DE3436005A1

DE3436005A1 - Neue bilirubinoxidase, diese enthaltende zubereitung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE3436005A1
Application number: DE19843436005
Authority: DE
Inventors: Susumu Ootsu Matsui; Tsutomu Kyoto Taniguchi; Yoshio Yoshihama
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1983-11-21
Filing date: 1984-10-01
Publication date: 1985-05-30
Also published as: DE3436005C2; FR2555196B1; GB2146997B; US4600689A; GB2146997A; KR880000753B1; FR2555196A1; GB8422935D0; KR850003843A; CA1219792A

Description

Neue Bilirubinoxidase, diese enthaltende Zubereitung und ihre Verwendung

^b Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Bilirubinoxidase, die von einem Stamm erzeugt wird, der zu dem Genus Trachyderma der Klasse Basidiomycetes gehört, die Herstellung dieser Oxidase, eine Reagenszubereitung für Bilirubin, welche die neue Bilirubinoxidase enthält, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin in Testlösungen, wie biologischen Flüssigkeiten, unter Einsatz der Reagenszubereitung, sowie die Anwendung der Reagenszubereitung auf Analysenmethoden, bei deren Durchführung die beeinflussende Wirkung von Bilirubin ausgeschal-

15 tet werden muß.

Bilirubin ist eine gelbe Substanz, die im Blut durch Abbau von Hämoglobin gebildet wird. Die schnelle und genaue Bestimmung von Bilirubin im Blutserum ist für die medizinisehe Diagnose von Krankheitszuständen, beispielsweise Gelbsucht beim Menschen, von vitalem Interesse. Bilirubin wird im Blutserum von Gelbsuchtpatienten abnormal vermehrt, so daß das Ausmaß der Gelbsucht durch Messung von Bilirubin im Blutserum diagnostiziert werden kann.

Zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin wird ein chemisches Meßverfahren angewendet, das als Diazomethode bezeichnet wird und unter Verwendung von Diazoniumsalzen, wie Diazosulfanilsäure, durchgeführt wird (vgl. I. Kanai und M. Kanai. "Manual of Clinical Assay", 28. Auflage, Seite XII-24, veröffentlicht von Kinbara im Jahre 1978). Dieses chemische Meßverfahren ist jedoch mit Nachteilen behaftet, beispielsweise bezüglich der Spezifität der Reaktion, der komplizierten Verfahrensweise, der stimulativen und korrosiven Eigenschaften der Reagentien etc. Daher

wirft dieses Verfahren viele Probleme bei seiner Durchführung in automatisch arbeitenden Analysevorrichtungen auf, und zwar bezüglich der Wartung und Steuerung der Vorrichtungen, einer genauen Messung oder dgl. 5

In den letzten Jahren wurde ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin mit einem Enzym entwickelt, über ein Enzym, das mit Bilirubin reagiert, wird zuerst von R. Brodersen und P. Bortels (European Journal of Biochemistry, Band 10, 468 (1969)) berichtet. In dieser Arbeit wird ausgeführt, daß eine unlösliche Bilirubinoxidase, die aus dem Hirn von Meerschweinchen isoliert worden ist, Bilirubin zu Biliverdin oxidiert, wobei jedoch nicht untersucht wurde, ob Wasserstoffperoxid in dem Reaktionsprodukt enthalten ist. Es wird auch'beschrieben, daß eine Enzymzubereitung aus Agaricus bisporus spezifisch mit Bilirubin unter Farbänderung reagiert (JA-OS Nr. 11194/1983). Das Reaktionsprodukt, das aus der Enzymzubereitung und Bilirubin erzeugt wird, ist eine Substanz, die einen Absorptionspeak bei ungefähr 510 nm besitzt und nach einer Anregung mit einer Strahlung mit einer Wellenlänge von 450 nm bei ungefähr 525 nm fluoresziert, wobei die Tatsache, ob Wasserstoffperoxid bei dieser Reaktion gebildet wird, davon abhängt, wie die Enzymzubereitung hergestellt wird. Ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten mit dieser Bilirubin-spezifischen Pilzenzymzubereitung wird vorgeschlagen, es ist jedoch sehr zweifelhaft, ob die Reaktion dieser Enzymzubereitung mit Bilirubin durch ein einziges Enzym oder durch ein System mehrerer Enzyme katalysiert wird. Da ferner keine ausreichende Beschreibung der Eigenschaften der Enzymzubereitung gegenüber Bilirubin vorliegt, stellt dieses Verfahren keine vorteilhafte Methode zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin dar.

Ferner findet man auch keinen Hinweis auf die Wirkung des Enzyms auf Albumin-gebundenes Bilirubin und Glucuronsäurekonjugiertes Bilirubin, d. h. auf die Formen von Bilirubin, die im Blutserum vorliegen. In neuerer Zeit wurde eine quantitative Bestimmung von Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten mit Bilirubinoxidase vorgeschlagen, die von dem Genus Myrothecium erzeugt wird (JA-OS 141783/1983). Dieses Enzym allein wirkt jedoch nicht auf Albumin-gebundenes Bilirubin, so daß ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin durch Zugabe eines grenzflächenaktiven Mittels etc. als Reaktionspromotor bekanntwurde (JA-OS 17999/1984).

Wie vorstehend erwähnt, wird Bilirubinoxidase zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin im Blutserum verwendet, zusätzlich dazu ist dieses Enzym auch zur Entfernung von Bilirubin geeignet, das Meßfehler bei der Analyse von anderen Testproben als Bilirubin verursacht. Zur Messung von Glukose oder Cholesterin im Blutserum wird eine kolorimetrische Methode angewendet, bei deren Durchführung Glukoseoxidase oder Cholesterinoxidase auf Blutserum einwirken gelassen wird und das gebildete Wasserstoffperoxid mit Peroxidase abgefangen wird. Dieses Verfahren wird für Routineuntersuchungen angewendet. Insbesondere wurde eine Farbentwicklungsmethode mit 4-Aminoantipyrinphenol ein wesentlicher Teil der enzymatischen Methode infolge seiner Einfachheit und Schnelligkeit sowie aufgrund der Stabilität des Reagenses. Diese kolorimetrische Methode sieht die Messung des gebildeten roten Chinonfarbstoffs bei 500 nm vor, die Gegenwart von Bilirubin im Blutserum bewirkt jedoch einen negativen Fehler. Dadurch, daß Bilirubinoxidase auf das Blutserum vor der Entfernung von Bilirubin einwirkt, worauf Glukoseoxidase oder Cholesterinoxidase auf das Blutserum einwirkt, läßt sich der genaue Glukosewert

3g oder Cholesterinwert des Blutserums erhalten.

—Ρ —

Bei der Analyse von verschiedenen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten, wie Blutserum, Urin etc., wurden bisher folgende Methoden, welche die Entfernung von Bilirubin aus biologischen Flüssigkeiten einschließen, verwendet: Die enzymatische quantitative Bestimmung von Glukose in biologischen Flüssigkeiten durch Zugabe einer Spurenmenge von Kaliumferrocyanid oder Kaliumferricyanid zur einer Testprobe und Beseitigung der Wirkung der reduzierenden Substanzen, wie Bilirubin, unter Anwendung eines Oxidations-Reduktions-Potentials (JA-PS 25840/1980); die Messung von Komponenten in biologischen Flüssigkeiten durch Herabsetzung des Reduktionsvermögens von Bilirubin mit einem Oxidationsmittel (JA-OS 107161/1981); die Messung der gesuchten Verbindungen in biologischen Flüssigkeiten durch Abbau von Bilirubin mit der vorstehend erwähnten Bilirubin-spezifischen Pilzenzymzubereitung zur Beseitigung seiner Wirkung (JA-OS 11194/1983) oder dgl. Von den Bilirubin-spezifischen Pilzenzymzubereitungen, die zur Durchführung der zuletzt genannten Methode eingesetzt werden, existiert eine, die Wasserstoffperoxid bildet.

