel, longweefsel, hersenweefsel, ruggemergweefsel, huidweefsel en derge-r lijke toe te passen. De biologische vloeistof, die voor de werkwijze volgens de uitvinding de voorkeur verdient is echter menselijk 40 serum. In de meeste gevallen behoeft het serum voor de werkwijze 8200587 - 4 - . * volgens de uitvinding niet verdund te worden, maar kan voor het bereiken van betere resultaten verdund worden, wanneer het gehalte aan CE ongebruikelijk hoog is, zoals dit in sera van patiënten het geval is, die aan een acuut hartinfarct lijden.

5 In het bijzonder heeft de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding betrekking op de bepaling van de enzymatische activiteit van het CK-MB-enzym in een monster in een biologische vloeistof, die CE-MB, CE-MM en CE-BB kan bevatten. Be werkwijze wordt uitgevoerd door (a) incubatie van een eerste van twee delen van het mon-10 ster van de bidogische vloeistof in een eerste reactiereservoir met een eerste antilichaam, dat selectief immunologisch met de oreatine-kinase-isoenzymen bindt, die de M-subeenheid bevatten, en wel door selectieve irnmunoremming van de M-subeenheid in het eerste deel voor de remming van de enzymatische activiteit van slechts 'de M-subeenheid 15 van de creatinekinase-isoenzymen en vervolgens door kwantitatieve meting van de activiteit van de B-subeenheid in dit eerste deel van het monster van de biologische vloeistof, (b) incubatie van het tweede deel van het monster van deze biologische vloeistof in een gescheiden tweede reactiereservoir met (a) een antilichaam, dat se-20 lectief met de creatinekinase-isoenzymen, die de M-subeenheid bevatten, bindt en (2) een precipiterend tweede antilichaam, dat immunologisch met het antilichaam bindt, dat het creatinekinase-isoenzym ; bevat, dat M-subeenheden bevat en een reactieprodukt vormt tussen het tweede antilichaam en het antilichaam en de creatinekinase-iso-25 enzymen, die de M-subeenheid bevatten, als neerslag in dit tweede deel en vervolgens kwantitatief de activiteit van het B-isoenzym in de bovenstaande laag van dit tweede deel meet en (c) de CE-MB-activiteit in het monster van de biologische vloeistof uit de metingen van het eerste en tweede deel bepaalt.

50 Bij de werkwijze van de onderhavige uitvinding worden twee immunologische reacties toegepast, die in verschillende reactie-reservoirs worden uitgevoerd. Men verkrijgt van elk van deze twee reacties een meting van de enzymatische activiteit van de vloeistof in het reactiereservoir. Elke reactie kan gelijktijdig worden uitge-55 voerd, evenwel kunnen de bepalingen ook op verschillende tijdstippen plaats hebben. Het is echter voordelig wanneer de reacties gelijktijdig worden uitgevoerd. Het is niet noodzakelijk dat de reactie-reservoirs gelijke delen van het monster bevatten, evenwel verdienen gelijke delen voor een eenvoudige bepaling de voorkeur. Toor de be-40 paling en het verschil van de enzymatische activiteit van CE-MB in 8200587 » % - 5 - het vloeibare monster dient men slechts door een in de vakwereld bekende en door de vakwereld aanvaarde methode de waarden van de enzymatische activiteit van de beide afzonderlijke reacties te kwalificeren. Voor het geval dat de reactiereservoirs gelijke 5 delen aan monster bevatten, behoeft men slechts de enzymatische activiteit die men in het tweede reactiereservoir verkregen heeft, van de enzymatische activiteit, die men in het eerste reactiereservoir verkregen heeft, af te trekken. Wanneer ongelijke delen worden toegepast, dient men eerst door een gebruikelijke methode het ver-schil in de enzymeoneentraties te corrigeren, voordat men de door de twee reactiereservoirs verkregen waarden van elkaar aftrekt.

Het volgens de werkwijze van de uitvinding toegepaste reactiereservoir kan elk in de techniek bekend reactiereservoir zijn, dat voor de uitvoering van immunologische bepaling geschikt is. Tot ^5 de toepasbare reactiereservoirs voor de uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding behoren proefbuisjes uit glas, kunststof of metaal. Het geschikte reactiereservoir is een proefbuisje uit glas..

De uitvinding heeft ook betrekking op een diagnose uitrusting voor de kwantitatieve bepaling van de aanwezigheid van het CK-MB-20 isoenzym van creatinekinase, dat in een biologische vloeistof in een veelvoud van isoenzymvormen, die de subeenheid Μ, B of beide bevatten, voorkomt. De bestanddelen van de diagnose uitrusting zijn: (a) een eerste houder, die een antilichaam bevat, dat in staat is selectief immunologisch met de creatinekinase-isoenzymen te binden, 25 die de M-subeenheid bevatten en wel door selectieve immunoremming van de M-subeenheid, (b) een tweede houder die een precipiterend tweede antilichaam bevat, dat in staat is selectief immunologisch met het antilichaam volgens de eerste houder te reageren en (c) een reagens van enzym-eoenzym en substraat, dat in staat is de 50 enzymatische activiteit van de B-subeenheid te bepalen.

Wanneer alle componenten van de diagnose uitrusting in overeenstemming met de werkwijze van de onderhavige uitvinding toegepast worden, is de vakman in staat de enzymatische activiteit van CK-MB in een monster van een biologische vloeistof, die CK-MB, CK-MM en 55 CK-BB bevat, te bepalen. De proefuitrusting is geschikt voor klinieken, hospitalen, laboratoria en afzonderlijke artsen, die de bepaling en onderkenning van CK-MB in vloeistoffen nodig hebben.

