DE3034142C2

DE3034142C2 -

Info

Publication number: DE3034142C2
Application number: DE3034142A
Authority: DE
Inventors: Albert August Corning N.Y Us Luderer; Hugh Charles Horseheads N.Y. Us Mcdonald
Original assignee: Ciba Corning Diagnosys Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-09-13
Filing date: 1980-09-11
Publication date: 1990-02-01
Also published as: FR2464995B1; GB2060690B; CA1153308A; GB2060690A; JPS56102786A; JPH0223157B2; DE3034142A1; US4282315A; FR2464995A1

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung einer Virensubpopulation mit gesteigerter Empfindlichkeit für Wirtszellen. Die Ansprüche 2 bis 9 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens und die Ansprüche 10 bis 13 Verwendungen der nach obigem Verfahren hergestellten Virensubpopulation.

Von zunehmendem Interesse ist die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Viren und Wirtszellen, nicht nur wegen der Bedeutung bei infektiösen Erkrankungen, sondern auch für die genetische Forschung, Studien des Zellmetabolismus, in der Immunologie usw. Die Empfänglichkeit für bestimmte Virenarten kann eine frühere Infektion oder die Anfälligkeit für Infektionen bedeuten. Es fehlen aber bislang wirksame Mittel zur qualitativen und quantitativen Untersuchung der Rezeptoren tragenden Zellen.

Baird u. a., Int. J. Cancer, Bd. 19, S. 403-417 (1977), berichten Bindungsuntersuchungen eines radioaktiven Virenliganden aus ganzen leukämogenen Zellen und Thymuslymphomazellen von Mäusen. Die Bindung des Radioliganden mit den vermutlich rezeptorpositiven Zellen war aber gering (etwa 10%), während große Mengen des Radioliganden erforderlich waren, <100 000 cpm. Dies ist sehr verschieden von Radioimmunanalysen auf antigener Grundlage, in denen die Aktivität oder Empfindlichkeit der Ligandenbindung erheblich größer.

Fowler u. a., J. Virol. Bd. 24, S. 729-735 (1977), berichten Untersuchungen von zellbindenden Liganden aus radioaktiv gekennzeichneten Oberflächen-Glycoproteinen von Leukämiezellen von Mäusen. Hierbei wurde nur ein Teil (15-40%) des antigen-kompetenten, radioaktiv markierten Glycoproteins an die empfänglichen Zellwände der Mäuse gebunden.

Es war somit bisher nicht möglich, einen wirksamen, zellbindenden Virenliganden herzustellen, der als antigener Stoff und zur qualitativen und quantitativen Analyse von Zellrezeptoren brauchbar ist.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung ganzzelliger Virensubpopulationen zu schaffen, die nach Markierung ein brauchbares Mittel zur Untersuchung von Zellrezeptoren sind und gegebenenfalls auch als antigene Stoffe in bekannten, eine relative Bindung benötigenden Untersuchungsverfahren, z. B. Immunanalysen, verwendbar sind.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine Virenpopulation mit einem Trägerstoff, bestehend aus einem leblosen Substrat oder aus Zellen, Zellmembranen oder Zellteilen, oder aus chemisch modifizierten Zellen, Zellmembranen oder Zellteilen, welche Rezeptorstellen für das zellbindende Protein der Viren aufweisen, in Kontakt gebracht wird, wobei die Rezeptorstellen die Rezeptorstellen der Wirtszellen nachahmen, wenigstens ein Teil der Virenpopulation mit dem Trägerstoff komplex gebunden wird, die nicht komplex gebundenen Viren entfernt werden, die Komplexe dissoziiert und die komplexgebundenen Viren von dem Trägerstoff als Subpopulation gesammelt werden.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß eine angereicherte Virensubpopulation mit guter Empfindlichkeit für komplementäre Zellrezeptoren durch Verwendung eines - vorzugsweise immobilisierten - Proteins, oder Zellen oder Zellderivaten herstellbar ist.

Die letzteren haben Rezeptorstellen, welche komplementär den Bindungsproteinen der Zellmembran sind, die normalerweise an der Umsetzung mit dem Virus teilnehmen. Die Viren werden z. B. mit einem immobilisierten Substrat in Kontakt gebracht, gehen eine Komplexbildung ein, und werden wieder abgelöst. Während der Komplex noch besteht, werden nicht komplexgebundene Teile abgewaschen. Diese Teile können ausgezeichnete antigene Eigenschaften aufweisen. Die hauptsächliche Bindungsaktivität der Zellrezeptoren befindet sich aber in dem komplex gebundenen Teil.