Eine derartige Methode ist keine vorteilhafte Meßmethode, die sich einer Reaktion für die quantitative Bestimmung von einigen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten mit Oxidase, Peroxidase und einem Wasserstoff liefernden Chromögen bedient. In neuerer Zeit wurde ein Verfahren zum Messen von anderen Komponenten als Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten durch Beseitigung der Wirkung von Bilirubin, das gleichzeitig in biologischen Flüssigkeiten vorliegt, unter Verwendung von Bilirubinoxidase bekannt, welche BiIirubin oxidiert, jedoch kein Wasserstoffperoxid bildet (JA-OS 18000/1984). Charakteristisch für dieses Verfahren ist die Tatsache, daß eine Substanz, welche die Reaktion von Bilirubinoxidase (beispielsweise ein grenzflächenaktives Mittel), und eine Substanz, welche die Farbentwicklungsreaktion beeinflußt (beispielsweise Natriumflu orid), zusam-

men mit der Bilirubinoxidase zugesetzt werden. Diese BiIirubinoxidase wirkt bei der Farbentwicklungsmethode mit Peroxidase und einem Wasserstoff liefernden Chromogen, das für die Aufspürung von Wasserstoffperoxid eingesetzt wird, dahingehend, daß eine quantitative Oxidationskondensation des Chromogens, beispielsweise 4-Aminoantipyrin und Phenol, verursacht wird, wodurch das Chromogen rot gefärbt wird. Wird die Substanz, welche die Farbentwicklungsreaktion beeinflußt, der Reaktionslösung zugesetzt, dann wird die Wirkung von Bilirubinoxidase gleichzeitig gestört, so daß eine gründliche Entfernung von Bilirubin nicht möglich ist, so daß es schwierig ist, einen genauen Meßwert der Komponenten in biologischen Flüssigkeiten zu erhalten.

Bei einem Screening-Test unter Einsatz von Bilirubinoxidase erzeugenden Stämmen, die zu der Klasse Basidiomycetes gehören, wurde gefunden, daß Schizophyllum commune Bilirubinoxidase in dem Filtrat von Kulturbrühen erzeugt (JA-OS 10149/1983). Da jedoch dieses Enzym etwas instabil und für eine industrielle Produktion ungeeignet ist, wurden weitere Untersuchungen im Zusammenhang mit Bilirubinoxidase durchgeführt, die durch Stämme erzeugt wird, die zu der Klasse Basidiomycetes gehören. Dabei wurde gefunden, daß Trachyderma tsunodae, der zu dem Genus Trachyderma gehört, eine erhebliche Menge an Bilirubinoxidase mit ausgezeichneten Eigenschaften in dem Filtrat von Kulturbrühen erzeugt, wobei auch die enzymologischen Eigenschaften dieses Enzyms untersucht wurden. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß das erfindungsgemäße Enzym eine neue BiIirubinoxidase ist, die sich von den bekannten unterscheidet. Das erfindungsgemäße Enzym wird als neue Bilirubinoxidase M-1 bezeichnet.

Die Erfindung betrifft demgemäß die neue Bilirubinoxidase M-1 sowie eine Reagenszubereitung für Bilirubin, wobei die-

se Zubereitung dadurch gekennzeichnet ist, daß sie die neue Bilirubinoxidase M-1 enthält.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur quanti- ° tativen Bestimmung von Bilirubin, welches darin besteht, daß die vorstehend beschriebene Reagenszubereitung, welche die neue Bilirubinoxidase M-1 enthält, auf eine Bilirubin enthaltende Testlösung einwirken gelassen wird, worauf kolorimetrisch die Veränderung des dabei erzeugten Bilirubins gemessen wird, oder welches darin besteht, 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (nachfolgend als MBTH bezeichnet) und die Reagenszubereitung, welche die neue Bilirubinoxidase M-1 enthält, auf eine Bilirubin enthaltende Testlösung einwirken zu lassen und kolorimetrisch den gebildeten blauen Farbstoff in saurem Zustand zu messen.

Außerdem betrifft die Erfindung ein neues Analyseverfahren zum Analysieren von anderen Komponenten als Bilirubin in einer Bilirubin enthaltenden Testlösung unter Anwendung einer Reaktion mit Oxidase, Peroxidase und einem Wasserstoff liefernden Chromogen, wobei bei dieser Methode Bilirubin als Wirkstoff dient. Dieses neue Analyseverfahren zeichnet sich dadurch aus, daß (a) die vorstehend beschriebene Reagenszubereitung, welche die neue Bilirubinoxidase m-1 enthält, auf eine Testlösung zur Beseitigung der beeinflussenden Wirkung des gleichzeitig vorliegenden Bilirubins einwirken gelassen wird und (b) die gewünschte Komponente in der zurückbleibenden Testlösung analysiert wird.

Ferner wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der neuen Bilirubinoxidase M-1 zur Verfügung gestellt, welches darin besteht, den Bilirubinoxidase M-1 erzeugenden Stamm, der zu dem Genus Trachyderma gehört, zu bebrüten und die neue Bilirubinoxidase M-1 aus der Kulturbrühe

35 ab zu trennen.

Die Erfindung wird näher unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Beziehung zwischen dem pH und der Aktivität der neuen Bilirubinoxidase M-1, die erfindungsgemäß erhalten wird;

Fig. 2 die Beziehung zwischen der Temperatur und der

Aktivität; 10

Fig. 3 die Beziehung zwischen dem pH und der Aktivität

nach 60-minütiger Behandlung der neuen Bilirubinoxidase M-1 bei 37°C und wechselnden pH-Werten;

Fig. 4 die Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität nach 10-minütiger Behandlung der neuen Bilirubinoxidase M-1 bei einem pH von 7,0 und wechselnden Temperaturen;

Fig. 5 eine graphische Darstellung, welche das Absorptionsspektrum (gestrichelte Linie) eines Reaktionsproduktes (roter Farbstoff) zwischen Bilirubin und dem MBTH, das mit der neuen Bilirubinoxidase M-1 erhalten wird, zeigt, sowie eine graphische Darstellung, welche das Absorptionsspektrum (ausgezogene Linie) des blauen Farbstoffs wiedergibt, der unter mit Chlorwasserstoffsäure angesäuerten Bedingungen erzeugt wird;

Fig. 6 eine Eichkurve, die gemäß Beispiel 2 erhalten wird, wobei diese Kurve die Beziehung zwischen der BiIirubinkonzentration und dem Unterschied des Absorptionsvermögens wiedergibt;

35. Fig. 7 eine Eichkurve, die gemäß Beispiel 3 erhalten wird,

wobei diese Kurve die Beziehung zwischen der BiIirubinkonzentration und dem Unterschied des Absorptionsvermögens wiedergibt;

Fig. 8 eine Eichkurve, die gemäß Beispiel 4 erhalten wird, wobei diese Kurve die Beziehung zwischen der BiIirubinkonzentration und dem Unterschied des Absorptionsvermögens zeigt.

Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm gehört zu dem Genus Trachyderma der Klasse Basidiomycetes, beispielsweise handelt es sich um Trachyderma tsunodae K-2593. Dieser Stamm wurde im Jahre 1977 aus dem Fruchtkörper isoliert, der auf einem toten Buchenstamm in der Tottori Prefecture

15 in Japan wuchs.

Die formalen Eigenschaften des Fruchtkörpers und die Sporen dieses Stamms sind wie folgt:

20 Einjährig, stielfrei.

Hut: halbrund, Spatel- oder Fächerform mit glatter oberer Oberfläche oder Form eines niedrigen Berges; 5 bis 15 cm χ 3 bis 15 cm Querschnitt; die Kutikula ist nicht glänzend und dunkel zimtfarben und bedeckt mit kleinen Runzeln und kornähnlichen harten Spitzen, so daß er ein grobes Aussehen besitzt. Er ist im allgemeinen mit dunkelbraunen Sporen bedeckt. Das Fleisch ist praktisch weiß und lederartig und zäh während des Wachsens und bildet ein sehr hartes holzartiges Gewebe bei trockenem Wetter; unter der Oberfläche ist er praktisch weiß und geht später in dunkelbraun über.