Volgens de onderhavige uitvinding kan als eerste antilichaam elk antilichaam worden toegepast, dat selectief de M-subeenheid van 40 CK immunologisch remt, zonder de B-subeenheid wezenlijk immunologisch 8200587 « · - 6 - te remmen. Deze antilichamen kunnen op gebruikelijke wijze bereid worden, doordat men bij een dier gezuiverd CK-MM-antigeen injecteert en door bloedafname het serum, dat de antilichaam bevat, wint. Elke in de techniek bekende methode kan voor de zuivering van het CK-MM-5 antigeen worden toegepast en elke bekende wijze voor de injectie van dit antigeen in dieren kan worden toegepast om geschikte anti-lichamen te verkrijgen. Tot de antilichamen, die volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden toegepast, behoren die volgens het Amerikaanse octrooischrift 4·237·044> die in een dier door CK-MM-10 antigeen worden voortgebracht, dat voor de injectie door een acti-veringsmiddel, zoals mercaptoethanol, geactiveerd werd, evenwel ook die, die door een CK-MM-antigeen worden voortgebracht, dat voor de injectie niet geactiveerd werd, zoals die, die bij de hiervoor vermelde immunoremmingsbepaling van Wreton en Pfleiderer worden toege-15 past. Hoewel door de toediening van het eerste antilichaam bij de werkwijze van de onderhavige uitvinding precipitatie kan ontstaan, sedimenteert dit precipitaat niet, maar blijft gedurende de gehele werkwijze homogeen.

Het eerste antilichaam kan in elke diersoort worden voortge-20 bracht. De diersoort omvat in het bijzonder werveldieren, zoals varken, rundvee, hond, ezel, paard, geit, konij'n, rat en dergelijke. Onder deze dieren verdienen zoogdieren zoals ezel, schaap en geit de voorkeur. Het dier dat de voorkeur verdient is de geit.

Yolgens een eerste aspect van de uitvinding, dat de voorkeur 25 verdient, wordt het eerste antilichaam door immuniseren van geiten, een eerste diersoort, met een gezuiverd CK-MM-antigeen voortgebracht, waarbij men door gebruikelijke immunologische technieken geiten-anti-CK-MM-antilichaam verkrijgt. Yoor toepassing bij de werkwijze volgens de uitvinding moet het eerste antilichaam instaat 50 zijn de M-subeenheid van CK selectief te remmen en wel door immuno-remming. Onder immunoremming wordt verstaan, dat het eerste antilichaam de M-subeenheid immunologisch remt zonder de B-subeenheid wezenlijk te remmen en dat deze remming van de M-subeenheid in het monsterdeel onder het aanhouden van de homogeniteit van het monster 35 plaats heeft.

Het eerste antilichaam wordt met het eerste en tweede deel, bij voorkeur gelijke delen van het proefmonster, in het reactiereser-voir geïncubeerd en bij voorkeur gemengd.

Als resultaat bindt het eerste antilichaam immunologisch aan 40 elk CK-MB en CK-MM van elk deel van het monster en geeft immunorem- 8200587 - 7 - ming van CE-MB en CK-MM zonder de B-subeenheid wezenlijk te beïnvloeden. Ir dient op gelet te worden, dat het wezenlijke punt van het eerste antilichaam voor het tweede deel alleen daarin bestaat het CE-MB en CE-MM immunologisch te binden zonder wezenlijk CE-BB 5 te binden. Het is niet wezenlijk of noodzakelijk, dat het eerste antilichaam immunoremming in het tweede deel van het monster bewerkstelligt. Daaruit volgt, dat het eerste antilichaam in het tweede deel van het monster door een verschillend antilichaam vervangen kan worden, dat in een ander dier als het dier voor het voortbrengen 10 van het eerste antilichaam onder toepassing van gezuiverd CE-MM-antigeen werd voortgebracht. In feite kan als eerste antilichaam in het tweede deel van het monster elk antilichaam worden toegepast,, dat selectief het creatinekinase, dat de M-subeenheid bevat, bindt zonder wezenlijk de B-subeenheid te remmen.

15 De temperatuur en de tijd van de incubatie van elk deel van het proefmonster na de toevoeging van het antilichaam is niet kritisch en de incubatie kan bij elke temperatuur en gedurende elke tijd worden uitgevoerd, die bij de enzymimmunowerkwijze gebruikelijk en geschikt zijn. Bij voorkeur worden de incubaties bij kamertemperatuur 20 en gedurende 5 tot 60 min. uitgevoerd.

Volgens de onderhavige uitvinding wordt de meting van het eerste deel op enzymatische activiteit na de incubatie van dit eerste monster met het eerste antilichaam uitgevoerd, terwijl de homogeniteit van het monster behouden blijft. Volgens deze wijze 25 van meting kan de B-subeenheid van CE-MB en CE-BB bepaald worden.

De hoeveelheid aan eerste antilichaam in het tweede deel van het monster dient voldoende te zijn praktisch alle CE-MB en CE-MM-enzymen van dit deel te binden. Om de beste resultaten te verkrijgen wordt het eerste antilichaam aan elk deel van het monster in een 30 hoeveelheid toegevoegd, die in overmaat is ten opzichte van de hoeveelheid, die gewoonlijk vereist is om alle CE-MB en CE-MM te binden.De bepaling van de hoeveelheid aan eerste antilichaam,die voor elk monster noodzakelijk is, kan volgens gebruikelijke methode plaats hebben.