Die Ablösung der Viren kann, je nach der Virenart und dem Substrat, auf verschiedene Weise erfolgen, so z. B. mit Säuren, Basen, durch Temperatureinwirkung usw.

Vorzugsweise wird die angereicherte Virensubpopulation vor Verwendung in einen radioaktiv oder in anderer Weise markierten Liganden umgewandelt.

Die Zeichnungen vergleichen die Gelprofile ganzer, jodisierter auf verschiedene Weise gereinigter Sendaiviren.

In der Fig. 1 wurden diese biochemisch gereinigt. In der Fig. 2 wurden sie durch Adsorption und Elution von immobilisiertem Fetuin gereinigt.

Die Virenproteine sind mit NP als Hämagglutinin-Neuraminidase, (F-1) Fusionsfaktor, M als Membranprotein bezeichnet.

Die in der Forschung verwendeten Viren werden entweder im Labor selbst gezüchtet oder fertig bezogen. Trotz hoher antigener Eigenschaften haben sie meistenteils nur geringe Empfindlichkeit für Wirtszellenrezeptoren. Das folgende Beispiel 1 belegt diesen Umstand.

Beispiel 1

Mit ultraviolettem Licht inaktivierte Sendaiviren wurden entweder durch Tablettierung in einer gekühlten Zentrifuge bei 38 000 · g während 90 Minuten, oder durch Chromatographie mit Sepharose 4B gereinigt. Die Gelfiltrierung der Viren wurde bei 4°C in einer 50 · 1 cm messenden Säule mit Sepharose 4B, äquilibriert mit Phosphat gepufferter Salzlösung, pH 7,3 durchgeführt. Abschnitte wurden durch Adsorption bei 280 nm geprüft. Die Sendaiviren wurden nach dem üblichen Chloramin-T- Lactoperoxidaseverfahren und Trennung von nicht umgesetztem I¹²⁵ durch Filterdurchlauf durch eine Sepharose-4B-Säule radioaktiv markiert.

Bei Verwendung eines immobilisierten Substrats wurde das Produkt mit einem Arylaminderivat eines Glases geregelter Porengröße immobilisiert, vgl. hierzu Westall u. a., Methods in Enzymology, 34B, Academic Press, New York (1974).

Die Bindung des Radioliganden wurde in folgender Weise bestimmt. Der Ligand wurde an die Zellen oder immobilisierten Antiseren (IMA) in RPMI 1640 mit 0,5% BSA (Rinderserumeiweiß) gebunden. Zuvor im Puffer gewaschene Zellen oder immobilisierte Antiseren (IMA) wurden in 11 × 1 cm messende Plastikröhren gegeben und mit Puffer auf ein Gesamtvolumen von 0,9 ml gebracht. Sodann wurden 0,1 ml des zuvor im Puffer verdünnten Liganden, enthaltend 10 000-100 000 Zähleinheiten, zugesetzt, bei 4°C inkubiert und mit 2000 × g während 10 Minuten zentrifugiert. Nach Abgießen der überstehenden Flüssigkeit wurden die Tabletten in einem 3000 Gamma-Szintillations-Spektrolphotometer gezählt. Tabelle I zeigt die Ergebnisse.

Tabelle I

Eine Kultur der Zellwände CCL-119 wurde bei 36°C in 5% CO₂ angesetzt, im Durchlauf durch RPMI-1640 und 20% Kalbsembryoserum mit Glutamin- und Gentamycinzusatz. Die Zellen wurden von erneuter Suspension zur Bindungsprüfung zweimal im Puffer gewaschen.

Rote Schafsblutzellen und CCL-119 sind für Sendaiviren rezeptorpositiv, aber die Viren zeigen nur sehr geringe Empfindlichkeit für die Zellrezeptoren, was mit den oben erläuterten früheren Studien übereinstimmt. Dagegen sind sie stark antigen, wie ein Vergleich der Bindung mit Anti-Sendaivirusserum gegenüber normalem Kaninchenserum zeigt.

Obgleich der vorstehende Versuch nur eine Virenart behandelt, lassen sich ähnliche Ergebnisse durch gleiche Versuche mit ebenso verfügbaren Virenpopulationen und komplementären Rezeptorzellen Normalserum und Antiserum erzielen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß eine Virensubpopulation mit im Vergleich zur Gesamtpopulation erheblich gesteigerter Zellrezeptoren-Bindungsaktivität erhalten wird, wenn die Viren mit einem vorzugsweise immobilisierten leblosen Substrat oder Zellen oder Zellderivaten komplexgebunden werden, welche die Rezeptorstellen der Viren nachahmende Stellen haben. Es besteht ein Viren-Zellenkomplex (Komplex im Sinne einer Bindung oder Verkettung mit dem Substrat, welche die Viren durch Wechselwirkung der zellbindenden Stellen der Virenhülle mit der oben den Rezeptorstelle(n) bei der Inkubation und folgenden Pufferwäsche am Substrat hält, sei es durch kovalente Bindung, physikalische Anziehung, Ionenbindung usw., einzeln oder zusammen.

