DE69830556T2 - Verfahren zur Bestimmung von glykosylierten Proteinen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Messung der Menge glycosylierter Proteine in einer Probe mittels eines enzymatischen Verfahrens.
  • Glycosylierte Proteine (z.B. glycosyliertes Albumin) in Blut bestehen aus Glucose und Blutprotein (z.B. Albumin), die durch nicht enzymatische kovalente Bindungen gebunden sind. Aldehydgruppen von Glucose und Aminogruppen von Protein sind für die kovalenten Bindungen verantwortlich. Glycosyliertes Albumin oder desgleichen in Blut spiegelt das Blutzuckerniveau für eine bestimmte in der Vergangenheit liegende Periode wieder. Demnach wurde in jüngster Zeit der gemessene Wert von glycosyliertem Albumin als ein wichtiger Hinweis für Diagnose und Beobachtung von Bedingungen für Diabetes vermerkt.
  • Beispiele der Verfahren zur Messung der Menge glycosylierter Proteine umfassen ein leistungsstarkes Flüssigkeitschromatographie(HPLC)-Verfahren, einen Immuntest, ein chemisches Verfahren (NBT-Test), farbstoffbindende Verfahren, enzymatische Verfahren, und dergleichen. Darüber hinaus, macht es das enzymatische Verfahren, das eine Amadori-Verbindung-Oxidoreduktase wie bspw. Fructosylaminosäureoxidase (FAOD) verwendet, möglich, die Menge glycosylierter Proteine exakter und spontaner zu messen als die anderen Verfahren.
  • Das Verfahren zur Messung der Menge glycosylierter Proteine unter Verwendung von FAOD wird wie folgt ausgeführt. Zunächst werden die glycosylierten Proteine mit Protease behandelt, um sie in Peptide oder Aminosäuren zu zerlegen, weil FAOD nur mit Schwierigkeit auf große Proteine oder lange Peptide wirkt. Dann werden die zerlegten Produkte mit FAOD behandelt.
  • So kann durch Messung der Menge von durch die Behandlung mit FAOD erzeugtem Wasserstoffperoxid mittels eines elektrischen Verfahrens oder eines enzymatischen Verfahrens die Konzentration von glycosyliertem Protein bestimmt werden.
  • Als enzymatisches Verfahren zur Messung von Wasserstoffperoxid gibt es bspw. ein Verfahren, in welchem Peroxidase (POD) und ein Substrat, welches bei Oxidation Farbe generiert bzw. erzeugt, verwendet werden, um den Grad der Farberzeugung des Substrats zu bestimmen.
  • In dem Verfahren zur Messung der Menge glycosylierter Proteine durch die enzymatische Methode besteht ein Problem darin, das selbst wenn die glycosylierten Proteine zuvor mit Protease behandelt wurden, kurze Peptide, die imstande sind, ein Substrat für eine Amadori-Verbindung-Oxidoreduktase zu sein, nicht ausreichend produziert werden können. Insbesondere wirkt Protease nur mit Schwierigkeit auf in Blut enthaltene glycosylierte Proteine. Um dieses Problem zu vermeiden, wurde ein Verbesserungsverfahren vorgeschlagen, in welchem glycosylierte Proteine mit Protease in der Gegenwart von POD vor der Behandlung mit der Oxidoreduktase behandelt werden (WO 96/34977). Gemäß dieses Verbesserungsverfahrens können die kurzen Peptide, die imstande sind, das oben erwähnte Substrat zu sein, effektiv produziert werden. Darüber hinaus ist es nicht klar, warum die glyco sylierten Proteine richtig zerlegt werden, wenn sie mit POD während der Behandlung mit Protease koexistieren.
  • Jedoch besitzt dieses Verbesserungsverfahren das folgende Problem. Da POD selbst ein glycosyliertes Protein ist und mit Protease zerlegt wird, um ein Substrat für die Oxidoreduktase zu bilden, sind die Ergebnisse des Verfahrens weniger verlässlich.
  • Es ist demnach eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Messung der Menge glycosylierter Proteine bereitzustellen, in welchem hoch verlässliche, gemessene Werte erhalten werden können.
