FR2464995A1 - Procede de preparation d'une sous-population virale ayant une sensibilite accrue envers des cellules-hotes du virus et applications de cette sous-population - Google Patents
Procede de preparation d'une sous-population virale ayant une sensibilite accrue envers des cellules-hotes du virus et applications de cette sous-population Download PDFInfo
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Abstract
L'INVENTION SE RAPPORTE A LA BIOCHIMIE. ELLE CONCERNE UN PROCEDE SELON LEQUEL ON MET EN CONTACT UNE POPULATION VIRALE AVEC UNE SUBSTANCE SUPPORT POUVANT ETRE UN SUBSTRAT INANIME, DES CELLULES, DES MEMBRANES CELLULAIRES OU DES PARTIES DE CELLULES, OU ENCORE DES CELLULES, MEMBRANES OU PARTIES DE CELLULES MODIFIEES CHIMIQUEMENT, CETTE SUBSTANCE SUPPORT CONTENANT DES FRAGMENTS QUI IMITENT DES SITES RECEPTEURS DE LA CELLULE-HOTE POUR LA PROTEINE DE FIXATION DES VIRUS, ON COMPLEXE AU MOINS UNE PARTIE DE LA POPULATION VIRALE AVEC LA SUBSTANCE SUPPORT, ON ELIMINE LES VIRUS NON COMPLEXES, ON DISSOCIE LE COMPLEXE, ET ON RECUPERE A PARTIR DU SUBSTRAT LES VIRUS COMPLEXES EN TANT QUE SOUS-POPULATION. UTILISATION NOTAMMENT A DES FINS D'ANALYSE BIOLOGIQUE.
Description
L'invention concerne un procédé de pré-
paration d'une sous-population virale ayant une
sensibilité accrue envers des cellules-hôtes du vi-
rus et applications de cette sous-population.
Baird et al., Int. J0 Cancer, 19, 403 à 417 (1977) ont décrit des essais de fixation
d'un radiocoordinat viral préparé à partir de vi-
rus leucémogène entier de souris, avec des cellu-e
les lymphomateuses de thymus de souris. Le pourcen-
tage de liaison entre le radiocoordinat et les
cellules positives présumées réceptrices était fai-
ble (environ 10 %) et la quantité de radiocoordi-
nat ajoutée pour obtenir une absorption notable
était grande (plus de 100 000 coups par minute).
Ce type de résultat obtenu dans une étude de liai-
son entre radiocoordinat viral entier et cellule
réceptrice est très différent de ce que l'on ob-
tient en utilisant un virus marqué dans des métho-
des radio-immunologiques basées sur l'antigénie, cas o l'activité ou la sensibilité de fixation de
coordinat est généralement plus grande.
De façon similaire à l'étude de la cel-
lule réceptrice de virus entier, Fowler et al.,
J. Virol., 24, 729 à 755 (1977) ont décrit des étu-
des utilisant comme coordinat de liaison à la cel-
lule une glycoprotéine superficielle radiomarquée
de virus de leucémie de la souris. Une partie seu-
lement (15 à 40 %) de la glycoprotéine radiomar-
quée antigéniquement compétente était liée à des
lignes cellulaires susceptibles de la souris.
Ce qui précède indique qu'on n'est pas arrivé à préparer un coordinat radioviral efficace
de fixation à la cellule, qui ne serait pas seule-
ment une substance antigénique utile mais pourrait
aussi servir à déterminer qualitativement et quan-
titativement les récepteurs cellulaires.
L'invention a pour but de fournir des sous-populations virales à cellule entière qui, une fois marquées pour faciliter l'identification
et la mesure, puissent constituer un outil effi-
cace pour étudier les récepteurs de la membrane cellulaire. Un autre but est de fournir un procédé
de préparation de sous-populations virales à cel-
lule entière qui, une fois marquée pour faciliter l'identification et la mesure, puissent constituer un outil efficace pour étudier les récepteurs de
la membrane cellulaire.