Das leblose Substrat ist ein Protein oder Glycoprotein mit geeigneten Rezeptorresten, die mit den Viren Komplexe bilden. Das Protein oder Glycoprotein kann direkt oder über eine oder mehrere abstandbildende Einheiten an einen unlöslichen Träger gekoppelt sein. Diese Rezeptorreste ahmen die Rezeptorstellen der Wirtszellen nach; für Sendai trifft dies z. B. auf Sialsäurereste zu.

Anstelle des leblosen Proteinsubstrats können Zellenderivate verwendet werden. Diese bestehen aus Rezeptorstellen aufweisenden Zellen, Zellmembranen, Zellteilen, gegebenenfalls in chemischer Mofifizierung, welche Rezeptorstellen für das zellbindende Protein der Viren enthalten. Das folgende Beispiel erläutert die Anreicherung von Sendaiviren für Rezeptorstellen der Wirtszellen.

Beispiel 2

Fetuin, ein Glycoprotein enthaltend N-Acetylneuraminsäure, wurde auf einem Arylamin- Glas geregelter Porengröße nach bekannter Aktivierungs- und Kopplungsmethode im Verhältnis 25 mg Fetuin pro 100 mg Glas immobilisiert, und im Verhältnis 20 mg Glas/ml in phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert. Zur Entfernung locker anhaftender Proteine wurden ½ ml dieser Suspension in 0,5% BSA enthaltender RPMI 1640 bei 37°C 30 Minuten inkubiert und sodann mit 2 ml des gleichen Puffers gewaschen. Etwa 0,5 ml des mit ultravioletten Strahlen inaktivierten Virus (entsprechend etwa 5000-15 000 Hämagglutinationseinheiten Virusaktivität wurden dem immobilisierten Fetuin zugesetzt und bei 4°C in dem RPMI 1640 Medium (1,5% BSA) inkubiert. Anschließend wurde der Glas-Fetuinviruskomplex in 4°C kaltem RPMI Medium (ohne BSA) gewaschen und in einem kleineren Anteil des gleichen Mediums erneut suspendiert. Die Temperatur wurde auf 37°C erhöht und 30 Minuten gehalten. Nach dem Zentrifugieren wurde die den gereinigten Virus enthaltende überstehende Flüssigkeit bei 4°C gelagert.

Nach dem üblichen Chloramin-T-Verfahren (s. Hunter u. a., Nature, 194, 495 (1962)) wurde mit I¹²⁵ und dem gereinigten Virus ein radioaktiver Ligand hergestellt. Dabei wurde wie im Beispiel 1 nicht umgesetztes I¹²⁵ entfernt, bei 4°C gelagert und vor Gebrauch auf Sepharose 4B rechromatographiert.

In ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 wurden die Ergebnisse der Tabelle II erhalten.

Tabelle II

Zur Bestätigung der überwiegenden Bindung der Sendaiviren durch Sialsäure-Rezeptoren wurde SRBC mit Neuraminidase behandelt und sodann mit den rezeptorgereinigten Sendaiviren in Kontakt gebracht. Der Gesamtzählwert sank etwa auf die Höhe der unbesetzten Vergleichsprobe.

Beispiel 3

Zur Untersuchung der Spezifität der Bindungsumsetzungen unter Verwendung der Rezeptor-gereinigten Sendaiviren wurde im wesentlichen nach den Beispielen 1 und 2 vorgegangen, vor Zusatz des Liganden jedoch der potentielle Hemmstoff jedoch mit den Zellen oder der IMA gemischt. Die prozentuale Verdrängung (%D) wurde nach der Formel berechnet

worin B die mit dem Hemmstoff gebundenen Zähleinheiten B _o die ohne Hemmstoff gebundenen Zähleinheiten, jeweils für eine unbesetzte Ablesung korrigiert, bezeichnen.

Tabelle III

Die kompetitiven Hemmungsversuche der Tabelle III zeigen, daß die Bindung der markierten Viren an immobilisierte Antikörper oder rote Blutkörper von Schafen durch kalte Sendai- Viren oder Viren-Antikörper, nicht aber durch Mäuseleukämieviren, T-2 Coliphagen oder normales Ziegenserum gehemmt wurde.