Poren: Ungefähr 1,5 cm lang, hell zimtfarben, die Mündungen sind eng.

Sporen: Ganoderma-Typ, hellgelb, eiförmig-ellipsoid mit einer Größe von 20-24 μΐη χ 14-16,5 μπι; die äuße

re Membran ist deutlich von der inneren Membran unterscheidbar.

Bei einem Vergleich der vorstehenden Eigenschaften mit den Angaben in den folgenden Büchern: Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo: Colored Illustrations of Fungi of Japan, Bände 1 und 2 (veröffentlicht von Hoiku-sha Co., Osaka, Japan) und Seiya Ito: Mycological Flora of Japan, Band 2, Nr. 4, 1955 (veröffentlicht von Yoken-do, Tokyo, Japan) geht hervor, daß dieser Stamm der Stamm Trachyderma tsunodae ist. Dieser Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-387 hinterlegt.

Jede bekannte Nährmittelquelle kann dem Kulturmedium zugesetzt werden, falls es von dem eingesetzten Stamm gebraucht wird. Als Kohlenstoffquelle kommen beispielsweise Glycerin, Glukose, Stärke, Rohrzucker, Maltose, Lactose, Dextrin, öle und Fette oder dgl. infrage. Als Stickstoffquelle werden Hefeextrakt, Pepton, Maisflüssigkeit, entfettete Sojabohnen, Sojabohnenpulver, Mehlextrakt oder dgl. eingesetzt. Auch anorganische Substanzen und Metallsalze, wie Phosphate, Kaliumsalze, Magnesiumsalze oder dgl., können zugesetzt werden. Da die neue erfindungsgemäße Bilirubinoxidase M-1 ein Kupferenzym ist, steigert der Zusatz von Kupfersulfat zu dem Kulturmedium erheblich den Enzymausstoß. Beispielsweise bewirkt der Zusatz von 5 ppm Kupfersulfat die Erzeugung der neuen Bilirubinoxidase M-1 um das 5- bis 10-fache des Gewichts gegenüber dem Weglassen von Kupfersulfat.

Beim Züchten des Stammes, der zu der Klasse Basidiomycetes gehört, schwankt die erzeugte Menge an der erfindungsgemäßen neuen Bilirubinoxida.se M-1 weitgehend in Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen. Im allgemeinen beträgt jedoch die Züchtungstemperatur vorzugsweise 20 bis 35°C, der pH des Kulturmediums liegt vorzugsweise zwischen 4 und 7 und die Erzeugung der neuen Bilirubinoxidase M-1 gemäß vorliegender Erfindung erreicht ein Maximum bei einer belüfteten und gerührten Kultur während 3 bis 15 Tagen. Natürlich sollten die Züchtungsbedingungen dahingehend optimiert werden, daß eine maximale Ausbeute an der neuen Bilirubinoxidase M-1 erhalten wird, und zwar bezüglich der Stämme und Zusammensetzungen des eingesetzten Kulturmediums .

Die durch den erfindungsgemäß definierten Stamm eingesetzte neue Bilirubinoxidase M-1 liegt in der Kulturbrühe vor und kann beispielsweise durch Ausfällen abgetrennt werden, und zwar durch Zugabe von 50 bis 80 % (Volumen/ Volumen) eines organischen Lösungsmittels (beispielsweise Alkohol oder Aceton) oder von 20 bis 60 % (Gewicht/Volumen) eines Ausfällungsmittels (beispielsweise Ammoniumsulfat) zu dem Filtrat der Kulturbrühe. Der erhaltene Niederschlag wird durch Dialyse oder Sephadexbehandlung zur Gewinnung einer rohen Enzymlösung entsalzen. Zur Reinigung der erhaltenen rohen Enzymlösung wird die Lösung wie folgt behandelt. Die Lösung wird an einer DEAE-Sephadex A-50-Säu-Ie adsorbiert, die zuvor mit 0,03M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden ist und das adsorbierte Material wird mit einer 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen und mit 0,3M Phosphatpuffer (pH 7,0) zum Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert. Diese aktive Fraktion wird dann konzentriert und durch Ultrafiltration entsalzen, an einer DEAE-Sepharose CL-6B Säule, die mit 0,03M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden ist, adsorbiert, worauf das adsor-

'bierte Material mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,2M Phosphatpuffer (pH 7,0) zum Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert wird. Diese aktive Fraktion wird dann mit einer Kollodionmembran konzentriert, durch eine Sephacryl S-200-Säule, die zuvor mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden ist, gelfiltriert und die erhaltene aktive Fraktion gegenüber 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und zur Gewinnung eines gereinigten Enzympulvers gefriergetrocknet. Dieses Pulver besteht aus einer einzigen Substanz beim Analysieren durch Polyacrylamidgelscheibenelektrophorese.

Die verschiedenen Eigenschaften der erfindungsgemäßen neuen Bilirubinoxidase M-1 sind folgende:

I. Enzymologische und physikalisch-chemische Eigenschaften

(1) Wirkung:

Das erfindungsgemäße Enzym besitzt eine Wirkung zur Oxidation von Bilirubin (albumingebundene, glucuronsäurekonjugierte und freie Typen) in Gegenwart von Sauerstoff zu einer praktisch farblosen Substanz über Biliverdin und dann zu einer hellvioletten Substanz, bildet jedoch kein

25 Wasserstoffperoxid.

(2) Substratspezifität:

Das erfindungsgemäße Enzym wirkt auf Bilirubin sowie auf Biliverdin, wobei jedoch die Oxidationsgeschwindigkeit des letzteren ungefähr 12 % der Oxidationsgeschwindigkeit des ersteren beträgt. Es wirkt ferner auf Hydrochinon, Brenzchatechin, p-Phenylendiamin, Pyrogallol, 4-Aminoantipyrin und ein Monophenol, übt jedoch keine Wirkung auf Hämin, Vitamin B^₂ sowie Hämoglobin aus.

343600S

-16-1 (3) Optimaler pH und pH-Stabilität:

Das erfindungsgemäße Enzym besitzt einen optimalen pH in der Gegend von 5,5 (Fig. 1) und ist stabil zwischen einem pH von 5 und 9 bei einer Behandlung während 60 min bei 37°C und wechselnden pH-Werten (Fig. 3).

(4) Optimale Temperatur und thermische Stabilität:

Das erfindungsgemäße Enzym besitzt eine optimale Temperatur in der Gegend von 50⁰C (Fig. 2) und ist bis zu 55°C stabil, wenn es während 10 min bei einem pH von 7,0 und wechselnden Temperaturen behandelt wird (Fig. 4).

15 (5) Molekulargewicht:

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms beträgt ungefähr 83.000, ermittelt durch die Gelfiltrationsmethode mit Sephacryl S-200 (erzeugt von der Pharmacia).

(6) Homogenität:

Eine Scheibenelektrophorese wurde unter Verwendung von 7,5 % Polyacrylamidgel (pH 9,4) zur Durchführung einer Proteinverfärbung und zur Aktivitätsverfärbung durchgeführt. Eine kolorierte Proteinbande wurde festgestellt, was bedeutet, daß das erfindungsgemäße Enzym eine einzige Substanz ist. Da dieses Enzym eine Wirkung dahingehend ausübt, daß 4-Aminoantipyrin und Phenol quantitativ eine rote Farbe entwickeln, wurde bei der Durchführung einer Aktivitätsverfärbung eine rote Bande an der gleichen Position festgestellt, an der sich die gefärbte Bande des Proteins befand.

