DE2350711A1

DE2350711A1 - Verfahren zum herstellen von antikoerpern gegen isoenzyme der laktatdehydrogenase

Info

Publication number: DE2350711A1
Application number: DE19732350711
Authority: DE
Inventors: Horst Dr Med Spielmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1973-10-06
Filing date: 1973-10-06
Publication date: 1975-04-17

Description

Verfahren zum Herstellen von Antikörpern gegen Isoenzyme der

Die effindungsgemäß hergestellten Antikörper werden zur Aufklärung der Frage angewandt, welches der Laktatdehydrogenase-Isoenzyme eine Erhöhung der Gesamtaktivität der Laktatdehydrogenase des Blutes ursächlich hervorruft undf-dient der diagnostischen Untersuchung vorwiegend bei Herzinfarkt. ·

Enzyme, die die gleiche Reaktion katalysieren _s aber verschiedene chemische bzw. physikalisch-chemische Eigenschaften aufweisen, nennt man Isoenzyme. Das bekannteste Beispiel hierfür ist die Laktatdehydrogenase (im folgenden LDH abgekürzt)? die die Umwandlung von Laktat in Pyruvat und umgekehrt katalysiert,Bei diesem Ensvm lassen sich 5 Isoenzyme unterscheiden, die in den verschiedenen Organen verschieden stark vorhanden sind und sich z.B. vermittels Elektrophorese trennen lassen.

Bei Schädigungen von Organen, z.B. bei akuten Erkrankungen, treten die Enzyme des geschädigten Organs in das Blut über und führen zu einer Veränderung der Isoenaymverteilung im Blutserum, die für bestimmte Erkrankungen spezifisch ist. Es lassen sich auf diese Weise die Schädigungen bestimmter Organe bestimmten Verteilungsmusters der Blutserum-LDH-Isoenzyme zuordnen» So sind für Erkrankungen des Herzmuskels Erhöhungen der LDH-I(H^) charakteristisch, andererseits ist bei Schädigungen von Leber und Sielettmuskeln vorzugsweise das Isoenzym-LDE-5 (M₄) im Blutserum erhöht. Um eine genaue.Organdiagnostik bei Erhöhungen der

50 9 8 16/1215

Serura-LDH durchführen au könaen, brauchte man bisher Hilfsreaktionen. Man kann z.B. dadurch ein® Erhöhung der LDH-I sicherstellen, indem man sich die Tatsache zunutze macht, daB nur LDH-I auch noch die Eigenschaft besitzt, α-Hydroxybutyrat zu oxidieren bzw. a-Ketobutyrat zu reduzieren. Man könnte natürlich auch zu einem Serum mit erhöhter Gesamt-LDH-Äktivität ®ln©n spezifischen, nur gegen dieses Isoenzym wirksamen Antikörper zusetzen? nach kurzer Inkubationszeit hat der Antikörper dann die erhöhte LDH-I inaktiviert. Bei der anschließenden LDK-BaStimmung würde dann die LDH-Aktivität des Serums nicht mehr erhöht sein. Es läßt sich auf diese Weise mit spezifischen Antikörpern g©g®n LDH-I oder LDH-5 der Anteil von H- und M-ünterelnheiteß am Zuatandekoiamsn der LDH-Gesamtaktivität normaler und pathologischer Seren feststellen.

Da die LDH-Messung die &ntlgen-Antikörper-*Reaktion nicht beeinflußt, kann die immunoehemigeh© LDE-Bestirasmng leicht in die Routineuntersuchungen von Labors aufgenommen werden, die gegenwärtig LDH-Bestinsmungeß durchführen. Es ist dazu nicht wie im Fall der Butyrat-Bestiisraung ein völlig anderer Enzymansatz nötig. Das gilt sowohl für LDH~B@stiismung©n mit dem optischen Test, der den Übergang von NADH in NAD bei 340 nai bestimmt, wie für kolorimetrische LDH-Bestimmungen.