Die für die Wirtszellen-Rezeptorbindung angereicherte Virenpopulation hat ein von den biochemisch gereinigten Viren verschiedenes Gelprofil. Dieser Unterschied, mit Änderungen der proportionalen Mengen an Virenhüllenproteinen mag wenigstens teilweise die gesteigerte Zellenrezeptorempfindlichkeit erklären.

Beispiel 4

Zur Gelanalyse der Sendaiviren-Radioliganden wurden Sendaiviren durch Tablettierung bei 37 000 × RCF während 75 Minuten und/oder Chromatographie über Sepharose 4B biochemisch, sowie durch Adsorption und Elution von immobilisiertem Fetuin gereinigt. Die beiden Präparate wurden jodisiert und durch Polyacrylamidgel- Elektrophorese in 0,1% Natriumdodecylsulfatlösung (Fig. 1, 2) untersucht (vgl. hierzu Kaizel in Methods in Virology, Bd. 5, S. 179-246, 1971). Die Acrylamidkonzentration betrug 7,5%. Nach der Elektrophorese wurden die Gele gefärbt, entfärbt, gefroren, geschnitten und jeder Abschnitt nach Radioaktivität gezählt. Die Zeichnung zeigt die Ergebnisse. Beide Präparate enthalten die üblichen drei hauptsächlichen Membranproteine, (s. Scheid und Choppin, Virology, Bd. 57, S. 470-497, 1974), als Membranprotein (M, 38 000 MW), Fusionsfaktor (F-1, 51 000 MW), und Hämagglutinin-Neuraminidase (HN, 68 000 MW). Die Gele unterscheiden sich aber in zwei wichtigen Punkten:

1. das HN Protein überwiegt in dem Rezeptor-gereinigten Präparat, und
2. die höher molekularen Bereiche des Gels (Abschnitte 1-10) enthalten im Vergleich zu den anderen Spitzen sehr viel mehr Protein in dem biochemisch gereinigten Präparat als in dem rezeptorgereinigten Präparat.

Obwohl das Gelprofil je nach den Bedingungen der Elektrophorese, der Probenmarkierung und dem Reinheitsgrad der Viren schwanken kann, zeigen die Ergebnisse die komplexe Art des durch Rezeptorreinigung erhaltenen Liganden, der aus den in Sendaiviren zu erwartenden Hüllenproteinen zusammengesetzt ist. Den Zeichnungen kann ferner entnommen werden, daß Zellen wirksam bindender Sendaivirus-Radioligand ein Gelprofil mit einer herausstehenden HN-Spitze und weniger Protein als die anderen Spitzen im hochmolekularen Gelbereich aufweist.

Die durch die vorstehenden Beispiele belegten Grundsätze der Erfindung sind auf die verschiedensten Virenarten anwendbar, wenn ein Komplexbildungsmechanismus von Viren und Wirtszellen bekannt ist. In diesem Falle werden ein lebloses Substrat, Zellen oder Zellenderivate zur Nachahmung einer bindenden Einheit der Wirtszelle ausgewählt und zur Bereitung der angereicherten Virenpopulation verwendet; so wird z. B. immobilisiertes Conoanavalin A zur Komplexbildung mit Rinder- oder Mäuse- oder Ratten-Leukämieviren verwendet. Entsprechend können auch für die Rezeptorzellen über Sialsäure bindenden Virenarten, z. B. Influenza- oder Paramyxoviren, andere Substrate als Fetuin verwendet werden, nämlich im wesentlichen alle Sialsäure enthaltenden Proteine, Konjugate, Haptene, Analoge usw., wie z. B. submaxillare Mucine vom Rind, oder N-Acetylneuraminlactose. Das im Einzelfall am besten geeignete Substrat kann durch routinemäßige Versuche mit Markierungsmethoden ermittelt werden. Bevorzugt wird ein immobilisiertes Substrat, das aber nicht unbedingt Glas geregelter Porengröße sein muß. So kann z. B. Sepharose, Acrylamid oder ein Kunststoff zur Immobilisierung des komplementären Stoffes mit den nachahmenden Stellen verwendet werden.