35 (7) Isoelektrischer Punkt:

Der isoelektrische Punkt des erfindungsgemäßen Enzyms beträgt 3,92+0,05, ermittelt durch die isoelektrische Fokusierungsmethode mit Pharmalyte (pH 3 bis 10, erzeugt von der Pharmacia).

(8) Wirkung auf Metallionen, beeinflussende Mittel etc.:

Das erfindungsgemäße Enzym wird durch L-Ascorbinsäure, Natriumazid, Dithiothreit, Kaliumcyanid, L-Cystein, EDTA,

2+ Fe oder dgl. (Tabelle T) inhibiert:

	Tabelle 1	Prozent der Beein
		flussung (%)
Additiv		100
L-Ascorbinsäure	(1 mM)	60
Natriumazid	(1 mM)	100
Natriumazid	(5 mM)	86
Dithiothreit	(1 mM)	84
Kali.umcyanid	(1 mM)	74
L-Cystein	(1 mM)	59
EDTA	(1 mM)	57
Fe^{2 +}	(1 mM)	38
Reduziertes Glutathion	(1 mM)	34
o-Phenanthrolin	(1 mM)	31
2-Mereaptoethano1	(1 mM)	30
α,α¹-Dipyridyl	(1 mM)	10
Jodes sigsäure	(1 mM)

(9) Sichtbares Absorptionsspektrum:

Beim Messen des sichtbaren Absorptionsspektrums einer Lösung des erfindungsgemäßen Enzyms wird ein Absorptionsmaximum bei 610 nm festgestellt, was die Gegenwart von blauem Protein bedeutet.

-Ιδ-

(10) Zuckergehalt:

Eine Scheibenelektrophorese wurde unter Verwendung von 7,5 % Polyacrylamidgel (pH 9,4) zur Durchführung einer PAS-Verfärbung (Analytical Biochemistry, Band 30, 148 (1969)) durchgeführt, wobei festgestellt wurde, daß die gleiche Position wie die des gefärbten Proteins verfärbt wurde. Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße Enzym ein Glukoprotein enthaltender Zucker ist. Der Zuckergehalt beträgt ungefähr 4,5 %, wie anhand der Phenol/Schwefelsäure-Methode ermittelt wurde.

(11) Kupfergehalt:

Der Kupfergehalt des erfindungsgemäßen Enzyms wird unter Verwendung eines Atomabsorptionsanalysatorsermittelt, wobei gefunden wurde, daß 1 Mol des erfindungsgemäßen Enzyms 4 Mol Kupfer enthält.

20 (12) Bestimmung der enzymatischen Aktivität:

Die enzymatische Aktivität wird durch Messen einer Abnahme der Absorption von Bilirubin bei 460 nm gemessen. Dies bedeutet, daß eine Reaktion bei 37 C während 10 min durchgeführt wurde, wobei 3,0 ml einer Reaktionsmischung verwendet wurden, die 0,1 ml OMEGA-Chemistry Control Serum Elevated Bilirubin (hergestellt von der Hyland Co., USA), 300 Mikromole Phosphatpuffer (pH 7,0) und 0,1 ml einer entsprechend verdünnten Enzymlösung enthielt, wobei eine Abnähme der Absorption bei 460 nm infolge Bilirubin gemessen wurde. Eine Einheit der neuen Bilirubinoxidase M-1 wird als die Menge des Enzyms definiert, die 1 Mikromol Bilirubin pro Min in dem vorstehend angegebenen Reaktionssystem oxidiert.

Ein Vergleich der neuen erfindungsgemäßen Bilirubinoxidase M-1 mit herkömmlicher Bilirubinoxidase geht aus der folgenden Tabelle 2 hervor.

Tabelle 2

	Neue Bilirubinoxidase M-1 gemäß vorliegender Erfin dung	Enzym von Agaricus bis- porus origin *1	Enzym von Myrothecium ver- rucaria origin *2
Wirkung	Bilirubin-» Biliverdin-» hell grüne Substanz -» hellrote Substanz -> praktisch farblo se Substanz. Bildet kein Wasserstoffper oxid.	Wirkt auf Bilirubin al lein unter Verursachung einer Veränderung der Farbe. Bildet Wasserstoffper oxid.	Bilirubin -> grüne Substanz •^ hellgrüne Substanz ■* hell - violette Substanz. Bildet kein Wasserstoffper oxid.
Substrat- spezifi- tät	Bilirubin 100 % Biliverdin 12 %	Wirkt auf Bilirubin allein	Bilirubin 100 % Biliverdin 1 %
Stabi lität	Stabil bis 55°C während 10- minütiger Behandlung bei einem pH von 7,0. Stabil in dem pH-Bereich von 5 bis 9 während 60-minütiger Behand lung bei 37°C	Stabil in dem pH-Bereich von 7,3 bis 9,0	Stabil bis zu 40⁰C während 15-minütiger Behandlung bei einem pH von 8,0. Stabil in dem pH-Bereich von 6 bis 10 während 60-minütiger Behandl· lung bei 37°C I
Optima le Tem peratur	50⁰C	ungefähr 20 C bis unge fähr 50⁰C	I 40°C
Optimaler pH	5,5	7,3 bis 8,0	6,0 bis 7,0
Molekular gewicht	ungefähr 83.000		ungefähr 52.000

I * I » · I

cn ο ο cn

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Isoelektrischer Punkt	3,92+0,05	4,1
Beeinflussende Mittel	L-Ascorbinsäure, Natriumazid, Dithiothreit, Kaliumcyanid	Fe , Kaliumcyanid, Natriumazid, Thioharn stoff
Sichtbare Ab sorption	Absorptionsmaxiirum bei 610 nra	Kein Absorptionsmaximum in der Gegend von 375 nn und 460 nm
Zuckergehalt	ungefähr 4,5 %	ungefähr 7,8 %
Kupfergehalt	4 Mol pro Mol Enzym	1 Mol pro Mol Enzym
K Wert m	1,67 χ 10~⁴ M (Bilirubin)

*1 In der JA-Patentveröffentlichung 11194/1983 beschriebenes Enzym
*2 In der JA-OS 141783/1983 beschriebenes Enzym.

CO CD O O

Die Reagenszubereitung, welche die neue Bilirubinoxidase M-1 gemäß vorliegender Erfindung enthält, kann neben der Bilirubinoxidase M-1 herkömmliche Komponenten enthalten. Insbesondere begünstigt eine Zugabe von Alkalimetallsalzen oder Erdalkalimetallsalzen von Deoxycholinsäure (beispielsweise Natriumdeoxycholat) die Reaktion. Die Menge des in der Reagenszubereitung enthaltenen Enzyms ist wenigstens nicht geringer als 0,0001 Einheiten und vorzugsweise 10 bis 0,001 Einheiten und wird entsprechend der Meßzeit und der Verwendungszwecke gesteuert. Natriumdeoxycholat ist in einer Menge von 0,01 und 1,0 und vorzugsweise 0,05 und 0,5 % enthalten. Ferner können die bekannten Pufferlösungen, Stabilisierungsmittel für Enzyme etc. erforderlichenfalls zugesetzt werden. Die Reagenszubereitung wird nach bekannten Methoden hergestellt, beispielsweise durch Auflösen, Gefriertrocknen, Imprägnieren auf eine Trägerfolie oder dgl. Auch kann das Enzym in einer unlöslichen Träger-gebundenen Form verwendet werden, die nach bekannten Methoden hergestellt wird.