  • Um das oben genannte Ziel zu erreichen, umfasst das Verfahren zur Messung der Menge glycosylierter Proteine der vorliegenden Erfindung die Schritte des Zerlegens glycosylierter Proteine in einer Probe mit Protease, Auslösen einer Redoxreaktion zwischen den zerlegten Produkten und einer Amadori-Verbindung-Oxidoreduktase, und Bestimmen der Redoxreaktion, um die Menge glycosylierter Proteine zu messen. In dem Verfahren wird die Zerlegung mit Protease in der Gegenwart von mindestens einer Substanz, die aus der Gruppe bestehend aus Metalloporphyrin, Cytochrom und Diaphorase ausgewählt ist, ausgeführt.
  • Mit anderen Worten wird gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durch Ausführen der Zerlegung der glycosylierten Proteine mit Protease in der Gegenwart von vorbestimmten Substanzen anstelle von POD, die Zerlegung des glycosylierten Proteins gefördert. Da diese Substanzen keine glycosylierten Proteine sind, selbst wenn sie einer Zerlegung mit Protease unterzogen werden, werden keine Substrate für die Amadori-Verbindung-Oxidoreduktase gebildet und demnach deren Redoxreaktion nicht beeinträchtigt.
  • In der vorliegenden Erfindung ist das Metalloporphyrin eine Chelatverbindung von Porphyrin und einem Metallion. Insbesondere ist es eine Chelatverbindung von Metallionen, wie bspw. Fe2+, Mg2+, Co2+, Mn2+, und dergleichen, und Porphyrin. Beispiele des Porphyrins umfassen Hämin und dergleichen. Beispiele für das Cytochrom umfassen Cytochrom a, Cytochrom b, Cytochrom c, und dergleichen. Die Diaphorase hat einen anderen Namen, Dihydropolyamiddehydrogenase. Diese drei Arten von Substanzen können einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehr von ihnen verwendet werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird wie folgt ausgeführt. Zum Beispiel wird die Redoxreaktion mit der Amadori-Verbindung-Oxidoreduktase gleichzeitig mit oder nach der Zerlegungsbehandlung durchgeführt. Danach wird die Menge Wasserstoffperoxid, die durch die Redoxreaktion gebildet wurde oder die Menge Sauerstoff, die bei der Redoxreaktion verbraucht wurde, gemessen und dadurch kann die Menge glycosylierter Proteine durch Verwendung einer Eichgleichung oder einer Eichkurve, etc., bestimmt werden. Das Verfahren zur Messung der Menge Wasserstoffperoxid oder der Menge Sauerstoff ist nicht besonders beschränkt, und jedes herkömmlich bekannte Verfahren kann verwendet werden. Ferner umfasst die Messung der Menge glycosylierter Proteine der vorliegenden Erfindung die Messung der Konzentration von glycosyliertem Protein.
  • In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es vorzuziehen, dass das glycosylierte Protein glycosyliertes Albumin und/oder glycosyliertes Globulin ist. Dies ist vorteilhaft, da diese glycosylierten Proteine Hinweissubstanzen für Diagnose oder Beobachtung von Diabetes ist.
  • 1 ist ein Schaubild, das das Verhältnis zwischen der Serumkonzentration und der Absorption bzw. dem Absorptionsvermögen zeigt, wenn Hämin in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • 2 ist ein Schaubild, das das Verhältnis zwischen der Serumkonzentration und dem Absorptionsvermögen zeigt, wenn Cytochrom c in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • 3 ist ein Schaubild, das das Verhältnis zwischen der Serumkonzentration und dem Absorptionsvermögen zeigt, wenn Diaphorase in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • Im weiteren wird nun die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst bspw. drei Schritte, d.h. einen ersten Schritt des Zerlegens glycosylierter Proteine mit Protease, einen zweiten Schritt des Auslösens einer Redoxreaktion zwischen den Protease behandelten Produkten und einer Amadori-Verbindung-Oxidoreduktase, und einen dritten Schritt des Bestimmens der oben genannten Redoxreaktion der Amadoriverbindung-Oxidoreduktase. Diese Schritte können separat ausgeführt werden. Jedoch, wie unten erwähnt, können der Schritt des Auslösens der Redoxreaktion und der Schritt des Bestimmens der Redoxreaktion gleichzeitig ausgeführt werden.