Di« Verwendung spezifischer Antikörper gegen LDH-I kann insbesondere bei der enzyxnatischen Diagnostik des Herzinfarkts Bedeutung erlangen, da aber bisher noch keine hemmenden Antikörper gegen LDH-I entwickelt werden konnten, gibt es in der Literatur noch keinen Hinweis auf ein darartiges Verfahren. Da es vergleichsweise leicht ist, Antikörper gegen LDH-5 herzustellen, wurde kürzlich von J.F. Burd, H. Usategui-Gomez, A. Fernande.-: de Castro, N.S. Mhatre und F.H. Yeager der AHES RESEARCH LABORATORIES der AMES COMPANY - einer Division der Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana (USA) und der PATHOLOGY CONSULTANTS INC., Michigan-City, Indiana (USA) der Vorschlag gemacht, entsprechende Untersuchungen mit sftesifIschen Antikörpern gegen LDH =»5 durchzuführen. (Clinica Chiaica Act® 4δ, 205-216 (1973)). Ia dem ausgeführten Fall bleibt bei Vorliegen ©ines Herzinfarktes die Erhöhung der Serum-LDH auch

509816/1215

nach Zugabe de· Antikörpers bestehen? den angeführten Autoren war es nicht gelungen _s einen spezifischen Antikörper gegen LDH-I herzustellen. (Burä_ff J.F, raid Usategui-GoM©s ₀ M., Biochim. Biophys. Acta, 310, 238,247 (1973)).

Normalerweise werden Proteine„ gegen die man eisxen Antikörper herstellen will, gereinigt, z.B. kristallisiert und dann, zusammen mit Freund's Adjuvans in Tiere zur Antikörperbildung injiziert. Auch bei Mengen von insgesamt 25 mg LDH-I ließen sich auf diese Weise keine hemmenden Antikörper herstellen«, 1962 fanden M. Weintraub und S. Reymond CSeiene© -142, 1677-1678, 1963), daß Acrylamid ein «ehr starkes Adjuirans bei der Antikörper-»- produktion ist. Später benutzten R₀F₀ Erickson und E₀ Steers Jr«, die B-Galaktosidase, welche auf Polyacrylamid von anderen Proteinen gereinigt worden war zur Herstellung von Antikörpern gegen diese Enzyme, indem sie die Acrylamldbande _g die das Snzym enthielt, zur Injektion in Kaninchen verwandtem_o (Arch.Biochem° Biophys. 137, 399-408, 1970). Bisher wurd© noch nicht der Versuch unternommen, Acrylamid als Adjuvans bsi d@r Äntikörperbi!dung gegen Isoenzyme der LDH zu

Um ein gereinigtes Isoenzym sur Antikörp@rbildung sn verwenden, kann man die üblichen Isolierungsschritte amienden und das kristallisierte Isoenzym auf Polyacrylamid geben oder man kann alle 5 Isoenzyme der LDH gleichzeitig affinitätsehrosaatographisch von allen anderen Proteinen reinigen und dann auf Polyacrylaraidgelen voneinander trennen. Die folgende Methodik hat sich dabei als erfolgreich erwiesen:

Gewebe oder auch Erythrocyten werden homogenisiert Lm Verhältnis 1:10 mit 0,02 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, und anschließend b·! 13000 g zentrifugiert und zwar ea„ 15 Minuten. Bei Verwendung von Blutserum ist nur eins Verdünnung mit einem entsprechenden Puffer notwendig. Der überstand wird mit (NH.),Bö_a bis zur 40%igen Sättigung angereichert, @r bleibt dann bsi 4°C 2 Stunden stehen und wird wieder genauso zentrifugiert.