35 Aan het tweede deel van het proefmonster in het tweede reactie- reservoir wordt na toevoeging van een ander antilichaam, namelijk hetzij het eerste antilichaam hetzij een vervangend antilichaam. een precipiterend tweede antilichaam toegevoegd. De tijd voor de toevoeging van dit tweede antilichaam na de toevoeging van het eer-40 antilichaam is niet kritisch, waarbij echter ongeveer 5 min. de 8200587 « * - 8 - voorkeur verdienen. Indien gewenst kunnen langere tijdsintervallen toegepast worden. Volgens de onderhavige uitvinding kan als tweede precipiterend antilichaam elk antilichaam worden toegepast, dat selectief aan het eerste antilichaam bindt, en dit neerslaat en dat 5 praktisch vrij is van immunologische activiteit ten opzichte van de B-subeenheid van creatinekinase.

Het tweede antilichaam kan volgens een gebruikelijke techniek in een diersoort worden opgewekt, die verschillend is van de diersoort waarin het eerste antilichaam werd gevormd. Gewoonlijk wordt 10 het tweede antilichaam volgens gebruikelijke immunologische technieken door immuniseren van ezels met gammaglobuline van geiten (I«G) en winning van het ezel-antigeiten-IgG geproduceerd. Het tweede antilichaam, dat op deze wijze verkregen werd, is instaat elk .geiten-IgG te binden, dus ook geiten-anti-CK-MM, het eerste anti-15 lichaam dat de voorkeur verdient. Het tweede antilichaam wordt bij voorkeur aan een vaste drager gebonden. De vaste drager, die het tweede antilichaam bevat, wordt met het tweede deel van het proefmonster in het tweede reactiereservoir, bij voorkeur na ongeveer 5 min. mengen bij kamertemperatuur geïncubeerd. Als gevolg bindt nu 20 het tweede antilichaam immunologisch aan het andere antilichaam in het tweede deel van het monster. Dit geeft een immunoprecipitaat, dat CK-MB-eerste antilichaam/tweede antilichaam, CK-MM-eerste antilichaam/tweede antilichaam en eerste antilichaam/tweede antilichaam bevat. De hoeveelheid tweede antilichaam komt overeen met de hoe-25 veelheid die voldoende is om alle eerste antilichaam de binden. Volgens een aspect van de onderhavige uitvinding, dat bijzonder de voorkeur verdient, wordt het tweede antilichaam gewoonlijk in een hoeveelheid toegevoerd, die boven de hoeveelheid ligt die noodzakelijk is om alle eerste antlichaam te binden.

50 Volgens de onderhavige uitvinding wordt het precipitaat, dat na toevoeging van het tweede antlichaam ontstaat, van het tweede deel van het monster volgens een gebruikelijke techniek gescheiden. De verkregen bovenstaande laag wordt op enzymatische activiteit gemeten. Volgens de onderhavige uitvinding.is het de bovenstaande 55 laag, die op enzymatische activiteit wordt gemeten.

Tot de gebruikelijke methoden voor de afscheiding van het precipitaat van dit tweede deel behoren gebruikelijke filtratie-chromatografiemethoden. De methode die voor de afscheiding van het precipitaat uit dit tweede deel het meest de voorkeur verdient is 40 de centrifugering gevolgt door dekanteren van· de bovenstaande laag 8200587 Γ» «, - 9 - en het meten van de gedekanteerde vloeistof.

De bovenstaande laag van dit tweede deel wordt vervolgens op gebruikelijke wijze gemeten om de activiteit van het CK-BB-isoenzym in deze bovenstaande laag te bepalen.

5 De meting of bepaling van de activiteit van.CK-MB en/of CK-BB

in elk reactiedeel van het proefmonster kan volgens op zichzelf bekende methoden worden uitgevoerd. Deze methoden omvatten kolori-metrische methoden, bijvoorbeeld die volgens "Methoden der enzy-matischen Analyse" uitgegeven door H.U, Bergmeyer, derde druk 10 1974» deel 1, blz. 145 en volgende. Eveneens daartoe behoort de fluorimetrische bepaling van CK-BB. Creatine wordt uit creatine-fosfaat door CK vrijgemaakt en dit creatine kan door reactie met ninhydrine in sterk alkalische oplossing fluorimetrisch gemeten worden (S.B. Conn, Clin. Chem., deel 6, blz. 557 eu volgende i960)· 15 Yoor dit doel de voorkeur verdienen kinetische methoden, vol gens welke de enzymatische activiteit door meting in W, bijvoorbeeld bij 354> 340 of 366 nm bepaald wordt. De voorkeur verdient een standaardmethode, waarbij CK onder toepassing van creatinefos-faat en adenosinefosfaat bepaald wordt: Z. Klin. Chem. Klin.

20 Bi o chem., 8., bladzijde 658 en volgende (1970) en 1!0, blz. 182 (1972). Proefuitrustingen voor de bepaling van de CK-activiteit volgens déze methode zijn te koop.

Yolgens de methode, die de voorkeur verdient, wordt de enzymatische activiteit van CK-MB en/of CK-BB na toevoeging van ge-25 schikte enzymen, coenzymen en substraten gemeten, waarbij CK-BB de omkeerbare overgang van een fosfaatgroep van creatinefosfaat naar adenosinedifosfaat katalytisch bevorderd en waarbij de hoeveelheid van het verkregen adenosinetrifosfaat onder toepassing van gekoppelde en door hexokinase en glucose-6-fosfaat-dehydrogenaat gekatalyseerde 30 reacties gemeten wordt. De activiteit van dit laatste enzym bij de reduktie van nikotineamide-adenine-dinucleotide wordt spektrofoto-metrisch gevolgd door de meting van de absorptietoename bij 34° nm, waarbij de mate in de verandering van de absorptietoename direkt evenredig is met de activiteit van het CK-MB en/of CK-BB in elk 35 gegeven deel van het proefmonster.