  • Glycosylierte Proteine, die bei der vorliegenden Erfindung analysiert werden sollen, sind nicht besonders beschränkt, und die Beispiele umfassen glycosyliertes Albumin, glycosyliertes Globulin, glycosyliertes Hämoglobin, glycosyliertes Kasein, und dergleichen. Darüber hinaus umfassen Beispielproben, die bei der vorliegenden Erfindung zu analysieren sind, Blut, Serum, Plasma, Milch, zusammengebrautes Essen wie Bohnenpaste, Sojaquelle (engl.: soy source) oder dergleichen.
  • Die Art der Protease, die für die Proteasebehandlung verwendet wird, ist nicht besonders beschränkt. Zum Beispiel können Protease K, Subtilisin, Trypsin und Aminopeptidase oder dergleichen verwendet werden. Darüber hinaus wird die Proteasebehandlung vorzugsweise in einer Pufferlösung durchgeführt. Die Bedingung wird in Übereinstimmung mit der Art der zu verwendenden Protease, der Art oder der Konzentration des glycosylierten Proteins, oder dergleichen adäquat entschieden. Zum Beispiel kann im Falle, wo Serum mit Protease K behandelt wird, die Proteasekonzentration in der Reaktionslösung 0,2 bis 1 Gew.%, die Serumkonzentration in der Reaktionslösung 1 bis 10 Vol.%, die Reaktionstemperatur 20 bis 50°C, die Reaktionszeit 50 bis 120 Minuten und pH 6 bis 9 sein. Auch die Art der Pufferlösung ist nicht besonders beschränkt und Beispiele umfassen Trishydrochloridsäurepufferlösung, EPPS-Pufferlösung, PIPES-Pufferlösung und dergleichen.
  • Darüber hinaus wird diese Proteasebehandlung in der Gegenwart von mindestens einer Substanz (Anmerkung des Übersetzers: "Substanz" fehlt im englischen Text), die aus der Gruppe bestehend aus Metalloporphyrin, Cytochrom und Diaphorase ausgewählt ist, ausgeführt. Die Konzentrationen dieser Substanzen in der Reaktionslösung sind in Übereinstimmung mit den Arten oder dergleichen adäquat bestimmt.
  • Die zerlegten Produkte, die durch die Proteasebehandlung erhalten wurden, werden einer Behandlung mit einer Amadori-Verbindung-Oxidoreduktase unterzogen. In dieser Behandlung katalysiert das Enzym die Reaktion die durch die folgende Formel (1) dargestellt wird, in welcher R1 Aldoserest von Zucker und R2 Protein, Peptid oder Aminosäurerest bezeichnet.
  • (Chemische Formel 1)
    • R1 – CO – CH2 – NH – R2 + O2 + H2O → R1 – CO – CHO + R2 – NH2 + H2O2
  • Die Amadori-Verbindung-Oxidoreduktase zum Katalysieren der oben genannten Reaktion kann bspw. ein Enzym, wie unten erwähnt, sein. FAOD wird bevorzugt verwendet und FAOD, wie in (6) beschrieben, wird noch bevorzugter verwendet.
    • (1) FAOD abgeleitet von Bakterien der Gattung Corynebacterium (JP-B 6-65300 und JP-B 5-33997)
    • (2) FAOD abgeleitet von Bakterien der Gattung Aspergillus (JP-A 3-155780)
    • (3) Ketoaminoxidase, abgeleitet von Bakterien der Gattung Corynebacterium, Fusarium, Acremonium oder Debraryomyces (JP-A 5-192193)
    • (4) Fructosylamindeglycase, abgeleitet von Bakterien der Gattung Candida (JP-A 6-46846)
    • (5) Alcyllysinase (J. Biol. Chem. Vol. 239, pp 3790–3796, 1964)
    • (6) FAOD beschrieben in JP-A 7-289253
  • Es ist bevorzugt, dass diese Behandlung in einer Pufferlösung ausgeführt wird. Die Behandlungsbedingung wird in Abhängigkeit von der Konzentration, usw., der oben erwähnten zerlegten Produkte entsprechend bestimmt. Auch ist der Typ der Pufferlösung nicht besonders beschränkt und Beispiele umfassen Trihydrochloridsäurepufferlösung, EPPS-Pufferlösung, PIPES-Pufferlösung und ähnliches.