II. Quantitative Bestimmung von Bilirubin

Erfindungsgemäß kann der Bilirubingehalt von Bilirubin enthaltenden Testlösungen, beispielsweise biologischen Flüssigkeiten wie Blutserum, Urin etc., sowie ihrer Vorbehandlungslösungen quantitativ in der Weise bestimmt werden, daß die vorstehende Eigenschaft (Wirkung (1)) der neuen Bilirubinoxidase M-1 ausgenutzt wird. Zunächst ergibt sich die folgende quantitative Bestimmungsmethode: Da die erfindungsgemäße neue Bilirubinoxidase M-1 Bilirubin in Gegenwart von Sauerstoff zu einer praktisch farblosen Substanz über Biliverdin und dann zu einer hellvioletten Substanz oxidiert, kann die quantitative Be-Stimmung von Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten, wie

Blutserum, Urin etc., dadurch ermöglicht werden, daß man die neue Bilirubinoxidase M-1 auf die Testlösung einwirken läßt und die Geschwindigkeit der Abnahme der Absorption bei 460 nm mißt. Beispielsweise kann die BiIirubinkonzentration der Testprobe (beispielsweise Blutserum) in der Weise gemessen werden, daß zu 10 bis 100 μΐ der Testprobe 0,1 bis 2,0 Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-1 und einer Pufferlösung (pH 5,5 bis 7,0) gegeben werden, die Reaktion bei 20 bis 40⁰C und vorzugsweise 37°C während 1 bis 30 min und vorzugsweise 5 bis 10 min durchgeführt wird und der Unterschied der Absorption bei 460 nm vor und nach der Zugabe der neuen Bilirubinoxidase M-1 ermittelt wird. Außerdem wird die Reaktion der neuen Bilirubinoxidase M-1 merklich durch Natriumdeoxycholat gegenüber Natriumcholat, welches ein Reaktionspromotor für die bisher bekannten Bilirubinoxidasen ist, begünstigt (vgl. Tabelle 3).

20 Tabelle 3

Additiv (Endkonzentration, Relative Aktivität (%) 0,167 %)

Keine Zugabe 100

25 Natriumcholat 120

Natriumdeoxycholat 1650

Wie vorstehend ausgeführt, wirkt die neue Bilirubinoxidase M-1 selbst in jeder Form auf im Blut vorliegendes Bilirubin ein, d. h. (T) die Albumin-gebundene Form,

(5) die Glucuronsäure-konjugierte Form und Q) die freie Form. Kein Enzym mit einer derartigen Eigenschaft ist bisher bekannt gewesen.

Bezüglich dieser Eigenschaft ist dieses Enzym den bekannten Enzymen bei der qualitativen Bestimmung von Bilirubin sowie bei der Beseitigung des weiter unten beschriebenen

-23-1 Bilirubineffektes überlegen.

Ferner bietet sich die folgende quantitative BeStimmungsmethode an: Es wurde gefunden , daß die neue Bilirubinoxidase M-1 die Kondensationsreaktion zwischen MBTH und Bilirubin katalysiert, und daß die quantitative Bestimmung von Bilirubin durch kolorimetrische Bestimmung des gebildeten Kondensationsproduktes in saurem Zustand möglich ist. Werden beispielsweise 0,1 bis 3 Mikromol MBTH, eine Pufferlösung (pH 5,0 bis 7,0) und 0,005 bis 0,t Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-1 zu 10 bis 100 μΐ einer Testprobe (beispielsweise Blutserum) zugegeben und die Reaktion bei 20 bis 4o°C und vorzugsweise 37°C während 1 bis 20 min und vorzugsweise 3 bis 6 min durchgeführt, dann wird ein roter" Farbstoff mit einer maximalen Absorption in der Gegend von 520 nm und 550 nm gebildet. Dieser rote Farbstoff wird unter sauren Bedingungen, beispielsweise unter chlorwasserstoffsauren oder schwefelsauren Bedingungen, in einen blauen Farbstoff mit einer maximalen Absorption bei 610 nm und einem großen molekularen Extinktionskoeffizienten umgewandelt. Folglich kann Bilirubin in Testlösungen dadurch quantitativ bestimmt werden, daß die Absorption bei 610 nm dieses blauen Farbstoffs gemessen wird. Werden beispielsweise 1 Mikromol MBTH, 1,0 ml eines 0,3 M Citratpuffers (pH 5,5) und 0,05 Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-1 zu 100 μΐ OMEGA-Chemistry Control Serum Elevated Bilirubin (20 mg/dl; hergestellt von Hyland Co., USA) gegeben, das Gesamtvolumen der Mischung auf 2,0 ml eingestellt und die Reaktion bei 37°C während 5 min durchgeführt, dann wird ein roter Farbstoff mit einer maximalen Absorption in der Gegend von 520 nm und 550 nm gebildet. Wird 1,0 ml 1N HCl dieser Substanz zugesetzt und das System angesäuert, dann wird ein blauer Farbstoff mit einer maximalen Absorption bei 610 nm und einem großen molekularen Extinktionskoeffi-

zienten gebildet (Fig. 5). Die Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Wellenlänge (nm) (Abszisse) und Absorptionsvermögen (Ordinate) wiedergibt. In der Fig. 5 wird das Absorptionsspektrum des roten Farbstoffs durch eine gestrichelte Linie wiedergegeben und diejenige des blauen Farbstoffs durch eine ausgezogene Linie.

III. Bilirubinwirkung-beseitigende Methode bei der Analyse von Komponenten in biologischen Flüssigkeiten

Zur Analyse von verschiedenen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten, wie Blutserum, Urin etc., unter Anwendung der Reaktion mit Oxidase, Peroxidase und einem Wasserstoff liefernden Homogen ist eine Methode zur Entfernung des vorliegenden Bilirubins mit der neuen Bilirubinoxidase M-1 möglich. Wie im Zusammenhang mit den Eigenschaf tn ((6) Homogenität) der Bilirubinoxidase M-1 beschrieben, übt dieses Enzym bei der Farbentwicklungsmethode mit Peroxidase und einem Wasserstoff liefernden Homogen, das für die Aufspürung von Wasserstoffperoxid beabsichtigt ist, eine Wirkung dahingehend aus, daß eine quantitative Oxidationsbindung des Chromogens, beispielsweise eines 4-Aminoantipyrin/Phenol-Systems, erfolgt, wodurch das Chromogen rot gefärbt wird. Aus diesem Grunde können bei einem Verfahren zur Messung der verschiedenen Komponenten in biologischen Flüssigkeiten, wie Glukose, Gesamtcholesterin etc., die genauen gemessenen Werte dieser Komponenten dadurch erhalten werden, daß zuvor die Testprobe mit der neuen Bilirubinoxidase M-1 zur Beseitigung der Wirkung von Bilirubin, das eine reduzierende Substanz ist, behandelt wird, worauf ein geeignetes Mittel, wie Natriumazid (vgl. die Eigenschaft (8) Wirkung von Metallionen, Einwirkungsmittel etc.) zugegeben wird, um vollständig auf die Wirkung der neuen Bilirubinoxidase M-1 auf das Wasserstoff liefernde Chromogen einzuwirken.

Die Reaktion zwischen der neuen Bilirubinoxidase M-1 und einer Testprobe kann unter geeigneten Bedingungen je nach den zu bestimmenden Komponenten in biologischen Flüssigkeiten und je nach den angewendeten Bestimmungsmethoden durchgeführt werden. Im allgemeinen werden 0,01 bis 0,20 Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-I und eine Pufferlösung (pH 5,5 bis 7,0) zu 10 bis 100 μΐ einer Testprobe, wie Blutserum, Urin etc., zugegeben. Nach dem Durchführen der Reaktion bei 20 bis 40⁰C, vorzugsweise bei 37°C, während 1 bis 30 min und vorzugsweise 10 bis 20 min wird ein Einwirkungsmittel auf die neue Bilirubinoxidase M-1 zur Einstellung einer Endkonzentration von 1 bis 50 mM zugesetzt. Beispielsweise wird Natriumazid vorzugsweise bis zur Einstellung einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben. Die anschließende Behandlung kann nach herkömmlichen Meßmethoden für jede Komponente durchgeführt werden. Ferner kann bei der vorstehend beschriebenen Behandlungsmethode eine derartige Modifizierung angewendet werden, daß ein Einwirkungsmittel für die neue Bilirubinoxidase M-1 zuvor dem Reagens für die Messung einer jeden Komponente zugesetzt wird, worauf die erhaltene Mischung der Testprobe zugegeben wird, die mit der neuen Bilirubinoxidase M-1 behandelt worden ist. Bei der Vorbehandlung der Testprobe mit der neuen BiIirubinoxidase M-1 ermöglicht es die Zugabe von Natriumdeoxycholat, einem die Reaktion fördernden Mittel (Endkonzentration 0,05 bis 0,5 %), die Menge an Enzym, das zur Vorbehandlung verwendet wird, herabzusetzen und auch die Vorbehandlungszeit zu verkürzen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