Het isoenzym CK-MM, dat als antigeen voor het vóórtbrengen van het eerste antilichaam wordt toegepast, kan uit elke geschikte biologische vloeistof zoals bloed, serum of uit biologische organen of weefsels, zoals hartspierweefsel, skeletspierweefsel, beenmerg of 40 een willekeurig geschikt orgaanweefsel verkregen worden, waarvan 8200587 - 10 - bekend is, dat het dit isoenzym bevat. De bron voor dit isoenzym, dat de voorkeur verdient is dierlijk skeletspierweefsel.

De zuivering van het hiervoor vermelde isoenzym tot een zeer grote mate van zuiverheid, voordat het voor het voortbrengen van 5 het antilichaam wordt toegepast, is zeer aan te bevelen om de aanwezigheid van niet specifiek antilichaam te verminderen. Het isoenzym kan volgens elke gebruikelijke zuiveringsmethode gezuiverd worden. De zuiveringsmethoden, die de voorkeur verdienen, zijn eveneens van gebruikelijk type, namelijk fractionering met alkohol 10 en anionenuitwisselingschromatografie.

De zuiverheidsgraad van het isoenzym, alsmede de specifiteit van het verkregen antilichaam kunnen volgens gebruikelijk methoden bepaald worden, zoals door immunodiffusie of door elektroforetische technieken. De methode, die voor de bepaling van de zuiverheid van 15 het isoenzym de voorkeur verdient, is de acrylamidegelelektroforese.

Het tweede antilichaam kan door het aanbrengen op een niet oplosbaar dragermateriaal onoplosbaar gemaakt worden. Geschikte vaste dragermaterialen omvatten in water onoplosbare organische polymeren, zoals cellulose of andere polysacchariden, een vinyl-20 additie- of condensatiepolymeer of een in water onoplosbare anorganische stof met polymeerkarakter, zoals glas of polysiloxan— · rubber. Anderzijds kan het tweede antilichaam op het oppervlak: van een vaste drager, zoals polystyreen, polypropeen, polyfluoretheen of polyvinylideenfluoride geabsorbeerd worden. De methode voor het 25 aanhechten van het tweede antilichaam aan de vaste drager is niet kritisch en kan (1) covalent koppelen van het oplosbare tweede antilichaam aan een onoplosbaar polymeer, zoals bijvoorbeeld door reactie met een onoplosbaar makend middel, (2) fysisch inwikkelen van de deeltjes van het tweede antilichaam in de poriën van een 50 gelpolymeer, zoals een dwars verknoopt polyacrylamide of (5) fysische adsorptie aan een onoplosbare polymerestof omvatten. Voor zover een vaste drager wordt toegepast, is de wijze, die de voorkeur verdient, die wijze, dat het tweede antilichaam door adsorptie aan geactiveerd'pdlyvinylideenfluoride (Kynar) wordt aangehecht, 55 waarbij voor de vakman bekende methoden worden toegepast, zoals bijvoorbeeld de methode die in het Amerikaanse octrooischrift 5.843*443 beschreven is.

De volgende voorbeelden lichten de onderhavige uitvinding verder toe, maar zijn niet bestemd om de uitvinding in omvang of 40 geest te beperken.

8200587 - 11 -

Voorbeeld 1.

CE-MM-zuivering.

I. Homogeen’picdukt.

Ongeveer 1000 g menselijk skeletspierweefsel of hersenweefsel 5 wordt bij 4°C ontdooid. Overmaat vet wordt van het weefsel afgescheiden, dat vervolgens in kleine stukken (1 cm) _ gesneden wordt. De weefselstukken worden vervolgens in een menger met 1000-1500 ml koude (4°C) 0,05 molaire'(hydroxymethyl) aminomethaan [tris-buffer], die 1 mmol mecaptoethanol bevat met een pH van 7»4 gehomogeniseerd. 10 Eet verkegen homogene produkt wordt vervolgens bij 50.000 xg gedurende 20 min. bij 4°C gecentrifugeerd en geeft als neerslag een kogeltje. De verkregen bovenstaande vloeistof wordt door een gesinterde glastrechter gefiltreerd en achtergehouden, let kogeltje wordt weer aan de menger toegevoegd en met 500-700 ml tris-buffer 15 opnieuwe gehomogeniseerd, bij 50.000 xg gecentrifugeerd, waarna de bovenstaande vloeistof met de eerste bovenstaande vloeistof na filtreren wordt samengevoegd. De samengevoegde bovenstaande lagen worden in deel II toegepast.

II. Precipitatie met ethanol.

20 Eoude (4°C) absolute ethanol wordt aan de verenigde bovenstaan de lagen volgens deel I toegevoegd tot een eindconcentratie van 50 vol.% bereikt wordt, waarna men gedurende 50 min. bij 4°C roert. Het verkrgen mengsel wordt vervolgens gedurende 15 min. bij 4°C en 70.000 xg gecentrifugeerd. De verkregen bovenstaande laag wordt 25 achtergehouden en het neergeslagen kogeltje wordt verwijderd.