Un autre but est de fournir des sous-
populations virales à cellule entière qui soient
utiles comme substances antigéniques dans des mé-
thodes (c'est-à-dire de fixation sélective) com-
plémentaires classiques, telles que les techni-
ques immunologiques.
En particulier, un but de l'invention
est de fournir des sous-populations virales à cel-
lule entière qui se fixent préférentiellement au récepteur du type acide sialique, typiquement à l'acide N- ou 0-acétylneuraminique, qui se trouve dans les globules rouges de l'homme et du mouton
et dans les globules blancs de beaucoup de mammi-
fères.
Un but préféré de l'invention est de fournir des sous-populations de virus grippal et de paramyxovirus, ou d'autres sous-populations de
virus, qui se fixent à des protéines superficiel-
les contenant de l'acide sialique, de préférence des sous-populations de virus de Sendai, que l'on
puisse marquer et utiliser alors pour étudier ef-
ficacement les récepteurs cellulaires du type acide sialique. D'autres buts de l'invention appara tront
à l'homme de l'art.
On a trouvé maintenant que l'on peut pré-
parer une sous-population virale enrichie carac-
térisée par une bonne sensibilité aux récepteurs cellulaires complémentaires, en utilisant une
protéine, de préférence immobilisée, ou des cel-
lules ou dérivés de cellules présentant des sites
récepteurs complémentaires de la ou des protéi-
nes de fixation de la membrane cellulaire qui par-
ticipe normalement à la réaction avec le virus.
Plus précisément, on met les virus en contact avec un substrat immobilisé avec lequel on peut complexer le virus, puis le libérer. Pendant que le complexe existe, on le lave pour éliminer la matière non complexée. Bien que la matière non complexée puisse avoir d'excellentes propriétés
antigéniques, on a trouvé que l'activité de fixa-
tion aux récepteurs cellulaires est contenue es-
sentiellement dans la partie complexée.
On peut utiliser divers moyens, selon
le virus et le substrat dont il s'agit, pour ef-
fectuer les étapes de complexation et de libéra-
tion. Par exemple, un acide, une base, la tempé-
rature, etc., isolément on conjointement, peuvent
se révéler utiles dans une situation donnée.
De préférence, on convertit la sous-po-
pulation virale enrichie en un radiocoordinat en
utilisant des procédés classiques, avant de l'uti-
liser.
Dans un mode de mise en oeuvre plus par-
ticulier, on enrichit le virus de Sendai en utili-
sant un substrat de protéine immobilisée contenant des fragments d'acide N-acétylneuraminique comme la fétuine. Les étapes de complexationlibération
sont liées à la température, ce qui fournit un mo-
yen facile de préparer la sous-population enrichie et de la séparer des particules indésirables. La
conversion du virus de Sendai enrichi en un radio-
coordinat constitue un outil efficace, sur le plan
des antigènes comme sur celui des récepteurs cel-
lulaires. Les figures montrent la comparaison des profils électrophorétiques sur gel d'un virus de Sendai entier iodé purifié biochimiquement (figu- re 1) et par adsorption sur la fétuine immobilisée et élution (figure 2). Les protéines virales sont
désignées par NP (nucléoprotéine), HN (hémagglu-
tinine-neutraminidase), F-I (facteur de fusion),
et M (protéine de membrane).
Pour diverses raisons, on étudie de plus
en plus les mécanismes mis en jeu dans les inter-
actions entre virus et cellule-h8te. Outre e do-
maine des maladies infectieuses causées par les virus, l'interaction virus-cellule a un immense intérgt dans les études génétiques générales, le métabolisme cellulaire, l'immunologie, etc. Une
réceptivité à certains types de virus peut indi-
quer une infection précédente, une sensibilité à l'infection, etc. Toutefois, pour faire progresser ce domaine de recherche en cours de développement, il faut des outils viraux efficaces permettant d'examiner qualitativement et quantitativement les
cellules porteuses de récepteurs.
Les populations virales utilisées dans
les laboratoires de recherche sont cultivées au la-
boratoire ou bien achetées à un fournisseur de cultures. De toute façon, tout en ayant de grandes propriétés antigéniques, la population virale a dans bien des cas une faible sensibilité envers les récepteurs de la cellule-h8te. Cela est illustré
par l'exemple suivant.