  • Sodann wird die Redoxreaktion durch das oben genannte Enzym bestimmt. Im allgemeinen wird, da diese Reaktion in Gegenwart von Wasser und Sauerstoff ausgeführt wird, in dieser Reaktion Sauerstoff verbraucht und Wasserstoffperoxid, wie in der oben genannten chemischen Formel (1) gezeigt, produziert. Demgemäß kann die Redoxreaktion durch Messung der Konzentration von Wasserstoffperoxid oder der Konzentration von Sauerstoff bestimmt werden.
  • Beispiele des Verfahrens zur Bestimmung der Redoxreaktion durch Messen der Konzentration von Wasserstoffperoxid umfassen ein Verfahren, das Peroxidase (POD) und ein Substrat, das detektierbare Produkte produziert, verwendet. Beispiele solcher Substrate umfassen Substrate, die durch Oxidation Farbe erzeugen (nachstehend wird sich darauf als "eine farberzeugende Substanz" bezogen). Beispiele eines solchen Substrats umfassen Orthophenylendiamin (OPD, die Wellenlänge von absorbiertem Licht ist 492 nm), die Kombination von Trinders Reagenz und 4-Aminoantipyrin, DA-64, und dergleichen. Im Falle, wo diese farberzeugenden Substanzen verwendet werden, kann die Konzentration von Wasserstoffperoxid durch Messung der Lichtabsorption der Reaktionslösung mittels eines Spektrometers bestimmt werden. Zusätzlich kann die Konzentration von glycosyliertem Protein aus der Konzentration von Wasserstoffperoxid berechnet werden, wenn die Eichkurve oder Eichgleichung zuvor erstellt wird.
  • Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass die Behandlung mit POD in einer Pufferlösung unter normalen Bedingungen durchgeführt wird, wobei die POD-Konzentration in der Reaktionslösung 1 bis 10.000 U/l (Units/l) beträgt, die Konzentration der farberzeugenden Substanz 0,1 bis 5 mmol/l bei 20 bis 37°C für 1 bis 5 Minuten ist und der pH-Wert der Redoxreaktion 6 bis 9 ist. Die Art der Pufferlösung umfasst bspw. Trishydrochloridsäurepufferlösung, EPPS-Pufferlösung, PIPES-Pufferlösung und dergleichen.
  • In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können die oben erwähnten drei Schritte unabhängig voneinander ausgeführt werden. Jedoch kann, wo Wasserstoffperoxid mit POD bestimmt wird, die Redoxreaktion mit der Amadori-Verbindung und die Behandlung mit POD gleichzeitig ausgeführt werden.
  • Mit anderen Worten wird die Reaktion durch Zusetzen der Amadori-Verbindung-Oxidoreduktase, POD und der farberzeugenden Substanz in die Pufferlösung, die die Produkte, die mit Protease für eine konstante Dauer behandelt wurden, enthält, ausgeführt. Danach wird das Absorptionsvermögen bestimmt. Zusätzlich ist es auch möglich, die Behandlung mit Protease und die Redoxreaktion mit der oben erwähnten Oxidoreduktase gleichzeitig durchzuführen.
  • Die vorliegende Erfindung wird unten bzw. nachstehend im Wege von Beispielen erklärt. In den folgenden Beispielen wurde FLOD-S, das in JP-A 7-289253 beschrieben ist, als das FAOD verwendet. Die oben erwähnte FLOD-S ist Fructosylaminosäureoxidase, die entweder speziell auf Fructosyllysin oder Fructosyl-N'-Z-Lysin (FNZ) oder auf beide einwirkt und von Furasium oxysporum S-1F4 (FERM BP-5010) abgeleitet ist. Dieses FLOD-S wurde durch folgende Prozedur hergestellt.