Eoude (4°C) absolute ethanol wordt langzaam aan de bovenstaande laag toegevoegd tot de ë;hanol concentratie 70% is. Het verkregen mengsel wordt gedurende 50 min. bij 4°C geroerd en daarna opnieuw gedurende 15 min. bij 7000 xg en 4°C gecentrifugeerd. Het verkregen 30 kogeltje wordt opnieuw gesuspendeerd in 500-700 ml van 0,05 molaire tris-buffer met een pH van 7>4> die 1 mmol mercaptoethanol en 0,05 mol natriumchloride bevat.

III. Ionenuitwisselingschromatografie (ladingsgewijze methode)

Diethylaminoethyldextran-anionenuitw^sselingshars (DEAE

55 Sephadex A~50) in evenwicht gebracht met 0,05 mol tris met een pH van 7,4, die 0,05 mol NaCl en 1 mmol mercaptoethanol bevat, wordt aan het opnieuw gesuspendeerde kogeltje volgens deel II toegevoegd, waarna men gedurende 50 min. bij 4°C roert. De suspensie wordt door filtreerpapier Whatman No. 1 gefiltreerd en met hoeveelheden van de 40 0,05 molaire tris-buffer met een pH van 7>4> die 1 mmol mercapto- 82 Θ 0 5 8 7 - 12 - ethanol bevat, gewassen, tot het filtraat nog slechts een te verwaarlozen CE-activiteit bezit. Het filtraat wordt vervolgens bij 4°C onder druk tot 300-500 ml onder toepassing van een FM-10-filtermembraan geconcentreerd.

5 17. Tweede precipitatie met ethanol.

Koude absolute ethanol wordt langzaam aan het geconcentreerde filtraat volgens deel III toegevoegd, tot een 50%'s concentratie bereikt is. Het verkregen mengsel wordt gedurende 30 min. bij 4°C geroerd en vervolgens bij 7000 xg gecentrifugeerd, waarbij een 10 kogeltje gevormd wordt. De bovenstaande laag wordt achtergehouden en het kogeltje wordt verwijderd. Koude absolute ethanol wordt langzaam aan de bovenstaande laag toegevoegd tot een concentratie van 70% bereikt is. Het verkregen mengsel wordt gedurende 15 min. wederom bij 7000 xg gecentrifugeerd, waarna het verkregen kogeltje 15 in een minimaal volume van 0,05 mol tris met een pH van 7»4 (bijvoorbeeld 50-75 ml) opgelost wordt. Het verkregen mengsel wordt tegen 2000 ml 0,05 molair tris met een pH van 7,4 bij 4°0 gedia-lyseerd, waarbij de buffer tweemaal verwisseld wordt. Een gering neerslag, dat zich bij de dialyse in het mengsel heeft gevormd, 20 wordt na centrifugeren verwijderd en afgevoerd. De bovenstaande laag wordt bij deel 7 toegepast.

7. Ionenuitwisselingschromatografie (kolom).

DElE Sephadex A-50 wordt met 0,05 molair tris met een pH van 7,4 in evenwicht gebracht en een kolom van 2,6 x 60 cm wordt voor-25 bereid en uitgebreid met deze buffer gewassen. De laatste bovenstaande laag volgens deel". 17 wordt op de kolom gebracht en bij 4°C en onder een stroomsnelheid van 30 ml/uur geëlueerd. fracties van 10 ml worden verzameld, fracties worden op CK-activiteit en proteinegehalte geanalyseerd. De samengevoegde fracties, die de 30 meerderheid van het CK-MM-isoenzym bevatten, worden tegen 0,05 molair tris met een pH van 7,4, dat 10 mmol ethyleendiamine-treta-azijnzuur (EDTA) bevat, gedialyseerd. De gedialyseerde fracties worden bij 4°C onder druk en onder toepassing van een FM-10-filtermembraan tot een geschikt concentraat (bijvoorbeeld 8-40 35 mg proteïne/ml) geconcentreerd en bij 4°C in 0,05 molaire tris-buffer met een pH van 7,5, die 10 mmol EDTA bevat, bewaard. Een gering neerslag, dat bij het bewaren gevormd wordt, wordt door centrifugeren verwijderd. De zuiverheid van het CK-MM in het bewaarde materiaal is kenmerkend 90-100%, zoals dit door poly-40 acrylamidegelelektroforese bepaald werd. Elektroforese aan agarose- 8200587 - 15 - gel wordt toegepast om te laten zien, dab MB en BB-isoenzym in het bewaarde materiaal niet aanwezig zijn. Het op deze wijze verkregen produkt is het uiteindelijk gezuiverde monster van CE-MM.

Yoorbeeld 2.

5 Geiten-anti-CK-MM-serum.

Voor de bereiding van het immunogeen voor de immunisering van de geiten wordt het gezuiverde CE-MM, dat volgens voorbeeld 1 verkregen werd, met 0,02 molaire trisbuffer met een pH van J,5 tot 4 mg/ml verdund en met een gelijk volume aan volledig toevoeg-10 sel volgens Ereund (een suspensie in mineraleolie, die gedode M-tuberculosis bacillen bevat) gemengd. Het verkregen mengsel wordt tot een water- in -olieemulsie geëmulgeerd. Be geit wordt wekelijks met een injectie van 1 ml van dit immunogeen subcutaan in de omgeving van de oksel op twee plaatsen geïnjecteerd, waarbij op elke 15 plaats 0,5 ml immunogeen wordt toegepast. Aan de geit wordt elke twee weken bloed onttrokken, om het geiten-anti-CE-MM-serum te verkrijgen.

Yoorbeeld 5·

Activering van polyvimylideenfluoride.