Exemple I
On purifie biochimiquement un virus de Sendai inactivié par les rayons ultraviolets,
fourni par Microbiological Associates, à Walkers-
ville, Maryland, E.U.A., en le granulant à 38 000 g pendant 90 minutes dans une centrifugeuse
RC-2B Sorvall réfrigérée (Ivan Sorvall Co., Nor-
wich, Connecticut, E.U.*Ao), ou par chromatographie sur "Sepharose 4B". On conduit la filtration du virus sur gel à 40 C en utilisant une colonne
(50 x 1 cm) de "Sepharose 4B" (Pharmacia Fine Che-
micals, Uppsala, Suède), équilibrée avec du so-
luté physiologique tamponné au phosphate à pH 7,3.
On contrôle les fractions par absorption à 280 nmo
Ensuite, on marque par 1125 en utilisant une mé-
thode usuelle à la chloramine-T ou à la lactoper-
oxydase en séparant '1,125 inaltéré par filtration sur une colonne de "Sepharose 4B" pour obtenir le
radiocoordinat de virus de Sendai.
Lorsqu'on utilise un substrat immobilisé, on conduit l'immobilisation en utilisant un dérivé d'arylamine de verre à pores réglés. Voir Weetall, H. H. et alo, Methods in Enzymology, 34B, Academic
Press, New York (1974) (Jakoby and Wilchek éd.).
On détermine la fixation du radiocoordi-
nat par la méthode suivante: on effectue la fixa-
tion du coordinat à des cellules ou à des anti-
sérums immobilisés (IMA) dans du RPKI 1640 (Grand Island Biological Co., Grand Island9 New York
E.U.A.) plus 0,5 % de BSA (albumine sérique bovine).
On introduit les cellules ou i'INA préalablement
lavé avec un tampon dans des tubes en matière plas-
tique (11 x 1 cm). On porte les échantillons à un volume total de 0,9 ml au moyen de tampon, puis on ajoute 0,1 ml de coordinat (préalablement dilué
dans du tampon) contenant 10 000 à 100 000 coups.
On fait incuber le mélange à 40C et on centrifuge les tubes à 2000 g pendant 10 minutes. Après avoir jeté le liquide surnageant, on compte les granules dans un spectrophotomètre à scintillation Packard, modèle "3000 Gamma". Les résultats sont indiqués
au Tableau Io
Tableau I
Fixation du virus de Sendai purifié biochimique-
ment et iodé sur des cellules et sur un anticorps immobilisé Echantillon Quantité Incubation Coups fixé: témoin SRBC SRBC témoin
CCL-119
témoin SRBC SRBC 108 cellules
107 "
2,5 x 106" ___
U 16
n 16 1 h, 1 h, 1 h, 4 0C 4 00 1 h, 4-0 1 h, 4 0 h, 4 0 h, 400 h, 4 0 % du total 9,6 % 8,5 %
12,2 %
6,7 % 7,4 % 6,7 %
11,5 %
8,8 % témoin
SV-IMA
NRS-IMA
1,25 mg(verre) 2,0 mg(verre) 1 h, 400 1 h, 4 C 1 h, 400 C ,0 % ,7 %
18,0 %
Abréviations:
SRBC: globules rouges de mouton.
COL-119: ligne cellulaire de leucémie lymphoblas-
tique aiguë (humaine).
SV-IUA: virus anti-Sendai de lapin immobilisé,
sur verre à porosité réglée.
NRS-IMA: sérum-normal de lapin immobilisé sur
verre à porosité réglée.