5098 16/12 15

Der überstand wird sodann mit (NH₄J₂SO₄ bis zur 70%igen Sättigung weiter angereichert und bleibt über Nacht bei 4°C stehen. Sodann wird erneut mit derselben Geschwindigkeit zentrifugiert und diesmal das Präzipitat in einem möglichst kleinen Volumen 0,5 m NaCl in 0,02 M Phosphatpuffer, pH 6,8, gelöst und noch einige Zeit gegen denselben Puffer dialysiert. Dann wird dieser Extrakt mit NADH (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Hydrat) bis zu einer 200 μΜ Konzentration angereichert und anschließend wird eine AffinitatsChromatographie nach P.O.* Carra und S. Barry (FEBS Letter 21, 281-285, 1972) durchgeführt, dabei ist jedoch die folgende Veränderung nötig. Kaliumoxalat wird nicht entsprechend dem Vorschlag der beiden Autoren an Aminohexyl-Sepharose gekoppelt, dazu wird das Kaliumoxalat in Wasser gelöst und es wird im Gegensatz zu den beiden Autoren der pH nicht verändert und das wasserlösliche l-Xthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid wird hinzugefügt. Nach einer Aktivierungszeit von 5 Minuten wird diese Lösung mit Aminohexyl-Serharose zusammengegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es werden jeweils 140 mg Kaliumoxalat in 2 ml Wasser gelöst und 370 mg des wasserlöslichen Carbodiimide zugegeben und5 ml gepackte Aminohexyl-Sepharose dazugegeben. Man gibt den oben geschilderten LDHhaltigen Extrakt auf die Säule, der Extrakt von etwa 50gGewebe kann dabei auf eine Säule von 50 ml Volumen gegeben werden. Die Säule läßt man bei Raumtemperatur mit den von O¹Carra und Barry angegebenen Puffern laufen, d.h. 0,5 M NaCl in 0,02 M Natrium-Phoephatpuffer, pH 6,8, wird sum Eluieren verwendet. Dieser Puffer wird bis zur Konsentration 200 μΜ mit NADH angereichert und die Säule solange damit beschickt, bis ca. das 10-fache Säulenvolumen dieses Puffers durch die Säule hindurchgelaufen ist. Dann wird der Puffer gewechselt und entsprechend 0'Carra und Barry derselbe PuIffer ohne NADH sum Eluieren verwendet. Zn den nächsten Säulenvolumina ist dann die gereinigte LDH enthalten. Anschließend wird diese die LDH enthaltende Lösung mit Hilfe der Vakuumdialyse

509816/1215

oder eines anderen Verfahrens auf ein möglichst kleines Volumen eingeengt und anschließend gegen Phosphatpuffer (0,02 M,. pH 7,4) dialysiert. Es muß noch erwähnt werden, daß die (NH^)₂-SO₄-Präzipitation kein unbedingt notwendiger Schritt ist, sie empfiehlt sich jedoch zur Verringerung der Mengen d@r großraolekularen Proteine in 13000 g überstand. Zur AffinitatsChromatographie ist dieser Überstand dann entsprechend auf denselben Puffer einzustellen (200 μΜ NADH, in 0,5 M NaCl in 0,02 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,8). Der so gereinigte LDH-Extrakt , der alle 5 LDH-Isoenzyme enthält, oder auch gelöstes kristallisiertes Enzym, das auf einem anderen Wege isoliert Jordan 1st, wird nun der Polyacrylamid-Elaktrophores© uaterworfen _β Man ks.nn dazu ein kontinuierliches System mit 7,5%igen Oslen In TrIs-Glycin-Puffer verwenden, falle diese Methode k©In© gut© Trennung der Isoenzyme zuläßt, sollte man die von Diets, &.!.„ Lubrano Τ« und Rubinstein, H.M. (Clin.Chim.Acta 27, 225-235) angegeben© Methode mit 5%igen Gelen zur Trennung der LDH-Isoenzym© den. Man-gibt ca. 200 y$ reine LDH auf jedes Gslröhrefo©» legt pro Röhrchen eine Spannung von 3 roA an» Die Ensym-i und Stromstärke müssen bei Verwendung von Plattengelen, wie z.B. dem ORTEC-Systera entsprechend abgewandelt werden<,

Sobald die Flüssigkeitsfront das Ende dee GsIs ersieht hat, wird die Elektrophorese beendet und es wird das Gel so kurz wie möglich mit einer LDH-Färbung angefärbt» Als Färbelösung empfiehlt sich z.B. 1,6 g Na-D,L-Laktat, 10 mg NAD, 0,8 mg Phenazlnmethosulfat und 10 mg Nitroblautetrasolium in 40 ml 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,1.

Die Prozedur, die im folgenden für LDH-I beschrieben wird, läßt sich genauso für die LDH-5 und alle anderen Isoenzym« durchführen.