-26-1 Beispiel 1

Herstellung der neuen Bilirubinoxidase M-1

Ein Schrägkulturmedium aus 2 % Glukose, 0,5 % Ebios und 1,5 % Agar (Ebios-Medium) wird mit Trachyderma tsunodae K-259 3 beimpft und das Züchten wird in der Weise durchgeführt, daß das Medium 1 Woche lang bei 25°C zur Gewinnung eines Impfpilzes gehalten wird. Getrennt davon werden 100 ml eines Kulturmediums aus 2,0 % Glycerin, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH₂PO₄ und 0,1 % MgSO₄· 7H₂O in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben. Nach einer Sterilisation bei 120 C während 20 min wird er abgekühlt und mit dem vorstehend beschriebenen Impfpilz beimpft. Anschließend wird das Züchten bei 27°C während 7 Tagen zur Herstellung einer Kulturbrühe durchgeführt. Getrennt davon werden 20 1 eines Kulturmediums aus 2 % Glycerin, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH₃PO₄, 0,1 % MgSO₄'7H₂O, 5 ppm CuSO₄'5H₂O und 0,03 % eines Entschäumungsmittels (CB-442; hergestellt von der Nippon Yushi Co.) einem 30 1 Fermentationsgefäß zugegeben und bei 120⁰C während 20 min sterilisiert. Nach einem Abkühlen wird das Kulturmedium mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Kulturbrühe beimpft und das Züchten bei 27°C während 7 Tagen mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 20 l/min und einer Rührgeschwindigkeit von 25 0 Upm durchgeführt. Nach Beendigung des Züchtens werden die Myzeln durch Filtration entfernt, wobei ein Kulturfiltrat erhalten wird. Die Bilirubinoxidase M-1 Aktivität dieses Kulturfiltrats beträgt 1,08 Einheiten/ml. Ammoniumsulfat wird zu 17 1 dieses Kulturfiltrats bis zu einer 60 %igen Sättigung zugegeben. Nach einem Stehenlassen während eines ganzen Tages und einer Nacht wird der erhaltene Ammoniumsulfatniederschlag einen ganzen Tag und eine ganze Nacht gegenüber einer großen Menge einer 0,03M Phosphatpuffer-

lösung (pH 7,0) dialysiert. Die dabei erhaltene rohe Enzymlösung wird an einer Säule (so 11,0 cm χ 10 cm) aus DEAE-Sephadex A-50, das zuvor mit 0,03M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden ist, adsorbiert und das adsorbierte Material mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,3 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Die aktive Fraktion, und zwar ein Eluat, wird konzentriert und durch Ultrafiltration entsalzen und an einer Säule ({6 5,0 cm χ 5 cm) aus DEAE-Sepharose CL-6B, gepuffert mit 0,03 M Phosphatpuffer (pH 7,0) adsorbiert, und das adsorbierte Material wird mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,2M Phosphatpuffer (pH 7,0) zum Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert. Diese aktive Fraktion wird mit einer Kollodionmembran konzentriert und durch eine Säule ((ό 3,6 cm χ 90 cm) aus Sephacryl S-200, die zuvor mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden ist, gelfiltriert. Die dabei erhaltene aktive Fraktion wird gegen 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und nach einer Zugabe von Rohrzucker, einem Stabilisierungsmittel iⁿ einer Endkonzentration von 0,1 % gefriergetrocknet, wobei 760 mg eines gereinigten Enzympulvers erhalten werden. Die spezifische Aktivität dieses Pulvers beträgt 17,8 Einheiten/mg. Dieses Enzympulver ist eine einzige Substanz, wie eine Analyse durch Polyacrylamidgelscheibenelektrophorese ergibt. Die vorstehend beschriebene Reinigungsstufe geht aus der Tabelle 4 hervor.

-28-Tabelle 4

	Gesamtprotein- gehalt (mg)	Gesamtakti vität (U)	Spezifische Aktivität (U/mg)	Aus beute (%)
Kultur- filtrat	211500	17970	0,085	100
Aussalzen mit Ammo- niumsulfat	56670	19640	0,347	109
DEAE-Sepha- dex A-50	6400	18510	2,89	103
DEAE-Sepha- rose CL-6B	831	15560	18,7	86,6
Sephacryl S-200	421	13570	32,2	75,5

25 Beispiel 2

Quantitative Bestimmung von Bilirubin durch die 460 nm-Absorptions-Verminderungsmethode

Bilirubinlösungen, die 5 mg/dl, 10 mg/dl, 15 mg/dl, 20 mg/dl, 25 mg/dl sowie 30 mg/dl Bilirubin (Albumin-gebundener Typ, hergestellt von der Daiichi Kagaku Yakuhin Co.) enthalten, werden hergestellt. Zu 0,1 ml einer jeden dieser Lösungen werden 1,0 ml einer 0,3M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) und 0,5 Einheiten der neuen Bilirubin-

3A36005

oxidase M-1 gegeben. Nach einem Einstellen des Gesamtvolumens der Lösung auf 3,0 ml wird die Reaktion bei 37°C 10 min durchgeführt. Anschließend wird die Absorption bei 460 nm (^0Dp_rok_e) gemessen. Getrennt wird die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wiederholt, wobei jedoch keine neue Bilirubinoxidase M-1 zugesetzt wird, und zwar als Vergleichstest zur Ermittlung der Absorption

bei 460 nm (OD,. . ,) sowie des Unterschieds zwischen blind

OD,,. , und OD , ,AOD.,-. Die Ergebnisse gehen aus der Fig. 6 hervor. Die Fig. 6 zeigt eine graphische Darstellung, welche eine Eichkurve wiedergibt, welche die Beziehung zwischen der Bilirubinkonzentration (mg/dl) (Abszisse) und dem Unterschied des Absorptionsvermögens (AOD.,_Q) (Ordinate) wiedergibt.

Wie aus der Fig. 6 hervorgeht, ist es unter Einsatz der neuen Bilirubinoxidase M-1 gemäß vorliegender Erfindung möglich, genau Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten aufgrund einer Veränderung des Absorptionsvermögens bei

20 460 nm zu bestimmen.

Beispiel 3

Quantitative Bestimmung von Bilirubin durch die 460 nm-Absorptionsverminderungsmethode (Wirkung von Natriumdeoxycholat)

Die gleichen Bilirubinlösungen wie in Beispiel 2 werden hergestellt. Zu 0,1 ml einer jeden dieser Lösungen werden 1,0 ml einer 0,3M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0), 0,5 ml einer 1,2 % Natriumdeoxycholatlösung und 0,05 Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-1 gegeben. Nach einem Einstellen des Gesamtvolumens der Lösung auf 3,0 ml wird die Reaktion bei 37°C während 10 min durchgeführt. Anschließend wird die Absorption bei 460 nm

(OD , ) gemessen. Getrennt wird die gleiche Methode ohne Zugabe der neuen Bilirubinoxidase M-1 als Vergleichstest wiederholt und die Absorption bei 460 nm

(OD, , . ,) gemessen, wobei ferner der Unterschied zwischen blind

^0Dblind ^{und 0D}Prob ' ^^OD460' ^ermittelt wird. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle 7 hervor.

