DE2907228C2 - Immunochemische Bestimmung zur Bestimmung der LDH↓1↓-Aktivität - Google Patents

Immunochemische Bestimmung zur Bestimmung der LDH↓1↓-Aktivität

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Description

dadurch gekennzeichnet, daß der in Stufe a) gebildete Komplex durch Behandeln mit einem in einer anderen als der zur Bildung des ersten Antikörpers verwendeten Tierart immunologisch erzeugten zweiten Antikörper, der auf einem Festphasen-Trägermaterial unlöslich gemacht worden ist, insolubilisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper an aktiviertem Polyvinylidenfluorid unlöslich gemacht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als erster Antikörper Ziegen-Anti-LDH5-Antikörper verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als zweiter Antikörper Esel-Anti-Ziegen-^- globulin verwendet wird.
Die Erfindung bezieht sich auf eine immunochemische Bestimmung des Isoenzyms LDHi, eines bekannten Herzinfarkt-Anzeigers.
Die US-PS 4046 634 offenbart eine Bestimmung für Isoenzyme, LDH-Isoenzyme eingeschlossen, die lonenaustauschsäulenchromatographie zum Isolieren eines Gemischs von LDHr und LDHj-Isoenzymen anwendet, die dann nach herkömmlichen Techniken, wie der Wacker-LDH-Methode, nachgewiesen werden.
Die DE-AS 21 28 670 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Isoenzymen, LDH-Isoenzyme eingeschlossen, durch Behandeln der Testprobe mit einem großen Überschuß eines spezifischen Antikörpers entweder zum Isoenzym LDHi oder LDHs zur quantitativen Fällung des Antigen-Antikörper-Komplexes. Nach dem Inkubieren und Zentrifugieren des ausgefällten Komplexes wurde die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit nach der in Z. Klin. Chemie und KHn. Biochemie 8,658 (1970) berichteten Methode bestimmt.
Sussman et al. haben im Journal of Biological Chemistry 243, 160 (1968) eine Bestimmung für einzelne organspezifische Isoenzyme alkalischer Humanphosphatase unter Anwendung einer zweistufigen Arbeitsweise beschrieben. In der ersten Stufe wurde der spezifische Antikörper zu dem gewünschten Isoenzym mit der Testprobe umgesetzt, und dann wurde in einer folgenden Stufe der Antikörper-Antigen-Komplex mit einem zweiten Antikörper (Anti-^-globulin) gefällt Nach dem Zentrifugieren wird die überstehende Flüssigkeit auf restliche Isoenzymaktivität getestet.
Die Verwendung eines zweiten, auf einem festen Trägermaterial unlöslich gemachten Antikörpers bei Radioimmuntestverfahren ist in der US-PS 40 48 298 beschrieben. Dazu gehört auch die Verwendung zweiter Antikörper, die an der Oberfläche polymerer, fester Trägermaterialien adsorbiert sind.
Die US-PS 38 43 443 betrifft ein Verfahren zum Unbeweglichmachen von Proteinen an einem Fluorkonlenstoffpolymerisat-Träger. Zu den offenbarten Proteinen gehören Antikörper, und das bevorzugte polymere Trägermatrial ist Polyvinylidenfluorid.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der LDHi-Aktivität in einer Serumprobe durch
a) Behandeln der Serumprobe mit einem für die M-Untereinheit von LDH-Isoenzym immunologisch selektiven ersten Antikörper, der mit in der Probe vorhandenem LDH2, LDH3, LDH4 und LDH5 einen Komplex bildet,
b) Abtrennen des Komplexes von der überstehenden Lösung und
c) Bestimmen der LDHi-Aktivität der überstehenden Lösung,
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welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der in Stufe a) gebildete Komplex durch Behandeln mit einem in einer anderen als der zur Bildung des ersten Antikörpers verwendeten Tierart immunologisch erzeugten zweiten Antikörper, der auf einem Festphasen-Trägermaterial unlöslich gemacht worden ist, insolubilisiert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat erhebliche Vorteile gegenüber bisher bei der Isoenzymbestimmung angewandten Arbeitsweisen. Es ist sehr schnell, äußerst genau und reproduzierbar. Die Herstellung der LDH, enthaltenden überstehenden Flüssigkeit kann in Minuten anstelle von mehreren Stunden, wie bisher für immunologische Techniken erforderlich, geschehen. Zudem führt das erfindungsgemäße Verfahren zu einer sauberen Trennung des LDHi von den anderen LDH-Isoenzymen, die nach Ionenaustauschsäulen-Arbeitsweisen nicht möglich ist.
Der gegenüber der M-Untereinheit des LDH spezifische, erfindungsgemäß verwendete Antikörper ist auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z. B. die genannte DE-AS 21 28 670. Weitere, sich auf solchen Antikörper beziehende Beschreibungen finden sich in J. S. Burd et al., Clinica Chimica Acta 46,205—216 (1973) und J. S. Burd et al., Biochimica, Biophysica Acta, 310,238 - 247 (1973).