  • Herstellung von FLOD-S
  • Furasium oxysporum S – 1F4: FERM B P-5010 wurde in ein 10L-Kulturmedium (pH 6,0), die 0,5% FZL, 1,0% Glucose, 0,1% Dinatriumphosphat, 0,1% Mononatriumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,01% Calciumchlorid und 0,2% Hefeextrakt enthält, geimpft, gerührt und in einem Gärungsgefäß bei einem Ventilationsvolumen von 2 L/min. bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min (Umdrehungen/Minute) und bei 28°C für 24 Std. gerührt und kultiviert. Die Kultur wurde durch Filtration gesammelt. Ein Teil des Mycelium (200 g) wurde in 0,1 M Trishydrochloridsäurepufferlösung (pH 8,5), die 2 mM DTT enthält, suspendiert und mit einer Dino-Mühle (engl.: Dino-Mill) gemahlen. Die gemahlene Lösung wurde bei 10.000 U/min. für 15 Minuten zentrifugiert. Die erhaltene Lösung wurde als rohe Enzymlösung (zellfreies Extrakt) definiert. Ammoniumsulfat wurde zu dieser rohen Enzymlösung bis 40% Sättigung zugegeben, gerührt und bei 12.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert. Amoniumsulfat wurde in die übersättigte Lösung bis 75% Sättigung zugegeben, gerührt und bei 12.000 U/min. für 10 Minuten zentrifugiert. Das Präzipitat wurde in 50 mM Trishydrochloridsäurepufferlösung (pH 8,5), die 2 mM DTT (hier im folgenden "Pufferlösung A") enthält, gelöst, und in die Pufferlösung A über Nacht dialysiert. Das Dialyseprodukt wurde an der DEAE-Sephacel-Säule absorbiert, die mit der Pufferlösung A ausbalanciert bzw. ins Gleichgewicht gebracht wurde, mit der Pufferlösung A gewaschen und dann mittels einem 0 bis 0,5 M Kaliumchlorid linearen Konzentrationsgradienten eluiert. Aktive Bruchteile wurden gesammelt und mit 55–75% Amoniumsulfatlösung fraktioniert, und mit Pufferlösung A über Nacht dialysiert. Amoniumsulfat wurde in das Dialysat bzw. das Dialyseprodukt bis 25% Sättigung zugegeben, auf die Phenyl-Toyopearlsäule, die mit der 25% gesättigtes Amoniumsulfid enthaltenden Pufferlösung A ausbalanciert worden war, absorbiert, mit der Pufferlösung gewaschen und dann bei linearem Konzentrationsgradienten von 25–0% Ammoniumsulfatlösung eluiert. Aktive Fraktionen bzw. Bruchteile wurden gesammelt, Ammoniumsulfat bis zu 40% Sättigung zugegeben und an der Butyl-Toyopearl-Säule, die mit der Pufferlösung A, die 40% Sättigung Ammoniumsulfat enthalten hat, ausbalanciert worden war, absorbiert, mit der Pufferlösung gewaschen und dann bei linearem Konzentrationsgradienten von 40–0% Aminosulfatlösung eluiert. Aktive Fraktionen wurden gesammelt, Ammoniumsulfat bis 80% Sättigung zugegeben, gerührt und bei 12.000 U/min. für 10 Minuten zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wurde in 0,1 M Pufferlösung A gelöst. Aktive Fraktionen wurde mittels Gelfiltrationschromatographie (Sephacryl S-200) von der Präzipitatlösung, die mit 0,1 M Kaliumchlorid enthaltender Pufferlösung ausbalanciert worden war, gesammelt und durch Ultrafiltration konzentriert. Gereinigtes Enzym (30 bis 60 Einheiten) wurden von dem Konzentrat durch die Behandlung mit einem Pharmacea FPLC-System erhalten. Diese Behandlung wurde unter Verwendung von Mono-Q-Säule ausgeführt und bei linearem Konzentrationsgradienten der Pufferlösung A, die 0–0,5 M Kaliumchlorid enthält, eluiert.
  • Beispiel 1
  • Wir behandelten Serum, das von gesunden menschlichen erwachsenen Testpersonen gesammelt wurde, mit Protease (hergestellt durch SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD. und vermarktet unter dem Markennamen SUMIZYME MP) bei 37°C für 2 Std. Die Serumkonzentrationen waren 0 (v/v)%, 1,25 (v/v)%, und 2,5 (v/v)%; die Häminkonzentration war 0,01 (w/v)%. Ferner verwendeten wir in diesem und anderen Beispielen als Pufferlösung 200 mmol/l Trishydrochloridsäurepufferlösung (pH 8,0). Ferner verwendeten wir, wenn nicht anders vermerkt, gereinigtes Wasser als Lösungsmittel.