20 Om de globulinefractie van ezel-anti-geit-IgG-serum aan polyvinylideenfluoride (PYE) te koppelen, wordt het EYE vooraf volgens de volgende werkwijze geactiveerd: 1. 15 1 tris-azidebuffer wordt door oplossen van 56,5 S tris (hydroxymethyl)-aminomethaan (ïrizma-Base) en 15 S natriumazide 25 in ongeveer 14*000 ml gedeioniseerd water bij kamertemperatuur opgelost, waarbij de pH met 5 H zoutzuur op 7*5 +0,1 ingesteld wordt. Het 5 N zoutzuur verkrijgt men door verdunning van 50 ml 58%'s zoutzuur met 70 ml gedeioniseerd water. Het volume van de verkregen oplossing wordt met gedeioniseerd water op 15*000 ml gebracht en 50 bij kamertemperatuur bewaard.

2. 100 g Bolyvinylideenfluoridepoeder wordt in een geschikt reservoir met 600 ml 2-propanol gemengd. Be verkregen suspensie wordt in een homogeniseringsinrichting gedurende 50 sec. bij een zodanige snelheid gehomogeniseerd, die voldoende is om een fijne dispersie 55 te bereiden en geeft een mengsel, dat in een geijkte cilinder van 4 1 wordt gebracht. Het mengsel wordt gedurende 10 min. bij kamertemperatuur bewaard. 5400 ml zoutwater, dat door oplossen van 28,9 't g natriumchloride in 5400 ml gedeioniseerd water werd verkregen, worden aan het mengsel toegevoegd. Ha de toevoeging van het zoute 40 water wordt het verkregen mengsel goed gemengd, waarna men gedurende 8200587 - 14 - 1 uur laat bezinken of zolang tot het polyvinylideenfluoride tot ongeveer 1/5 van het totale volume is bezonken. De bovenstaande laag wordt door afzuigen verwijderd en het volume wordt met gedeio- -niseerd water weer op 4000 ml verhoogd. Na bezinken van het poly-5 vinylideenfluoride wordt de bovenstaande laag opnieuw afgezogen. Hierna wordt het volume opnieuw op 4000 ml gebracht en het polyvinylideenfluoride wordt nogeens driemaal op deze wijze met gede-ioniseerd water gewassen. Vervolgens wordt het polyvinylideenfluoride nog tweemaal op deze wijze met de tris-azidebuffer van trap 1 ge- ' 10 wassen. Na de laatste wasbehandeling wordt het volume van het polyvinylideenfluoride op 2000 ml gebracht, waarna de suspensie bij kamertemperatuur wordt bewaard tot deze voor de koppeling van het ezel-anti-geit-IgG-serum wordt toegepast.

Voorbeeld 4· 15 Bereiding van de globulinefractie van ezel-anti-geit-IgG-serum.

De globulinefractie van ezel-anti-geit-IgG-serum voor de koppeling aan het geactiveerde PYF volgens voorbeeld 3 wordt onder toepassing van de volgende materialen en werkwijze verkregen:

Punt Materiaal Hoeveelheid 20 a) in de handel verkrijgbaar ezel-anti- geit-IgG-serum 100 ml b) verzadigde ammoniumsulfaatoplossing verkregen door toevoeging van 500 g vast ammoniumsulfaat (granulaat) 25 aan 500 ml gedeioniseerd water en 1 uur krachtig roeren bij kamertemperatuur, bewaren bij 4°C en bezinken van de kristallen 110 ml c) 0,02 molaire tris-az-idebuffer met een 30 pH van 7»5 ongeveer 6 1 d) verzadigde bariumchlorideoplossing bereid · door toevoeging van 50 g bariumchloride^H^O (granulaat) aan 100 ml gedeioniseerd water en 1 uur 35 roeren bij kamertemperatuur, waarbij men gevormde kristallen laat bezinken.

Men bewaart bij kamertemperatuur. ongeveer 1 ml

Werkwijze: 1. 100 ml ezel-anti-geit-IgG-serum (punt 1) worden bij 4°C in een 40 geschikte reservoir met magneetroerder gebracht. Daarna worden onder 8200587 - 15 - matig roeren 60 ml verzadigd ammoniumsulfaat (punt b) toegevoegd om de inhoud van het reservoir op een verzadiging van 37>5$ te brengen. Men roert gedurende 1 uur bij 4°C> waarna het neergeslagen antilichaam als kogeltje . door centrifugeren gedurende 30 min. bij 4°C en 12.000 xg verzameld wordt. Het kogeltje wordt in ongeveer 70 ml tris-azide-buffer (punt c) opgelost, waarna het volume op het oorspronkelijke volume van 100 ml met dezelfde buffer wordt gebracht. Hierna worden onder zwak roeren bij 4°C 50 ml verzadigde ammoniumsulfaatoplossing (punt b) toegevoegd om het verkregen mengsel op een verzadiging van 33% te brengen. Het mengsel wordt gedurende 1 uur bij 4°0 geroerd. Het neergeslagen antilichaam wordt na 30 min. centrifugeren bij 12.000 xg en 4°C als kogeltje verkregen. Het kogeltje wordt in ongeveer 40 ml tris-azide-buffer (punt c) opgelost en in een dialyseslang gebracht. Men dialyseert tegen tris-azide-buffer bij 4°C· De buffer wordt driemaal verwisseld (2 1 per wissel) na een minimum van 4 u.ren dialyse per keer. De aanwezigheid van sulfaationen wordt door toevoeging van 1 ml · dialysaat aan 1 ml verzadigde bariumchlorideoplossing vastgesteld, waarbij na roeren een wit neerslag de aanwezigheid van sulfaat aangeeft. In het geval een of ander neerslag wordt waargenomen, wordt het dialysaat met verse buffer uitgewisseld en wordt zolang gedialyseerd tot de sulfaatproef negatief is. Het volume van het dialysaat wordt met 100 ml tris-azide-buffer op 100 ml gebracht en gedurende 10 min. bij 2000 xg en 4°C gecentrifugeerd, waarna de bovenstaande laag verzameld wordt. De bovenstaande laag, die het bereide- ezel-anti-geit-IgG bevat wordt bij 4°C bewaard tot deze voor koppeling aan het geactiveerde polyvinylideenfluoride volgens voorbeeld 3 gekoppeld wordt.