On cultive la ligne de cellules COL-119 à 36 0 dans une atmosphère à 5 % de 002 que l'on
maintient en faisant passer en série dans RPMI-
1640 plus 20 % de sérum foetal de veau, additionné de glutamine et de gentamycine (Schering Corp.,
Kenilworth, New Jersey, E.U.A.). On lave les cel-
lules à deux reprises dans du tampon d'essai avant de les remettre en suspension pour les études de fixation. Les globules rouges de mouton et le CCL-119 sont positifs en tant que récepteurs du virus Sendai, mais la population virale présente B 9
très peu de sensibilité envers les récepteurs cel-
lulaires. Cela concorde avec les études antérieures signalées plus haut. D'autre part, il existe une antigénie prononcée dans la population virale comme le montre la fixation sur le sérum anti-virus de Sendai de lapin, en comparaison du sérum normal de lapin. Dans l'expérience ci-dessus, on utilise un seul virus mais il semble que l'on obtiendrait
des résultats similaires avec le même type d'es-
sais en remplaçant ce virus par d'autres popula-
tions virales accessibles de façon similaire et en
utilisant d'autres cellules réceptrices complémen-
taîres, un autre sérum normal et un autre anti-sé-
rum, à la place des réactifs utilisés dans l'ex-
périence.
L'invention est basée sur cette décou-
verte que l'on obtient une sous-population ayant une activité notablement accrue de fixation aux
récepteurs cellulaires relativement à la popula-
tion virale d'origine, en complexant le virus avec un substrat inahumé, de préférence immobilisé, ou des cellules ou dérivés de cellules, présentant
des sites qui imitent les sites récepteurs cellu-
laires du virus dont il s'agit. On forme ainsi un complexe vir.us-cellule (on entend ici par complexe
toute liaison ou fixation au substrat qui main-
tient le virus sur le substrat par interaction du ou des sites de fixation de la coque du virus avec le ou les sites récepteurs du substrat, pendant l'incubation et ensuite le lavage au tampon. Il
peut s'agir d'uneLiaison covalente, d'une attrac-
tion physique, d'une liaison ionique, etc. ou de
combinaisons de celles-ci.
D'après ce qui précède, le substrat ina-
nimé est une protéine ou une glycoprotéine conte-
nant des résidus réactifs appropriés récepteurs,
24 64995
qui se complexent avec le virus, cette protéine ou glycoprotéine étant facultativement couplée à
un support insoluble, directement ou par l'inter-
médiaire d'un ou plusieurs fragments d'espacement.
Les résidus réactifs récepteurs sont ceux qui imi- tent les sites récepteurs de la cellule-hôte. Par exemple, dans le Sendai, il s'agit de résidus
d'acide sialique. -
De façon similaire, au lieu de la pro-
téine inanimée, on peut utiliser comme substrat,
pour effectuer l'enrichissement des cellules por-
teuses de récepteurs, des membranes cellulaires, des parties de cellules, ou bien des cellules,
membranes ou parties de cellules modifiées chimi-
quement, contenant toutes des sites récepteurs pour la protéine de fixation du virus. Les membranes et parties de cellules sont appelées ciaprès "dérivés de cellules"o L'exemple non limitatif suivant illustre l'enrichissement du virus de Sendai pour les sites
récepteurs de la cellule-h8te.
Exemple 2
On immobilise de la fétuine (Grand Is-
land Biological Co.) qui est une glycoprotéine contenant de l'acide Nacétylneuraminique sur un verre à porosité réglée traité par une arylamine, en utilisant des procédés classiques d'activation et de couplage, à raison de 25 mg de fétuine par mg de verre. On met en suspension la fétuine immobilisée dans du soluté physiologique tamponné au phosphate, à raison de 20 mg de verre/ml et pour les études de fixation, afin d'éliminer toute protéine faiblement rattachée, on fait incuber 1/2 ml de cette suspension dans un milieu RPKI
1640 contenant 0,5 % de BSA à 370 pendant 30 mi-
nutes, puis on lave dans 2 ml du même tampon. On ajoute à la fétuine immobilisée environ 0,5 ml du virus inactivé à l'ultraviolet (équivalent d'une activité virale d'environ 5000 à 15 000 unités d'hémagglutination) et on fait incuber à 40 C dans
le milieu RMPI 1640 (1,5 % BSA) pendant 45 minu-
tes. Ensuite, on lave le complexe verre-fétuine-
virus dans du milieu RPMI froid (400), ne contenant pas de BSA, puis on remet en suspension dans un
petit volume du même milieu. On élève la tempéra-
ture à 370 C et on l'y maintient pendant 30 minu-
tes. Apres centrifugation, on conserve à 40 C le liquide surnageant contenant le virus purifiée
On prépare un radiocoordinat en utili-
sant le virus purifié, à l'aide de 1125, par un procédé usuel à la chloramine T (voir Hunter et al., Nature, 194, 495 (1962). De nouveau, on élimine le I125 inaltéré comme indiqué plus haut. On peut
conserver à 4 0 le virus iodé et le chromatogra-
phier à nouveau sur "Sepharose 4B" avant l'usage.