Beispiel 5

Zur Erläuterung einer Anreicherung rezeptorhaltiger Zellen zeigt die Tabelle IV die Ergebnisse für den Fall der Behandlung von Sendaiviren. Diesen wurden durch Adsorption und Elution von CCL-119 Zellen gereinigt, jodisiert, und mit Zellen und immobilisierten Antikörpern umgesetzt. Die Bindungsqualität des Liganden ist ähnlich wie im Fall des mit Fetuin angereicherten Liganden der Tabelle II. Die Cytoreinigung kann mit rezeptorhaltigen Zellen, Zellmembranen, Zellteilen, oder solchen in chemisch modifizierter Form, mit den geeigneten aktiven Rezeptoren vorgenommen werden. Die zur Komplexbildung und Freigabe benötigten Verfahrensbedingungen sind im Einzelfall verschieden, aber routinemäßig zu finden. Die Cytoreinigung ist besonders wichtig für Liganden mit Viren, mit Rezeptoren unbekannter chemischer Natur, oder Viren, für die kein lebloses Substrat bereitet werden kann.

Tabelle IV

Die zur Ablösung der angereicherten Virenpopulation vom Substrat benötigten Mittel richten sich im Einzelfall nach dem Mechanismus der Komplexbildung. Mehrere Methoden sind denkbar. So kann im Falle des aus Sendaiviren und Sialsäure-Proteinrezeptoren bestehenden Komplexes statt einer Temperaturänderung eine Elution mit kompetitiven, Sialsäure enthaltenden Stoffen (Haptenen, Derivaten oder sogar Analogen) in Betracht kommen. Auch andere, in Immunanalyseverfahren übliche Methoden, z. B. pH, dissoziierende Mittel wie hohe Salz- oder Ionenkonzentrationen, und dergleichen, können in Betracht kommen.

Der angereicherte Virenligand muß nicht radioaktiv sein und kann auch in anderer Weise markiert werden, z. B. enzymatisch oder fluoreszent. Andere radioaktive Kennzeichen als I¹²⁵ sind ebenfalls verwendbar.

Der markierte Virenligand kann für kompetitive Bindungsverfahren wie z. B. als Antigen in Immunanalysen, oder quantitative Verfahren für rezeptorpositive Zellen, Gewebe, Glycoproteine, Körperflüssigkeiten, Ausscheidungsstoffe des Körpers usw., oder für die Untersuchung der Antigenbindung verwendet werden. So kann z. B. der radioaktiv markierte Sendaivirus zur quantitativen Analyse von Sialsäurerezeptoren, zur Unterscheidung von Glycolylneuraminsäure und Acetylneuraminsäure enthaltenden Proteinen verwendet werden, usf.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eine Virensubpopulation mit gesteigerter Empfindlichkeit für Wirtszellen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Virenpopulation mit einem Trägerstoff, bestehend aus einem leblosen Substrat oder aus Zellen, Zellmembranen oder Zellteilen, oder aus chemisch modifizierten Zellen, Zellmembranen oder Zellteilen, welche Rezeptorstellen für das zellbindende Protein der Viren aufweisen, in Kontakt gebracht wird, wobei die Rezeptorstellen die Rezeptorstellen der Wirtszellen nachahmen, wenigstens ein Teil der Virenpopulation mit dem Trägerstoff komplex gebunden wird, die nicht komplex gebundenen Viren entfernt werden, die Komplexe dissoziiert und die komplexgebundenen Viren von dem Trägerstoff als Subpopulation gesammelt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerstoff immobilisiert eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Viren über Sialsäureteile des Trägerstoffs komplexgebunden werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Viren Influenza- oder Paramyxoviren eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Viren Sendai-Viren eingesetzt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägerstoff ein Protein oder Glycoprotein eingesetzt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex durch Temperaturänderung dissoziiert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Virensubpopulation markiert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Virensubpopulation radioaktiv, enzymatisch oder fluoreszierend markiert wird.

10. Verwendung nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-9 hergestellten Virensubpopulation in biologischen Komplementärbindungsverfahren, bei welchen ganzzellige Viren mit einem Komplementärstoff komplex gebunden werden.

11. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 und 9 hergestellten markierten Virensubpopulation in qualitativen oder quantitativen, die kompetitive Bindung ausnützenden Analysen.

12. Verwendung der nach dem Verfahren der Ansprüche 8 und 9 hergestellten markierten Subpopulation, insbesondere radioaktiv markierter Sendai-Viren, als Antigen im Radioimmuntest, in der Antikörperbindungsanalyse oder als Radioligand zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung von Zellen, Gewebe, Glycoproteinen, Körperflüssigkeiten oder -ausscheidungsprodukten, welche Sialsäurerezeptoren, einschließlich Acetylneuraminsäure, enthalten.

13. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 und 9 hergestellten markierten Virensubpopulation, insbesondere radioaktiv markierter Sendai-Viren, zur Unterscheidung von Glycolylneuraminsäure enthaltenden Proteinen und Acetylneuraminsäure enthaltenden Proteinen.