Wie aus der Fig. 7 ersichtlich ist, ist es durch Zugabe von Natriumdeoxycholat, einem die Reaktion begünstigenden Mittel für die neue Bilirubinoxidase M-1 zu einem System für die quantitative Bestimmung von Bilirubin möglich, die Menge des Enzyms in einem größstmöglichen Ausmaß auf ungefähr 1/10 gegenüber dem Weglassen von Natriumdeoxycholat herabzusetzen.

Beispiel 4

Quantitative Bestimmung von Bilirubin mit MBTH

Bilirubinlösungen, die 5 mg/dl, 10 mg/dl, 15 mg/dl sowie 20 mg/dl Bilirubin (Albumin-gebundener Typ, hergestellt von der Daiichi Kagaku Yäkuhin Co.) enthalten, werden hergestellt. Zu 0,1 ml einer jeden dieser Lösungen werden 1,0 ml eines 0,3 M Citratpuffers (pH 5,5), 0,1 ml 10 mM MBTH und 0,05 Einheiten der neuen Bilirubinoxidase M-1 gegeben. Nach dem Einstellen des Gesamtvolumens der Lösung von 2,0 ml wird die Reaktion bei 37⁰C während 5 min durchgeführt. Anschließend wird 1,0 ml einer 1N HCl zugesetzt und die Absorption bei 610 nm (OD , ) gemessen. Getrennt wird die gleiche Methode ohne Zusatz von Bilirubinoxidase M-1 als Vergleichstest durchgeführt, um eine Absorption bei 610 nm (OD,... J und den Unterschied zwischen OD_ , und OD,,. ,, A0D_ciri, zu gewin-

Prooe blind. biu

35 nen. Die Ergebnisse gehen aus der Fig. 8 herovr.

Die Fig. 8 zeigt eine graphische Darstellung einer Eichkurve, welche die Beziehung zwischen der Bilirubinkonzentration (mg/dl) (Abszisse) und dem Unterschied des Absorptionsvermögens (ÄOD_fi10) (Ordinate) wiedergibt.

Wie aus der Fig. 8 hervorgeht, ist es unter Einsatz der neuen erfindungsgemäßen Bilirubinoxidase M-1 möglich, genau das Bilirubin in biologischen Flüssigkeiten anhand einer Veränderung der Absorption bei 610 nm zu bestimmen.
10

Beispiel 5

Beiseitigung der Einwirkung von Bilirubin in einem Bestimmungssystem für Gesamtcholesterin im Blutserum

(1) Farbentwicklungsreagens:

167 mg 4-Aminoantipyrin, 1,32 g Phenol und 80 mg (100 Einheiten/mg) Peroxidase aus Meerrettich (Typ I, hergestellt von der Sigma Chemical Co., USA) werden in 100 ml einer 0,1M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) aufgelöst.

(2) Cholesterinesteraselösung: 25

Es wurde eine im Handel erhältliche authentische Probe (Cholesterinesterase-Takara, Produkt der Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan) in Form einer wäßrigen Lösung von gereinigter Cholesterinesterase verwendet (70 Einheiten/mg) (nach der Methode, wie sie in "Collection of Summaries of Lectures", Seiten 93, Great Meeting of Nippon Nogei-kagaku Kai im Jahr 1982, beschrieben wird).

5 mg dieser authentische Probe werden in 10 ml einer 0,1M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) (35 Einheiten/ ml) aufgelöst.

(3) Cholesterinoxidaselösung:

Es wurde eine im Handel erhältliche authentische Probe (Cholesterinoxidase-Takara, Produkt der Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan) in Form einer wäßrigen Lösung von gereinigter Cholesterinoxidase verwendet (15 Einheiten/mg) (nach der Methode, wie sie in "Collection of Summaries of Lectures", S. 99 des Great Meeting of Nippon Nogei-kagaku Kai im Jahr 1978 beschrieben wird). 10 mg dieser authentischen Probe werden in 5 ml einer 0,1M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) (30 Einheiten/ml) aufgelöst.

(4) Methode:

In ein Reagensglas werden 0,1 ml der neuen Bilirubinoxidase M-1 (0,02 Einheiten) 1 ml einer 0,3M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0), 0,3 ml einer 3 %igen Triton X-100 Lösung, 0,02 ml eines Vergleichsserums (erzeugt von der Hyland Co., USA) und 0,02 ml 20 mg/dl Albumin-gebundenem Bilirubin (erzeugt von der Daiichi Kagaku Yakuhin Co.) gegeben. Die Reaktion wird unter

Schütteln in einem Inkubator mit konstanter Temperatur (37°C) während 20 min durchgeführt. Danach werden 0,3 ml eines 50 mM Natriumazids, 0,3 ml des Farbentwicklungsmittels, 0,1 ml der Cholesterinesteraselösung, 0,1 ml der Cholesterinoxidaselösung und 0,76 ml destilliertes Wasser zugesetzt. Nach einem Durchführen der Reaktion während 5 min wird die Absorption bei 500 nm gemessen. Getrennt werden Vergleichstests ohne neue Bilirubinoxidase M-1 sowie ohne Zugabe von Albumin-gebundenem BiIirubin durchgeführt und die Absorption gemessen. In der vorstehend beschriebenen Weise wird die Eliminierung der Farbentwicklungsbeeinflussung von Bilirubin in einem Bestimmungssystem für Gesamtcholesterin im Blutserum unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle 5 hervor.

-33-1 Tabelle 5

^OD500 nm Prozentsatz (%)

5 Kein Zusatz von Albumingebundenem Bilirubin 0,160 100

neue Bilirubinoxidase M-1

keine Behandlung 0,127 79,4

20-minütige Behandlung 0,158 98,8

Wie aus der Tabelle 5 hervorgeht, wird es durch Anwendung

der erfindungsgemäßen Methode möglich, die Einwirkung

von Bilirubin zu eliminieren und dabei den genauen Wert

15 des Gesamtcholesterins im Blutserum zu ermitteln.

Beispiel 6

Beseitigung des Einflusses von Bilirubin in einem Bestimmungssystem für Gesamtcholesterin im Blutserum (Wirkung von Natriumdeoxycholat).

(1) Farbentwicklungsreagens: 25

Es wird das Farbentwicklungsreagens von Beispiel 5 verwendet .

(2) Cholesterinesteraselösung und Cholesterinoxidaselösung:

Die Enzymlösungen von Beispiel 5 werden verwendet.

(3) Methode:

In ein Reagensglas werden 0,1 ml der neuen Bilirubinoxidase M-1 (0,002 Einheiten) 1,0 ml 0,3M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0), 0,02 ml Kontrollserum (hergestellt von der Hyland Co., USA), 0,02 ml 20 mg/dl Albumin-gebundenem Bilirubin (hergestellt von der Daiichi Kagaku Yakuhin Co.), 0,25 ml einer 1,2 %igen Natriumdeoxycholatlosung und 0,11 ml destilliertes Wasser gegeben und die Reaktion unter Schütteln in einem auf einer konstanten Temperatur (37°C) gehaltenen Inkubator während 10 min durchgeführt. Anschließend werden 0,3 ml einer 3 %igen Triton X-100 Lösung, 0,3 ml einer 50 mM Natriumazidlösung, 0,3 ml des Farbentwicklungsreagenses, 0,1 ml der Cholesterinesteraselösung, 0,1 ml der Cholesterinoxidaselösung und 0,4 ml destilliertes Wasser zugesetzt. Nach einem Durchführen der Reaktion während 5 min wird die Absorption bei 5 00 nm gemessen. Getrennt werden Vergleichstests ohne Behandlung mit neuer Bilirubinoxidase M-1 bzw. ohne Zugabe von Albumin-gebundenem Bilirubin zur Durchführung der Absorption durchgeführt. In der vorstehend beschriebenen Weise wird die Wirkung von Natriumdeoxycholat zur Eliminierung der Farbentwicklungsbeeinflussung von Bilirubin in einem Bestimmungssystem auf Gesamtcholesterin im Blutserum unter-

25 sucht. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle 6 hervor.