En utilisant pratiquement le mime mode opératoire que dans l'exemple 1 mais en substituant
le virus purifié par le récepteur fétuine, on ob-
tient les résultats indiqués au Tableau IIo
Tableau II
Fixation du virus de Sendai purifié par récepteur
iodé sur des cellules et sur un anticorps immobi-
lisé Echantillon Quantité témoin HRBO 1 x 108 cellules SRBO 8 x 107 cellules SRWB 1,7 x 107 cellules COL-119 1,1 x O106 cellules NGS-IMA* 0,2 mg verre SV-IMA* 0,2 mg verre coups précipitables par TCA % des coups totaux du coordinat fixés à 4 0 et à 25 0 après 2 heures d'incubation c sQ
21 17,1
22 20,1
49,1 50,1
,3 36,6
28,0 32,7
19,9 22,9
88,5 86,6
91 --
Abréviations SRB, C001-119: voir Tableau I.
ERBC: globules rouges de cheval.
NGS-IMA:sérux de chèvre normal immobilisé (sur le mime verre à porosité réglée que l'on a utilisé précédemment). SV-IUA: anticorps anti-Sendai de chèvre immobilisé (sur le même verre que ci-dessus); l'anticorps est fourni par Microbiological Associates, Walkersville, Maryland, E.U.Ao TCA: acide trichloracétique; indique la quantité
maximale de marqueur radioactif qui peut 8tre préci-
pitée. * immobilisé sur le même verre à pores réglés que
celui utilisé précédemmemt.
Pour confirmer que la fixation du virus
de Sendai sur les cellules se produit principale-
ment par des récepteurs du type acide sialique, on traite du SRBO par la neuraminidase, puis on le met
en contact avec le virus Sendai purifié par récep-
teur. Le nombre total de coups fixés diminue à peu
près jusqu'au niveau du témoin.
Exemple 3
Cet exemple est donné pour examiner la spécificité de la réaction de fixation virus-cellule
en utilisant le virus de Sendai purifié par récep-
teur. Dans ces études de spécificité, on suit essen-
tiellement les modes opératoires décrits aux exem-
ples 1 et 2, si ce n'est que ' mélange l'inhibi-
teur potentiel aux cellules ou à l'IMA avant l'addi-
tion du coordinat. On calcule le pourcentage de dé-
placement (% D) par la formule: % D Bo - B x 100 Bo
dans laquelle B représente les coups fixés avec in-
* hibiteur et Bo les coups fixés sans inhibiteurs, les deux valeurs étant corrigées pour une lecture
de témoin.
ll
Tableau III
Déplacement de la fixation du virus de Sendai iodé à 20 C % Déplacement de Inhibiteur(a) (auantité SV-IM(b) SR$(c) Coliphage T-1 (57 ug) 1,8 l,O virus de la leucémie de la souris (12,9 >g) zl,0 <l,0 virus de Sendai (13, 7 ") 58,7 24,0 virus de Sendai (27,4 ig) 67,1 40,2 sérum de chèvre normal (0,4 pl) 41,0 1,0 antisérum de virus de Sendai (0,4)1) 14,3 54,1 (a) Coliphage T-2: bactériophage d'Escherichia - coli fourni par Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, E.UoAo Virus de la leucémie ds la souris, souche Rausoher,
fourni par Bionetics Laboratory Products, Kensing-
ton, Maryland, E.UoAo Virus de Sendai: inactivé à l'ultraviolet, fourni par Microbiologica1 Associates, Walkersville, Maryland, E.U.Ao
Antisérum de virus de Sendai: préparé sur la chè-
vre, fournti par Microbiological Associates, Wal-
kersville0, H:yland, E.U.Ao
(b) SV-IIML sérum anti-Sendai de chèvre immobi-
lisé, 0,2 mg verre, BoC0P corrigé, 29,506.