Voorbeeld 5*

Koppeling van de globulinefractie van ezel-anti-geit-IgG aan geactiveerd polyvinylideenfluoride.

De koppeling van de globulinefractie van het ezel-anti-geit-' IgG-serum bereid" volgens de werkwijze van voorbeeld 4 aan een suspensie van het geactiveerde PTT bereid volgens de werkwijze van voorbeeld 3 wordt onder toepassing van de hierna volgende reagentia en werkwijze bewerkstelligd:

Punt Beagens Hoeveelheid a) Geaktiveerd polyvinylideenfluoride (voorbeeld lil) 2000 ml b) Globulinefraktie van ezel-anti- 8200587 - 16 -

Punt Reagens Hoeveelheid geit (igG)-Serum (voorbeeld Γ7) 100 ml c) Tris (hydroxymethyl)-aminomethaan (Trizma-Base) 24,2 g 5 d) Dinatriumzout van ethyleendiamine-

tetra-azijnzuur (EDTA) 147,4 S

e) 10 N Natriumhydroxyde in water ongeveer 20 ml

Werkwijze: 10 1· 10 1 tris-EDTA-buffer worden alg^olgt bereid: 24,2 g Trizma-Base (punt c), 10,0 g natriumazide en 147,4 g EDTA (punt d) worden bij kamertemperatuur in ongeveer 9000 ml gedeioni-seerd water opgelost.Om een volledige oplossing te bereiken kan het noodzakelijk zijn gedurende 30 tot 60 min. te roeren. De pH 15 van de oplossing wordt met 10 ïï HaOH op 7,5 + 0,1 ingesteld en de oplossing wordt metgedeïoniseerd water op een volume van 10.000 ml gebracht. De oplossing wordt bij kamertemperatuur bewaard.

2. 2000 ml van een suspensie die geactiveerd polyvinylideenfluoride (punt a) bevat, wordt in een geschikt reservoir gebracht en enigs-20 zins geroerd. 100 ml ezel-anti-geit-serum (punt b) wordt aan suspensie toegevoegd, waarna men gedurende 6 uren bij kamertemperatuur en gedurende de nacht (12-18 uren) bij 4°C roert. Men verkrijgt ezel-anti-geit-IgG-antilichaam gebonden aan polyvinylideenfluoride.

3· Het aan het polyvinylideenfluoride gekoppelde antilichaam vol-25 gens trap 2 wordt door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 10 min. als kogeltje verzameld. De bovenstaande laag wordt afgevoerd en het kogeltje wordt in een totaal volyme van 2000 ml tris-EDTA-buffer (zoals bij trap 1 bereid) opnieuw gesuspendeerd.

4· Trap 3 wordt totaal driemaal herhaald.

30 5· Het kogeltje resp. de kogeltjes die na trap 4 verkregen worden, wordt resp. worden tot een volume van 500 ml in de tris-EDTA-buffer (trap 1) opnieuw gesuspendeerd, waarna in deze suspensie 2,5 g runderserumalbumine door zwak roeren gedurende 30 min. worden opgelost. Deze suspensie wordt vervolgens in een homogeniseringsinrich-35 ting gedurende 30 sec. bij een snelheid gehomogeniseerd, die een fijne dispersie geeft en zo als produkt onoplosbaar anti-geit-IgG levert.

6. Het onoplosbare anti-geit-IgG-produkt wordt bij 4°C in de volgende eindeoneentratie bewaard: 40 20 gew/vol% polyvinylideenfluoride 8200587 .-17- 0,02 g molair tris pH 7?5 0,1 gew/voljó natriumazide

0. 5.gew/vol9ó BSA

39,6 mmol EDTA· 6 Voorbeeld 6.

Een bepaling van de CE-MB-activiteit in een biologische vloeistof wordt door de volgende werkwijze uitgevoerd, waarvoor twee proefbuisjes nodig zijn: 1. Aan het proefbuisje 1 worden toegevoegd: 200 yul serum van een 10 patiënt en 250 pl geit-anti-CE-MM-serum (zoals in voorbeeld 2 bereid) waarbij het mengsel enigszins geroerd en vervolgens gedurende 20 min. bij kamertemperatuur wordt bewaard, waarbij men het bij trap 3 toe te passen mengsel verkrijgt.

2. Aan proefbuisje 2 worden toegevoegd: 200 ƒ11 serum van een 15 patiënt en 50 pl geit-anti-CE-MM-serum (zoals in voorbeeld 2 bereid), waarbij men enigszins roert en vervolgens.gedurende 5 min. bij kamertemperatuur bewaart. Hierna voegt men 200 pl bewaard onoplosbaar anti-geit-IgG (bereid zoals in voorbeeld 5) toe, waarbij men enigszdns mengt en het reactiemengsel gedurende 5 min. bij 20 kamertemperatuur bewaart. Het buisje wordt vervolgens gedurende 5 min. bij 1000 xg gecentrifugeerd en de verkregen bovenstaande laag wordt bij trap 3 toegepast.