  • Die Zusammensetzung der Reaktionslösung ist unten beschrieben
    Serumlösung 0,05 ml
    Pufferlösung 0,55 ml
    Hämin (hergestellt durch Sigma Chemical Co) 0,20 ml
    1% Proteaselösung (Lösungsmittel: Pufferlösung) 0,30 ml
    30 mmol/l Wasserstoffperoxidlösung 0,10 ml
  • Danach stellten wir eine Mischlösung von POD und einem farberzeugendem Substrat durch Lösen von 0,29 mmol/l farberzeugendem Substrat (DA-64 hergestellt durch Wako Pure Chemical Industries, LTD) und 29 KU/l POD in der Pufferlösung her. Dann führten wird die FAOD-Behandlung bei 25°C für 5 Minuten durch Zusetzen von 0,7 ml der Mischlösung und 0,10 ml der FAOD-Lösung (100 KU/l, Lösungsmittel: Pufferlösung) in die oben erwähnte Protease behandelten Produkte (Lösung) durch.
  • Dann maßen wir das Absorptionsvermögen der Reaktionslösung bei 726 nm mit einem Spektrometer. Der Graph von 1 zeigt die Resultate.
  • Wie von Graph der 1 gesehen werden kann, stieg die Absorption bzw. das Absorptionsvermögen an, als die Serumkonzentration gesteigert wurde.
  • Beispiel 2
  • Wir führten dieselbe Behandlung und Operation wie in Beispiel 1 durch, mit Ausnahme dessen, dass wir 0,5 (w/v)% Cytochrom c anstelle von Hämin verwendeten, und maßen das Absorptionsvermögen. Der Graph in 2 zeigt die Resultate.
  • Wie von Graph 2 von 2 gesehen werden kann, stieg das Absorptionsvermögen an als die Serumkonzentration erhöht wurde.
  • Beispiel 3
  • Wir führten dieselbe Behandlung und Operation wie in Beispiel 1 durch, mit der Ausnahme, dass wir zwei unterschiedliche Arten von Diaphorase verwendeten, d.h. 0,5 (w/v)% Diaphorase und 1,0 (w/v)% Diaphorase anstelle von Hämin und maßen das Absorptionsvermögen. Der Graph in 3 zeigt die Resultate.
  • Wie von dem Graph in 3 gesehen werden kann steigt das Absorptionsvermögen mit steigender Serumkonzentration an.

Claims (10)

  1. Verfahren zur Messung des Gehalts an glycosyliertem Protein in einer Probe, umfassend die Schritte des Spaltens von glycosylierten Proteinen in der Probe mit Protease, Bewirken einer Redoxreaktion zwischen den Spaltungsprodukten und einer Amadori-Verbindung Oxidoreduktase, und Bestimmen der Redoxreaktion, um so den Gehalt an glycosylierten Proteinen zu messen, wobei die Spaltung mit der Protease in der Gegenwart von mindestens einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Metalloporphyrin, Cytochrom und Diaphorase ausgeführt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Metalloporphyrin eine Chelat-Verbindung eines zweiwertigen Metallions und Porphyrin ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das zweiwertige Metallion mindestens eines gewählt aus der Gruppe bestehend aus Fe2+, Mg2+, Co2+ und Mn2+ ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Cytochrom mindestens eines gewählt aus der Gruppe bestehend aus Cytochrom a, Cytochrom b und Cytochrom c ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Redoxreaktion durch Messen des Gehalts an Wasserstoffperoxid, das durch die Redoxreaktion produziert wird, oder durch Messen des Gehalts an Sauerstoff, der bei der Redoxreaktion verbraucht wird, bestimmt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Messen des Gehalts an Wasserstoffperoxid Peroxidase und ein Substrat, das bei Oxidation eine Farbe generiert, verwendet.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Farbe generierende Substrat Orthophenylendiamin ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Behandlung mit Protease und die Reaktion der Amadori-Verbindung Oxidoreduktase gleichzeitig ausgeführt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Reaktion der Amadori-Verbindung Oxidoreduktase und die Reaktion von Peroxidase gleichzeitig ausgeführt werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Amadori-Verbindung Oxidoreduktase Fructosylaminosäureoxidase (FAOD) ist.
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