(b) SRB0 globules rouges de mouton, 8 x l07 glo-
bules, BCE? corrigé, 14,025 o Le Tableau III indique les résultats d'expériences d'inhibition compétitive conçues
pour examiner la spécificité de la réaction de fi-
xation virus-cellule. La fixation du virus marqué sur un anticorps immobilisé ou sur des globules
rouges de mouton est notablement inhibée par le vi-
rus de Sendai froid ou l'anticorps du virus mais non par le virus de la leucémie de la souris, le coliphage T-2 ou le sérum normal de chèvreo
La-population virale enrichie pour la fi-
xation aux récepteurs de la cellule-h8te a un pro-
fil de gel différent de celui du virus purifié bio-
chimiquement. On suppose que cette différence (qui comporte des modifications des proportions de pro-
téine d'enveloppe virale que l'on trouve) peut ex-
pliquer au moins partiellement l'accroissement de
la sensibilité aux récepteurs cellulaires.
Exemple-4
Analyse sur gel du radiocoordinat.de virus de Sendai On purifie biochimiquement du virus de Sendai (granulation à 37 000 g pendant 75 minutes et/ou par chromatographie sur "Sepharose 4B") et
par adsorption sur fétuine immobilisée et élution.
On iode les deux préparations et on les examine par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dans une solution à 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (figures 1 et 2 respectivement), voir Maizel, JoV., Jr. dans Methods in Virology, sous la direction de Ko Moramorosch et H. Koprowski, volume 5 pages 179 à 246, Academic Press, Inc., New York, 1971. La concentration d'acrylamide est de 7,5 % et après électrophorèse, on colore les gels, on les décolore, on les congèle, on les coupe en tranches et on
compte la radioactivité de chaque fraction. Les fi-
gures indiquent les résultats. Les deux prépara-
tions contiennent les trois principales protéines de membrane, désignées par convention (Scheid, A. et Choppin, P.W., Virology, 57, 470 à 495 (1974) sous les noms de protéine de membrane (M, poids moléculaire 38 000) , facteur de fusion (F-l, poids moléculaire 51 000) et hémagglutinineneuraminidase (HN, poids moléculaire 68 000). Toutefois, les gels
diffèrent sur deux points importants: (1) la pro-
téine HEN est notablement plus prépondérante dans la préparation purifiée par récepteur et (2) les zones de poids moléculaire élevé du gel (fractions 1 à
) contiennent beaucoup plus de protéine, rela-
tivement aux autres pics, dans la préparation purifiée biochimiquement que dans la préparation purifiée par récepteur. Bien que les profils de gel puissent
varier par suite des conditions électrophoréti-
ques exactes, du marquage des échantillons et du
degré de purification du virus, ces résultats mon-
trent que le coordinat radioviral obtenu par une étape de purification par récepteur est complexe
et se compose des protéines d'enveloppe indica-
tive de celles que l'on s'attendait à trouver dans le virus de Sendai. En outre, les profils de gel représentés par les figures suggèrent qu'un
radiocoordinat de virus de Sendai fixant effica-
cement des cellules présenterait un profil de gel comportant un pic HE prépondérant, et moins de
protéine relativement aux autres pics, dans la ré-
gion de poids moléculaire élevé du gel.