3· 100 ju.1 van het verkregen mengsel van trap 1 en 200 pl van de bovenstaande laag van trap 2 worden aan het eerste en het tweede 25 deel van 1,0 ml enzymatische CE-reagens (voorbeeld 7) voor de meting van de CE-enzymactiviteit toegevoegd. Vervolgens wordt elk deel grondig gemengd en daarna gedurende 5 min. bij 37°C geïncu-beerd. De absorptie wordt voor elk deel bij 340 nm gedurende een totale tijd van 5 min. met periodieke intervallen in een spektro-30 fotometer bij 37°C onder toepassing van een kuvet met een laag— dikte van 1 cm opgetekend. De opgetekende absorpties worden in absorptiewisseling per min. omgezet en de I.E./liter aan CE-acti-viteit voor elk deel wordt verkregen. Hierna wordt de waarde van de CE-activiteit van het tweede deel van de waarde van de CE-activiteit 35 van het eerste deel afgetrokken.

Voorbeeld 7.

Het enzymatische GE-reagens van voorbeeld 7 bevat de volgende reagensia: 40 8200587 - 18 -

Reagentia Concentratie in de formulering

Creatinefosfaat 17 mmol D-Glucose 20 mmol ARP 1,2 mmol 5 AMP 8 mmol HAR (gist) 2,3 mmol

MgClg 15 mmol

Hexokinase (gist 2500 IE/liter bij 50°C

Glucose-6-fosfaat-10 dehydrdgenase

(leuconostoc) 2500 IE/liter bij 30°C

Rithioerytritol 60 mmol

Re reagentia worden in piperazine-H,H-bis-(2-ethaansulfonzuur)·»· buffer met een pH 5»8 + 0,15 (50°C) geformuleerd.

15 8200587

Claims

1. Werkwijze voor de kwantitatieve bepaling van de aanwezigheid van de creatinekinase-MB-isoenzymvorm van creatinekinase, die in biologische vloeistoffen in een veelvoud van isoenzymvormen voor-5 komt, die de subeenheden M of B of beide bevatten, met het kenmerk, a. dat men in een eerste reaótiereservoir een eerste van twee delen van een monster van een biologische vloeistof met een eerste antilichaam incubeert, dat selectief immunologisch met de creatine-10 kinase-isoenzymen, die de M-subeenheid bevatten bindt en wel door selectieve immunoremming van de M-subeenheid in het eerste deel van het monster van de biologische vloeistof en dat men daarna de activiteit van het B-isoenzym in het eerste deel van het monster van de biologische vloeistof kwantitatief meet, 15b. dat men in een gescheiden reactiereservoir het tweede deel van het monster van de biologische vloeistof met (1) een antilichaam incubeert, dat selectief immunologisch de creatinekinase-isoenzymen, die de M-subeenheid bevatten, in het tweede deel van het monster van de biologische vloeistof bindt, 20 (2) een precipiterend tweede antilichaam toevoegt, dat selectief immunologisch met het antilichaam bindt, dat de creatinekinase-isoenzymen, die de M-subeenheid bevatten, bindt, om een reactie-produkt in de vorm van een neerslag in dit tweede deel te verkrijgen, bestaande uit dit tweede antilichaam met dit andere antilichaam 25- en deze creatinekinase-isoenzymen, die de M-subeenheid bevatten, en dat men daarna de activiteit van het B-isoenzym in' de bovenstaande laag in dit tweede deel kwantitatief meet en c. dat men de CE-MB-activiteit in dit monster uit de meetresultaten, verkregen uit het eerste en het tweede deel, bepaalt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als monster van de biologische vloeistof bloedserum toepast.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het eerste antilichaam van trap a en het antilichaam, dat de creatinekinase-isoenzymen, die de M-subeenheden van trap b bevatten, 35 bindt, geit-anti-creatinekinase-MM is en dat het tweede antilichaam van trap b ezel-anti-geit-IgG is.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het tweede precipiterende antilichaam aan een vaste drager gebonden is.· 40

5· Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, 8200587 -9 ** - 20 - dat de vaste drager polyvinylideenfluoride is.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat enzymatische activiteit van het B-isoenzym door een fotometrische bepaling bepaald wordt. 5

7· Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de spektrofotometrische bepaling een enzym-coenzym- en sub-straatmengsel omvat.

8. Diagnoseproefuitrusting voor de kwantitatieve bepaling van de aanwezigheid van de creatinekinase-MB-isoenzymvorm van creatine-10 kinase, die in biologische vloeistoffen in een veelvoud van isoenzym-vormen voorkomt, die de subeenheid M of B of beide bevat, met het kenmerk, dat de proefuitrusting de volgende bestanddelen bevat: (a) een eerste houder, die een antilichaam bevat }dat instaat is 15 selectief immunologisch met de creatinekinase-isoenzymen te binden, die de subeenheid M bevatten, en wel door selectieve immunoremming van de M-subeenheid, (¾) een tweede houder, die een precipiterend tweede antilichaam bevat, dat instaat is selectief immunologisch met het antilichaam, 20 dat in de eerste houder aanwezig is, te reageren en (c) een reagens van enzym-coenzym en substraat, dat instaat is de enzymatische activiteit van de B-subeenheid vast te stellen.

9· Proefuitrusting volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het precipiterende tweede antilichaam aan een 25 vaste drager gebonden is.

10. Proefuitrusting volgens conclusie 9> met het kenmerk, dat de vaste drager polyvinylideenfluoride is. 8200587