Der zweite Antikörper wird durch Immunisieren eines anderen als des Tieres hergestellt, in dem der crsic spezifische Antikörper hergestellt wird, mit einem ;*-Globulin aus dem Blut der Tür die Herstellung des ersten Antikörpers verwendeten Wirtsart So ist der zweite Antikörper immunoreaktiv für den ersten Antikörper und bildet mit ihm einen Komplex.
Der zweite Antikörper wird unlöslich gemacht, indem er an ein unlösliches Trägermaterial gebunden wird. Geeignete Trägermaterialien sind z. B. wasserunlösliche organische polymere Substanzen, wie Cellulose oder andere Polysaccharide, ein Vinyl-Additionspolymerisat oder ein Kondensationspolymerisat oder eine wasserunlösliche anorganische Substanz polymerer Natur, wie Glas oder Silikonharze, oder der zweite Antikörper kann an der Oberfläche eines festen Trägers, wie Polystyrol, Polypropylen, Polyfluoräthylen oder Polyvinylidenfluorid, adsorbiert werden. Die Art der Verbindung des zweiten Antikörpers mit dem festen Träger ist nicht sehr kritisch und kann folgende Möglichkeiten umfassen:
1. Kovalentes Kuppeln des löslichen zweiten Antikörpers an irgendeine unlösliche Polymersubstanz,
2. Überführen des löslichen zweiten Antikörpers in eine unlösliche polymere Form, wie durch Umsetzen mit einem unlöslich machenden Mittel.
3. physikalisches Einschließen von Teilchen des zweiten Antikörpers in den Porei< eines Gelpolymers, wie eines vernetzten Polyacrylamide, oder
4. physikalische Adsorption an einer unlöslichen Polymersubstanz.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der zweite Antikörper an aktiviertes Polyvinylidenfluorid unter Anwendung der allgemeinen, in der (JS-PS 38 43 443 offenbarten Arbeitsweisen adsorbiert Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel weiter veranschaulicht.
Beispiel
l.Reagentien
a) Antiserum zu LDH5: Ziegen-Anti-LDHs-Serum wird auf eine Konzentration verdünnt, die 300 bis 400 l.E./l an gereinigtem LDHs-lsoenzym unter Anwendung der Fisher-Diagnostik oder äquivalenter Reagentien zur Bestimmung der LDH-Enzymaktivität bindet. Die Verdünnung des Antiserums erfolgt in 0,02 m Tris vom pH 7,5 mit 0,1% NaN3-
b) Unlösliches Antiserum zu Ziegen-/-Globulin
Bei der Herstellung eines unlöslichen Antiserums zu Ziegen-^-Globulin (zweiter Antikörper) werden die folgenden speziellen Schritte befolgt: Das Ausgangsmaterial ist ungesintertes Polyvinylidenfluoridharzpulver, Qualität 301 F (der Pennwalt Corp.). Das Pulver wird in Isopropanol (2-Propanol) in Anteilen von 50 g in 1000 ml Isopropanol dispergiert. Die Suspension wird dann 5 min mit einem Brinkmann Polytron mit einer Frequenz von 4000 Hz homogenisiert. Das Polyvinylidenfluorid/Isopropanol-Gemisch wird dann in einen Zylinder überführt, der 101 Salzlösung enthält, und gerührt, bis es dispergiert ist. Dann kann sich das Polyvinylidenfluorid absetzen, und der größte Teil der überstehenden Flüssigkeit wird dekantiert. Nach zweimaligem Waschen mit Wasser wird das Polyvinylidenfluorid erneut in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,0) mit (0,01%) Merthiolat zu einer 2%igen Polyvinylidenfluoridkonzentration suspendiert. Das Polyvinylidenfluorid ist nun im aktivierten Zustand und in der Lage, Protein aufzunehmen. Während das Isopropanol-aktivierte Polyvinylidenfluorid gerührt wird, werden 0,5 ml Esel-Antiziegen-^-Globulin-Serum pro g Polyvinylidenfluorid zugesetzt. Das Gemisch wird dann wieder mit dem Polytron 5 min bei gleicher Frequenz wie zuvor homogenisiert. Die Suspension wird dann bei Raumtemperatur mindestens 6 h weitergerührt, dann mindestens 12 h bei 40C. Nun ist die Suspension bereit, gewaschen zu werden. Dies geschieht durch lOminütiges Zentrifugieren mit 1500 g und anschließendes erneutes Suspendieren in 0,02 m Tris-hydroxymethylaminomethan bei pH 7,5 mit 0,1% NaNj. Dieser Vorgang wird nochmal wiederholt, und das fertige Material wird erneut in 0,02 m Tris vom pH 7,5 mit 0,1 % NaN3 zu 100 g Polyvinylidenfluorid/1000 ml Puffer suspendiert. Das Gemisch wird wieder gerührt, und 5 g Rinder-Serumalbumin (RSA)/100 g Polyvinylidenfluorid werden zugesetzt Homogenisieren mit dem Polytron bei 4000 Hz für 5 min ist die letzte Stufe bei dieser Arbeitsweise.