Pour en revenir à une description plus
générale de l'invention, on pense que les princi-
pes démontrés dans les exemples ci-dessus sont ap-
plicables à de nombreux types différents de virus,
une fois que l'on connaît un mécanisme de comple-
xation entre virus et cellule-h8te. On choisit alors un substrat inanimé, cellule ou dérivé de cellule, pour imiter un fragment de fixation de cellule-h8te, de manière à préparer la population virale enrichie, par exemple avec la concanavaline A immobilisée, on pourrait complexer et libérer le
virus de la leucémie bovine ou le virus de la leu-
cémie de la souris. De façon similaire, même avec
les virus qui sont connus comme se fixant aux cel-
lules réceptrices par des groupes d'acide siali-
que, qui comprennent les virus grippaux et les
paramyxovirus,il n'est pas nécessaire que la subs-
tance particulière utilisée pour le processus
d'enrichissement soit la fétuine. On pourrait uti-
liser pratiquement n'importe quelle protéine, con-
jugué, haptène, analogue, etc. contenant de l'acide sialique, par exemple la mucine submaxillaire bo-
vine et la N-acétylneuramine-lactose, pour effec-
tuer l'enrichissement du virus en pareil cas. Il
se peut que pour diverses raisons un substrat ina-
nimé théoriquement utilisable, cellule ou dérivé
de cellule, soit inutilisable, mais l'expérimen-
tation technique par l'homme de l'art utilisant
une technique de marquage peut déterminer l'utili-
té d'un substrat particulier. Il est préférable que le substrat soit immobilisé comme indiqué plus haut mais il n'est pas nécessaire d'utiliser le verre a porosité réglée donné comme exemple. Par
exemple, on peut utiliser le "Sepharose", l'acryl-
amide ou une matière plastique pour immobiliser la matière contenant des sites complémentaires, Exemple 5 Une variante de l'invention consiste à utiliser des cellules porteuses de récepteurs pour effectuer l'enrichissement. Le Tableau IV montre
le résultat obtenu lorsqu'on iode un virus de Sen-
dai purifié par adsorption sur des cellules C01-119
et élution et qu'on le fait réagir sur des cellu-
les et un anticorps immobilisé; la qualité de fi-
xation du coordinat est similaire à celle qu'in-
dique le Tableau II qui utilise un coordinat préa-
lablement enrichi au moyen de fétuine immobilisée.
On peut effectuer le processus de cytopurification avec toute cellule, membrane ou partie de cellule contenant des récepteurs, ou toute cellule, membrane
ou partie de cellule modifiée chimiquement, conte-
nant les récepteurs actifs appropriés. Les étapes exactes de complexation et de libération varieront pour les différents systèmes mais l'homme de l'art
pourra les déterminer. Le processus de cytopurifi-
cation serait une étape importante de la prépara-
tion de populations enrichies de coordinats viraux pour des virus dont on ignore la nature chimique du récepteur et pour les virus pour lesquels il
n'est pas possible de préparer un substrat inanimé.
Tableau IV
Fixation du virus de Sençai cytopurifié iodé à des cellules et à un anticorps immobilisé
0LO Echantillon Quantité % des coups to-
taux fixés à 4 0
après une incuba-
tion de 1 heure témoin 7,3 HRBB 1,5 x 108 7,9 SRBO 1,5 x 108 42,2 Col-ll9
SV-INA
1,7 x 107 2 mg verre NGS-IMA 2 mg verre coups précipitables par T0A 33,4. 57,4 17,9 63,5 Abréviations: voir Tableau IIo Les moyens particuliers qu'on utilise
pour libérer du substâat la population virale en-
richie varieront selon le mécanisme de complexa-
tiono On pourrait envisager plus d'une technique pour unl complexe particuliero Par exemple, mCme avec le compleze de virus de Sendai et de récepteur protéiné du type acide sialique, au lieu d'une vsariation de température, on pourrait envisager l'élution par des matières compétitives contenant
de l'acide sialique (haptène, dérivé ou m9me ana-
logue). On pourrait envisager d'autres méthodes courantes utilisées en immunologie, par exemple le pH, l'usage d'agents de dissociation tels que de fortes concentrations de sels ou d'ions, etc.,
ainsi que leurs combinaisons.
Le coordinat viral enrichi n'est pas né-
cessairement radioactif mais pourrait être marqué par d'autres moyens connus, par exemple au moyen d'enzymes et par fluorescence. Bien entendu, lorsqu'on utilise un marqueur radioactif, ce n'est pas nécessairement 1125.