Die LDH-I enthaltende Scheibe wird aus dem Gel herausgeschnitten, sobald sie durch die Farbreaktion identiflxierhar ist, LDH enthaltende Scheiben werden dann bei -20°C aufbewahrt.

50981 6/1215

Gefroren· Gelacheiben, die insgesamt 200 yg reine LDH-I enthalten, werden aufgetaut und in 1 ml 0,9liger NaCl-Lösung homogenisiert und mit 1 ml Freund¹* komplettem Adjuvans subkutan im Schulterblattbereich in männliche weiße New Zealand Kaninchen injiziert. Zn wöchentlichem Abstand werden 3 Booster-Injektionen mit denselben Mengen LDH-I auf Acrylamid durchgeführt, dabei wird jedoch dieselbe Menge von Freund's inkomplettem Adjuvans verwendet und die Injektionen werden subkutan in dmeselben Bereich abwechselnd rechte und links durchgeführt (das entspricht im Wesentlichen dem Vorgehen von Srickson und Steers Jr. siehe weiter oben). 5 Tage nach der lotsten dieser Injektionen werden 15 mg der gereinigten LDH, die also alle Isoenzyme enthält, und nicht auf ein Gel aufgebracht worden ist, in eine Ohrvene des Kaninchens injiziert. 5 Tag® danach wird das Blutserum der Kaninchen mit dem Ouchterlony-Doppeldiffusionstest auf präzlpitierende Antikörper untersucht. Nach dieser Zeit weist das Serum der immunisierten Tiere gewöhnlich präzipitierende und auch inhibierende Antikörper &uf.

Um die inhibierenden Antikörper feststellen zu können, muß die LOH des Kaninchenserums von d®n die Antikörper enthaltenden t-Globulinen trennen. Dazu reichert nan das Kaninchenserum mit (NHj)₂SO. bis zur 33!igen Sättigung an und nimmt daa Prftaipitat i» ursprünglichen Voluusen 0,05 M Natriuraphosphatpuffer, pH 7,5, auf (Holmes, R.S.) (FEBS Letters 28, 51-55, 1972). Diese Lösung wird gegen denselben Puffer dialyeiert und anschließend bei -20°Caufbewahrt. Der so hergestellte Antikörper wird in verschiedenen Konsentrationen bekannten Ansätzen, die bestimmte Mengen von LDH-Isoenzyaen enthalten, zugesetzt, 10-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und sodann wird diese seine Spezifität auf Grund der verbleibenden LDH-Restaktivität festgestellt. D«e Verfahren des Zusetzen* von einer bestimmten Menge von Antikörpern zu einer bestirnten Menge einer LDH-Aktivität

509816/121 5

und die Bestimmung des Anteile von H- und M-Untereinheiten wurde schon su Anfang erläutert.

Abgesehen davon, daß die beschriebene Methode bisher die einsige ist, die eine Erseugung von Antikörpern gegen LDH-I erlaubt, wird die Menge an Ensymprotein, die sur Erzeugung eines Antikörpers nötig ist, um mehr als das 20-fache reduziert; man benötigt also sehr viel weniger gereinigtes Ensym als Ausgangsmaterial. Insgesamt konnte mit ungefähr 1 mg LDH-Ensymproteln ein inhibierender Antikörper erzeugt werden, der ja allein eine serologische Aufklärung des Anteils der H- und M-Unter@inheiten erlaubt«

5098 16/1.2 15

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Herstellen von Antikörpern unter Verwendung von Freund's Adjuvan3 gegen Isoenzyme der Laktatdehydrogenase, insbesondere spezifische Antikörper gegen die Laktatdehydrogenas·, LDH-I, gekennzeichnet durch die zusätzliche Anwendung von Acrylamid als Adjuvans.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch von Isoenzymen affinitätschroroatographisch von allen anderen Proteinen gereinigt und auf einem Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch getrennt, sowie der die LDH-I enthaltende Gelanteil nach Homogenisieren zur Injektion angewandt wird.

3. Verwendung der nach den Verfahrensansprüchen hergestellten Antikörper zur enzyraatischen Diagnostik des Herzinfarktes.

BAD ORIGINAL 5098 16/1215