Tabelle 6

Prozentsatz (%)

Keine weitere Zugabe von Albumin-gebundenem Bilirubin 0,159 100

Neue Bilirubinoxidase M-1

gg keine Behandlung 0,126 79,2

10-minütige Behandlung 0,158 99,4

Wie aus der Tabelle 6 hervorgeht, wird es durch Verwendung von Natriumdeoxycholat bei der Eliminierung der Einwirkung von Bilirubin möglich, die Gesamtmenge des Enzyms bei der Vorbehandlung herabzusetzen und auch die

5 Vorbehandlungszeit zu verkürzen.

Beispiel 7

Beseitigung der Einwirkung von Bilirubin in einem Bestimmungssystem für Glukose im Blutserum

(1) Farbentwicklungsreagens:

Es wird das Farbentwicklungsreagens von Beispiel 5 verwendet.

(2) Glukoseoxidaselösung:

20 mg Glukoseoxidase (hergestellt von der TOYOBO Co.; 100 Einheiten/mg) werden in 2 ml O,1M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) (1000 Einheiten/ml) aufgelöst.

(3) Methode:

In ein Reagensglas werden 0,1 ml der neuen Bilirubinoxidase M-1 (0,02 Einheiten) 1 ml 0,3M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 0,02 ml Kontrollserum (hergestellt von der Hyland Co., USA) und 0,02 ml 20 mg/dl Albumin-gebundenem Bilirubin (hergestellt von der Daiichi Kagaku Yakuhin Co.) gegeben und die Reaktion unter Schütteln in einem auf einer konstanten Temperatur (37 C) gehaltenen Inkubator während 20 min durchgeführt. Anschließend werden 0,3 ml einer 50 mM Natriumazidlösung, 0,3 ml des Farbentwicklungsreagenses, 0,1 ml der Glukoseoxidaselösung und 1,16 ml destilliertes Wasser zugesetzt. Nach dem Durchführen

der Reaktion während 10 min wird die Absorption bei 500 nm gemessen. Getrennt werden Vergleichstests ohne Behandlung mit der neuen Bilirubinoxidase M-1 bzw. ohne Zugabe von Albumin-gebundenem Bilirubin zur Messung der Adsorp-

tion durchgeführt. In der vorstehend beschriebenen Weise wird die Eliminierung der Farbentwicklungsbeeinflussung von Bilirubin in einem Bestxmmungssystem für Glukose im Blutserum unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms untersucht.
10

Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle 7 hervor.

Tabelle 7 15

OD₅₀₀ Prozentsatz (%)

Keine Zugabe von Albumin-gebundenem Bilirubin 0,193 100 20 Neue Bilirubinoxidase M-1

Keine Behandlung 0,148 76,7

20-minütige Behandlung 0,192 9 9,5

Wie aus der Tabelle 7 hervorgeht, wird es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, die Wirkung von Bilirubin zu eliminieren und dabei den genauen Wert von Glukose im Blutserum zu erhalten.

Claims

European Patent Attorneys Dr. MüUer-Bore und Partner · FOB 26 02 47 · D-8000 München 26 Deutsdie Patentanwälte Dr. W. Müller-ΒθΓέ f Dr. Paul Deufel Dipl.-Chem., Dipl.-Wirtsdi.-Ing. Dr. Alfred Schön Dipl.-Chem. Werner Hertel Dipl.-Phys. Dietrich Lewald Dipl.-Ing. Dr.-Ing. Dieter Otto Dipl.-Ing. Brit. Chartered Patent Agent B. David P. Wetters M. A. (Oxon) Ch. Chem. M. R. S. C. T 1593 S/sm Takara Shuzo Co., Ltd. 609, Takenaka-cho, Fushimi-ku, Kyoto, Japan Neue Bilirubinoxidase, diese enthaltende Zubereitung und ihre Verwendung Patentansprüche

1. Neue Bilirubinoxidase M-1 mit folgenden physikalischchemischen Eigenschaften:

10

(1) Wirkung: Oxidation von Bilirubin in Gegenwart von Sauerstoff zu einer praktisch farblosen Substanz über Biliverdin und dann zu einer hellvioletten Substanz, bildet jedoch kein Vlasserstoffperoxid.

(2) Substratspezifität: Wirkt auf Bilirubin und in einem gewissen Ausmaße auf Biliverdin sowie auf Phenol, Catechin und Hydrochinon.

D-8000 München 2 POB 26 02 47

Kabel:

Telefon

Telecopier Infotec 6400 B

Telex

(3) Optimaler pH und pH-Stabilität: Besitzt einen optimalen pH in der Gegend von 5,5 und ist stabil zwischen einem pH von 5 und einem pH von 9 während 60-minütiger Behandlung bei 37°C.

(4) Optimale Temperatur und thermische Stabilität:

Besitzt eine optimale Temperatur in der Gegend von 50⁰C und ist bis zu 55°C während 10-minütiger Behandlung bei einem pH von 7,0 stabil.

(5) Molekulargewicht: ungefähr 83.000 (GeIfiltrationsmethode).

(6) Isoelektrischer Punkt: 3,92^0,05.

(7) Beeinflussende Mittel: inhibiert durch Natriumazid, L-Ascorbinsäure, Dithiothreit und Kaliumcyanid.

(8) Sichtbares Absorptionsspektrum: Besitzt ein Absorptionsmaximum in der Gegend von 610 nm. (9) Zuckergehalt: enthält ungefähr 4,5 % Zucker. (10) Kupfergehalt: enthält 4 Mol Kupfer pro Mol.

2. Verfahren zur Herstellung der neuen Bilirubinoxidase M-1 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein neuer Bilirubinoxidase M-1 erzeugender Stamm, der zu dem Genus Trachyderma gehört, gezüchtet wird und die gebildete neue Bilirubinoxidase M-1 von der Kultur-

25 brühe abgetrennt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

daß der verwendete neue Bilirubinoxidase M-1 erzeugende Stamm zu dem Genus Trachyderma gg&ört der Stamm Trachyderma tsunodae K-2593 ist.

4. Reagenszubereitung für Bilirubin, dadurch gekennzeichnet, daß sie die neue Bilirubinoxidase M-1 gemäß An-

Spruch 1 enthält. 35

5. Zubereitung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Salz von Deoxycholinsäure enthält.

6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reagenszubereitung

für Bilirubin, welche die neue Bilirubinoxidase M-1 enthält, auf eine Bilirubin enthaltende Testlösung einwirken gelassen wird und eine dadurch veränderte Bilirubinveränderung kolorimetrisch gemessen wird. 10

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzte Zubereitung ein Salz von Deoxychinolinsäure enthält.

8. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bilirubin, dadurch gekennzeichnet, daß 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon und eine Reagenszubereitung für Bilirubin, welche die neue Bilirubinoxidase M-1 enthält, einer Bilirubin enthaltenden Testlösung zugesetzt werden, die gemischte Lösung zur Reaktion gebracht wird und nach einem Ansäuern der Reaktionslösung das Bilirubin quantitativ nach einer kolorimetrischen Methode bestimmt wird.

9. Verfahren zum Analysieren von anderen Komponenten als Bilirubin in einer Bilirubin enthaltenden Testlösung unter Anwendung einer Reaktion mit Oxidase, Peroxidase und einem Wasserstoff liefernden Homogen, bei welchem Bilirubin als Wirkstoff dient, dadurch gekennzeichnet, daß (a) eine Reagenszubereitung für Bilirubin, welche die neue Bilirubinoxidase M-1 enthält, auf die Testlösung einwirken gelassen wird, um die beeinflussende Wirkung des vorliegenden Bilirubins zu beseitigen und (b) die gewünschte Komponente in der zurückbleibenden

35 Testlösung analysiert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,

daß eine Wirksubstanz für die neue Bilirubinoxidase M-1 nach Beendigung der Stufe (a) zugesetzt wird, worauf die Stufe (b) durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung das Salz von Deoxychinolinsäure enthält.