On peut utiliser le coordinat viral mar-
qué dans n'importe.quel type de processus de fixa-
tion compétitive o l'on pourrait utiliser le coordinat viral entier, par exemple un antigène
dans des processus immunologiques. On peut effec-
tuer des processus quantitatifs pour des cellules
positives réceptrices, des tissus, des glycopro-
téines, des humeurs, des exsudats, etc. ou des étu-
des de fixation d'antigènes. Par exemple, on pour-
rait utiliser le virus de Sendai marqué par radio-
activité pour doser des récepteurs appropriés d.
type acide sialique, faire la différence entre les protéines contenant de l'acide glycolylneuraminique et de l'acide acétylneuraminique, etc.
Il va de soi que les modes de réalisa-
tion ne sont que des exemples et l'on pourrait les modifier notamment par substitution d'équivalents
techniques, sans sortir pour cela du cadre de l'in-
vention.
2I;64995
Claims (13)
1. Procédé de préparation d'une sous-
population virale ayant une sensibilité accrue vis-à-vis de cellulesh8tes du virus, caractérisé en ce qu'on met en contact une population virale
avec une-substance support pouvant 8tre un subs-
trat inanimé, des cellules, des membranes cellu-
laires ou des parties de cellules, ou encore des
cellules, membranes ou parties de cellules modi-
fiées chimiquement, cette substance support con-
tenant des fragments qui imitent des sites récep-
teurs de la cellule-h8te pour la protéine de fixa-
tion des virus, on complexe au moins une partie de la population virale avec la substance support, on élimine les virus non complexés, on dissocie le complexe, et on récupère à partir du substrat
les virus complexés en tant que sous-population.
2. Procédé selon la revendication 1, ca-
ractérisé en ce que la substance support est immo-
bilisée.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on complexe le virus et le substrat par des fragments acide sialique du substrat.
4. Procédé selon la revendication 3, ca-
ractérisé en ce que le virus est un virus grippal
ou un paramyxovirus.
5. Procédé selon la revendication 4, ca-
ractérisé en ce que le virus est le virus de Sendai.
6. Procédé selon la revendication 5, ca-
ractérisé ea ce que la substance support est une
protéine ou une glycoprotéine.
7. Procédé selon les revendications 1 à
6, caractérisé en ce que l'on dissocie le complexe
en modifiant la température.
8. Procédé selon les revendications 1 à
7, caractérisé en ce que l'on marque la sous-popula-
24z64995 tion.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le marquage est effectué par
radioactivité, par des enzymes ou par fluorescence.
10. Sous-population virale préparée par
un procédé selon l'une quelconque des revendica-
tions 1 à 9, caractérisée en ce qu'on l'emploie
dans un procédé biologique de fixation complémen-
taire dansequel on complexe un virus à cellule
entière avec un substrat complémentaire.
11. Sous-population virale marquée pré-
parée par un procédé selon l'une quelconque des
revendications 8 et 9, caractérisée en ce qu'on
l'emploie dans un processus qualitatif ou quantita-
tif de détermination de fixation compétitive.
12. Sous-population virale marquée prépa-
rée par un procédé selon l'une des revendications
8 et 9, spécialement sous-population de virus de Sendai marqué par radioactivité, caractérisée en ce qu'on l'emploie comme antigène dans un dosage radioimmunologique, dans une étude de fixation d'anticorps ou comme radiocoordinat pour détecter
et/ou-mesurer des cellules, tissus, glycoprotéi-
nes, humeurs ou exsudats contenant divers récep-
teurs du type acide sialique, parmi lesquels l'acide glycolylneuraminique.
13. Sous-population virale marquée pré-
parée par un procédé selon l'une quelconque des
revendications 8 et 9, spécialement sous-popula-
tion de virus de Sendai marqué par radioactivité,
caractérisée en ce qu'on l'emploie pour différen-
cier les protéines contenant de l'acide glycolyl-
neuraminique et les protéines contenant de l'acide acétylneuraminique.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/074,918 US4282315A (en) | 1979-09-13 | 1979-09-13 | Preparation of enriched whole virus radioligand |
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