2. Arbeitsweise
a) Zu 200 μΐ Patientenserum werden 10 μΐ lösliches Ziegen-Anti-LDH5-Serum gegeben und durchwirbelt. Dann wird 5 min gewartet.
b) 200 μΐ des unlöslichen zweiten Antikörpers*) werden zugesetzt und durchwirbelt. Es wird 5 min gewartet.
c) Rotation für 5 min bei etwa 1000 g.
J) Von der überstehenden Flüssigkeit wird soviel abgenommen, wie für eine herkömmliche LDH-Aktivitäts- »2 bestimmung nötig. Anzuwenden ist die gleiche Arbeitsweise.
(Λ *) Es ist dafür zu sorgen, daß die Suspension des unlöslichen Antikörpers vor Verwendung gut gemischt wird. Ein kleiner
|J Rührstab wird in die Reagensnasche gebracht und während der Entnahme des Antikörpers gemischt.
3. Berechnungen
(',', LDHi-Aktivität = Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit χ 2,05.
4. Interpretation
Zur Entscheidung über einen Endpunkt für LDHi wird ein willkürlicher Wert festgelegt. Dieser Wert wird für jedes einzelne Labor in Abhängigkeit von dem normalen Gesamt-LDH-Bereich des angewandten Enzymtests differieren. Zur Festlegung einer Obergrenze des Normalen für LDHi (H4) nehme man 30% des oberen Werts des Normalen für den Test der Gesamt-LDH-EnzymaktivitäL Der Fisher-Diagnostik-LDH-Test z. B. lieferte eine Obergrenze des Normale ι von 149 I.E71 (der Normalbereich ist 52—149 I.E71). Daher erweist sich der angenommene Endpunkt als 30 Vo von 149 oder 45 Ι.ΕΛ Jedes Serum, das eine LDHi-Aktivität über 45 I.EVl zeigt, ist dann als Herzinfarkt-positiv anzusehen.
Klinische Ergebnisse
Seren von 106 Patienten einer Herzpflegestation wurden auf LDH|-Erhöhung geprüft. Bei allen 72 Patienten, bei dejien ein Herzinfarkt diagnostiziert wurde, wurde eine LDH|-Erhöhung beobachtet. Für alle 34 Nichtherzinfarktpatieiiten jedoch blieb LDHi nicht-erhöht. Ein Endpunkt von 45 I.E71 wurde für biochemische Infarktdiagnose festgelegt Der Bereich der LDHi-Aktivität in Herzinfarktpatienten betrug 46—470 I.E/I. Der Bereich für die Nichtherzinfarktpatienten betrug 9 bis 44 I.E71. Derzeit bestimmen die meisten Laboratorien das »Hochschnellen« von LDH1/LDH2 durch Elektrophorese. Diese Technik ist umständlich und zeitraubend. Die erfindungsgemäße immunochemische Arbeitsweise dagegen ist einfach und schnell. Zudem ist die Bestimmung der LDH|-Erhöhung empfindlicher als die übliche Methode. In 59 der 72 Herzinfarktpatienten trat das Hochschnellen des LDH am gleichen Tage ein wie der Anstieg des LDHi. In acht Fällen jedoch trat es einen Tag nach dem LDKi-Anstieg ein, und in 5 Herzinfarktpatienten wurde es überhaupt nicht erhalten (vgl.Tabellen I, Il und 111).
25 Tabelle I LDH-»Sprung«
am gleichen Tag
wieder LDHi-Anstieg		 am Tag nach dem
LDH1-Anstieg 		LDH-»Sprung« nicht
vorhanden		 überhaupt
nicht
30 Zahl der LDHi erhöht
Herzinfarktpatienten		 59 8 0 5 5
72 72
Tabelle II 		LDHi erhöht LDH-»Sprung«
am gleichen einen Tag
Tag wie CPK nach CPK		 überhaupt
nicht
35 Zahl der Patienten ohne Herzinfarkt 0 31 19
40 34
Tabelle III (Teil A) 		einen Tag überhaupt
nach CPK nicht		 LDH-»Sprung«
am gleichen Tag wie einen Tag nach
die LDHi-Erhöhung derLDHi-Erhöhung
45 Zahl der Herz- CPK-MB LDH1 erhöht
infarktpatienten vorhanden am gleichen
Tag wie CPK 		12 0
50 58 55 43
Tabelle III (Teil B)
Zahl der Herz- DPK-MB LDH,
infarktpatienten fehlend erhöht

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    1. Verfahren zum Bestimmen der LDHi-Aktivität in einer Serumprobe durch
    a) Behandeln der Serumprobe mit einem für die M-Untereinheit von LDH-Isoenzymen immunologisch selektiven ersten Antikörper, der mit in der Probe vorhandenem LDH2. LDH3, LDH4 und LDH5 einen Komplex bildet,
    b) Abtrennen des Komplexes von der überstehenden Lösung und
    c) Bestimmen der LDH. -Aktivität der überstehenden Lösung,
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